周曉紅，陳潔冰，羅 智，陳帥江，彭潤(rùn)芝，刀 彤

(1. 湖南城市學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413000；2. 黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 益陽(yáng) 413000)

茶多糖是茶葉中存在的一種多糖類復(fù)合物，多為與蛋白質(zhì)結(jié)合的酸性糖蛋白[1].大量研究證明，茶多糖具有降血壓、降血糖、抗凝血、抗腫瘤、防輻射、抗血栓、增強(qiáng)人體免疫力、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等多重生物功效[2-4].茶多糖作為茶葉中一種重要的功能性成分，是茶葉品質(zhì)的重要保證，已有不少文獻(xiàn)研究了不同生產(chǎn)工藝和茶葉品種對(duì)茶多糖含量的影響.比如，黃浩[5]探討了“發(fā)花”過(guò)程中的主要生化成分和“發(fā)花”特征性微生物(冠突散囊菌)數(shù)量的變化，以及黑茶品質(zhì)的變化；劉丹奇等[6]研究了白茶多糖、綠茶多糖和紅茶多糖的成分及其降血糖的效果和機(jī)理.這些研究揭示了茶葉的原料、生產(chǎn)工藝和提取方法等都能影響茶多糖的含量與活性.

鑒于茶多糖眾多的保健價(jià)值，如何高效提取、分離和純化茶多糖已成為諸多領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[7-9].目前，已報(bào)道的茶多糖實(shí)驗(yàn)室提取方法主要包括醇沉法、水浸提法、活性酶輔助浸提法、微波輔助浸提法以及超聲波輔助浸提法[10-11].其中，活性酶輔助提取法可在常溫常壓條件下加速細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)層的分解，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有效成分的釋放，從而提高了茶多糖的提取率[12-13].

本研究以茉莉花茶為研究對(duì)象，利用冠突散囊菌發(fā)酵液制備了“金花”茉莉花茶，通過(guò)纖維素酶輔助提取茶葉中的茶多糖，探究纖維素酶輔助提取茶多糖的最佳工藝參數(shù)，為其酶解提取茶多糖的生產(chǎn)工藝提供參考.同時(shí)，對(duì)提取的茶多糖進(jìn)行抗氧化活性研究，以期用該方法對(duì)提取的茶多糖進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)儀器包括SHZ-B 雙功能水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇億通電子有限公司)；DT5-2B 低速臺(tái)式離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；101-1AB 電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵(上海予申儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000B(長(zhǎng)沙中天儀器設(shè)備有限公司)；XY-200 高速多功能粉碎機(jī)(浙江省永康市松青五金廠)；TP-214 電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；HS.Z68 電熱蒸餾水器(北京永光醫(yī)療設(shè)備有限公司)；QHX-4005SH-Ⅲ人工氣候箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；YXQ-100G 立式蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；722 型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司).

茉莉花茶來(lái)自廣西橫縣星光茶廠；冠突散囊菌菌種來(lái)自湖南城市學(xué)院黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；纖維素酶來(lái)自和氏璧生物科技有限公司；葡萄糖、苯酚、檸檬酸、檸檬酸鈉、無(wú)水乙醇等來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH 試劑來(lái)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；硫酸來(lái)自株洲市新工化玻有限責(zé)任公司.

1.2 冠突散囊菌發(fā)酵液的制備

參照文獻(xiàn)[14]中的方法，采用改良PDL 液體培養(yǎng)基制備冠突散囊菌發(fā)酵液.取200 g馬鈴薯，用適量蒸餾水煮沸20 min 后用3 層紗布將固體濾出；合并濾液，添加50 g 蔗糖，定容至1 000 mL；錐形瓶分裝滅菌，冷卻后置于超凈工作臺(tái)上接種冠突散囊菌，并在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，備用.

1.3 “金花”茉莉花茶的制備

取茉莉花茶100 g 置于500 mL 培養(yǎng)瓶中，保持充滿的狀態(tài)，加水使之含水量為30%；將培養(yǎng)瓶放入高壓滅菌鍋，在121 ℃下滅菌20 min；滅菌后在無(wú)菌室接種3 mL 冠突散囊菌發(fā)酵液，于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)7～10 d；待“金花”長(zhǎng)滿后取出，置于70 ℃烘箱干燥，備用.

1.4 茶多糖的提取

取干燥后的“金花”茉莉花茶，用破碎機(jī)破碎至過(guò)60 目篩；稱取粉碎后的茶樣1.000 0 g，按照液料比1∶25 加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，再加入纖維素酶，放入水浴恒溫振蕩器中酶解；酶解后置于121 ℃滅菌鍋加熱20 min 進(jìn)行滅活，離心并取上清液定容至25.0 mL，作為待測(cè)液測(cè)定“金花”茉莉花茶茶多糖的含量.

1.5 茶多糖含量的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[15]中的方法，精密稱取0.100 0 g在105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制成1 000.0 mL 濃度為0.100 0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL置于10 mL試管中，加蒸餾水補(bǔ)至1.00 mL；繼續(xù)添加1.00 mL 5%苯酚和5.00 mL 濃硫酸，搖勻，在陰暗環(huán)境下反應(yīng)20 min，經(jīng)490 nm 比色測(cè)定，獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線.

精密稱取1.000 0 g“金花”茉莉花茶，按液料比1∶25 加入pH 值為4.8 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，再加入纖維素酶，置于水浴鍋中靜置酶解一段時(shí)間；高溫滅酶，將溶液在離心機(jī)(轉(zhuǎn)速3 000 r/min、時(shí)間10 min)中離心，取上層清液定容至25.0 mL；取1.00 mL上清液加水稀釋至100.0 mL，用苯酚-硫酸法測(cè)定溶液在490 nm 下的吸光度，并根據(jù)此吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得對(duì)應(yīng)的茶多糖質(zhì)量m1.樣品的茶多糖含量計(jì)算公式為

其中，m1為樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的含糖量，mg；m2為樣品質(zhì)量，g；D為稀釋倍數(shù)；0.9 為粗多糖折算為茶多糖的換算系數(shù).

1.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了分別考察酶解時(shí)間、酶解溫度、酶添加量對(duì)“金花”茉莉花茶茶多糖提取效率的影響，選擇L9(33)正交因素水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，具體參數(shù)如表1 所示.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.7 測(cè)定茶多糖抗氧化活性

稱取干燥好的DPPH 試劑0.035 0 g，用無(wú)水乙醇溶解后定容至100 mL 的容量瓶；移取1.00 mL 上述溶液，定容至50 mL 容量瓶；多次上下顛倒搖勻，得濃度約為0.017 8 mmol/L 溶液；將制備好的DPPH 溶液倒入深色瓶，置于冰箱，冷藏備用.

移取2.00 mL 樣品置于試管中，加入2.00 mL DPPH 溶液搖勻，獲得樣品測(cè)定液；避光靜置30 min，于反應(yīng)結(jié)束后在517 nm 處測(cè)量獲得樣品測(cè)定液吸光度；以同體積蒸餾水代替樣品按相同操作測(cè)定空白對(duì)照組吸光度；以同體積無(wú)水乙醇代替DPPH 溶液，按相同操作測(cè)定樣品的本底吸光度.DPPH 清除率計(jì)算公式為

其中，A1為2.00 mL DPPH 溶液+2.00 mL 蒸餾水的對(duì)照組吸光度；A2為2.00 mL DPPH 溶液+2.00 mL 樣品的測(cè)定液吸光度；A3為2.00 mL 無(wú)水乙醇+2.00 mL 樣品的本底吸光度.

2 結(jié)果和討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.5 節(jié)中的測(cè)定方法，獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 茶多糖含量

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)茶多糖含量的影響

固定酶解溫度為50 ℃和酶添加量為2.5%，在不同的酶解時(shí)間下，所獲得的茶多糖含量曲線如圖2 所示.

圖2 酶解時(shí)間對(duì)茶多糖含量的影響

由圖2 可知，當(dāng)酶解時(shí)間＜120 min 時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加，“金花”茉莉花茶中的茶多糖含量逐漸增大；當(dāng)酶解120 min 時(shí)，茶多糖含量最大，為104.55 mg/g；當(dāng)酶解時(shí)間＞120 min 時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，茶多糖的提取率呈下降趨勢(shì).這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，酶的活性逐步降低，長(zhǎng)時(shí)間的浸提導(dǎo)致了大量雜質(zhì)溶出，茶多糖的析出就不再明顯.因此，最適合的酶解時(shí)間為120 min.

2.2.2 酶解溫度對(duì)茶多糖含量的影響

固定酶解時(shí)間為120 min 和酶添加量為2.5%，在不同的酶解溫度下，實(shí)驗(yàn)所得茶多糖含量曲線如圖3 所示.

圖3 酶解溫度對(duì)茶多糖含量的影響

由圖3 可知，當(dāng)酶解溫度＜50 ℃時(shí)，隨著酶解溫度的上升，“金花”茉莉花茶的茶多糖含量增加；當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，茶多糖含量最高，為97.59 mg/g；當(dāng)酶解溫度＞50 ℃時(shí)，茶多糖含量呈下降趨勢(shì).其原因是，當(dāng)酶解溫度＜50 ℃時(shí)，酶的活性隨溫度升高而增強(qiáng)；當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，酶達(dá)到了最佳活性，茶多糖含量最高；當(dāng)溫度＞50 ℃時(shí)，隨著溫度的進(jìn)一步上升，酶的分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其活性降低，影響反應(yīng)效率，導(dǎo)致茶多糖含量開(kāi)始下降.

2.2.3 酶添加量對(duì)茶多糖含量的影響

當(dāng)固定酶解時(shí)間為120 min 和酶解溫度為50 ℃時(shí)，不同的纖維素酶添加量對(duì)茶多糖提取率的影響效果如圖4 所示.

圖4 酶添加量對(duì)茶多糖含量的影響

由圖4 可知，當(dāng)酶添加量＜3%時(shí)，茶多糖含量隨酶添加量的增加呈上升趨勢(shì)；當(dāng)酶添加量為3%時(shí)，茶多糖含量最高，達(dá)94.15 mg/g；當(dāng)酶添加量＞3%時(shí)，茶多糖含量逐漸下降.其原因可能是，剛開(kāi)始纖維素酶量的增加，有利于反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致茶多糖含量增加；隨著酶添加量的繼續(xù)增加，底物濃度不能使酶達(dá)到飽和，致使酶的作用受到了抑制，導(dǎo)致茶多糖提取率下降[16].因此，最合適的酶添加量為3%.

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由表2 中極差R的大小可得出各因素對(duì)茶多糖含量的影響順序依次為：酶解時(shí)間＞酶添加量＞酶解溫度，最佳工藝條件為A2B2C2，即酶解時(shí)間120 min、酶解溫度50 ℃和酶添加量3%.在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得“金花”茉莉花茶的茶多糖含量為104.25 mg/g.

由表3 可知，因素A(酶解時(shí)間)對(duì)于茶多糖提取效率有顯著性影響(P≤0.05)；因素B(酶添加量)和因素C(酶解溫度)對(duì)茶多糖的提取效率影響不顯著(P＞0.10).這與表2中酶解時(shí)間對(duì)茶多糖提取效率影響最大的結(jié)果一致.

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差結(jié)果分析

2.4 茶多糖的抗氧化活性

DPPH 是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其孤對(duì)電子在517 nm 波長(zhǎng)附近有強(qiáng)吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)、吸收后消失或者減弱[17-18].對(duì)比檢測(cè)從普通茉莉花茶和“金花”茉莉花茶中提取的茶多糖對(duì)DPPH 試劑的自由基清除效果得出，從2 種茶中所提取的茶多糖對(duì)DPPH 自由基半數(shù)清除率分別為57.14%和61.97%.這說(shuō)明相對(duì)于未“發(fā)花”的茉莉花茶，從“金花”茉莉花茶中提取的茶多糖表現(xiàn)出了較好的抗氧化能力.

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)纖維素酶輔助提取“金花”茉莉花茶茶多糖的工藝研究，獲得了其最佳工藝條件：酶解時(shí)間120 min、酶解溫度50 ℃和酶添加量3%.在此條件下，從1.000 g“金花”茉莉花茶中提取的茶多糖為104.25 mg，相對(duì)文獻(xiàn)[10-11]所報(bào)道的方法有較高的提取效率.以相同實(shí)驗(yàn)方法從未發(fā)花的茉莉花茶中提取茶多糖并作為對(duì)照，利用DPPH的自由基清除法研究“金花”茉莉花茶中茶多糖的抗氧化活性，結(jié)果顯示從“金花”茉莉花茶中提取的茶多糖表現(xiàn)出了更好的抗氧化活性.綜上所述，對(duì)茉莉花茶采用“發(fā)花”技術(shù)，可以提高其茶多糖含量，若同時(shí)采用纖維素酶輔助提取法，控制好最佳工藝參數(shù)，就可獲得更高的茶多糖提取效率.但本文所提工藝得到的茶多糖是粗茶多糖，如果能進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行純化，有望對(duì)“金花”茉莉花茶中的茶多糖和真菌多糖進(jìn)行區(qū)分和鑒別，從而對(duì)深入研究茶多糖的保健功效產(chǎn)生積極作用.