趙丹，李茂光，毛琦琦，李亞南，陳蘇京，葉強(qiáng)

中國食品藥品檢定研究院國家衛(wèi)生健康委員會生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102629

b 型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae type b，Hib）是引起小兒呼吸道系統(tǒng)原發(fā)性感染和病毒性疾病時繼發(fā)感染的致病菌之一，可導(dǎo)致腦膜炎、肺炎、敗血癥、心包炎等多種侵襲性疾?。?-2］。目前預(yù)防Hib 感染的主要應(yīng)對措施是接種疫苗，隨著Hib疫苗使用的不斷擴(kuò)大，Hib 相關(guān)疾病獲得了較好的控制［3］。Hib 結(jié)合疫苗是由純化的Hib 莢膜多糖多聚磷酸核糖基核糖醇（polyribosylribitolphosphate，PRP）［4］與載體蛋白共價結(jié)合后經(jīng)純化而成的多糖蛋白結(jié)合疫苗。結(jié)合疫苗中的主要有效成分為多糖-蛋白結(jié)合物，游離多糖含量過高會顯著影響大分子結(jié)合物的免疫原性［5］。因此游離多糖含量是結(jié)合疫苗的一項(xiàng)重要質(zhì)量控制指標(biāo)［6］。

高效陰離子交換色譜-脈沖安培（high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）檢測方法的出現(xiàn)為糖類物質(zhì)的分離測定提供了簡單高效的手段，其具有靈敏度高、分離效果和重現(xiàn)性好、供試品不需衍生處理［7］等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為糖類化合物分析的首選方法之一［8］，在測定多糖含量方面得到越來越廣泛的應(yīng)用。目前《中國藥典》三部（2020 版）檢測Hib 結(jié)合疫苗游離多糖含量的方法為乙醇分步沉淀法，該方法操作繁瑣且要求較高；對于結(jié)合物濃度或游離多糖含量較低的樣品，可能因樣品游離多糖含量低于測定下限而導(dǎo)致一定的誤差［9］。本研究采用超速離心法將未結(jié)合的PRP 與結(jié)合的PRP 分離，提取上清中的游離多糖，在堿性條件下將多糖水解，采用CarboPacPA-10 4 mm × 250 mm 分析柱，氫氧化鈉-醋酸鈉溶液洗脫，經(jīng)脈沖安培檢測器檢測，同時對建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證，并初步將其應(yīng)用于Hib 結(jié)合疫苗的游離多糖含量測定。

1 材料與方法

1. 1 供試品及標(biāo)準(zhǔn)品 14 批Hib 結(jié)合疫苗（批號：1 ~ 14）為中國食品藥品檢定研究院留樣；Hib PRP國際標(biāo)準(zhǔn)品（批號：12 ／ 306）購自英國國家生物制品檢定所。

1. 2 主要試劑及儀器 50%氫氧化鈉購自美國Sigma 公司；三水醋酸鈉購自美國Thermo Fisher-Scientific 公司；DionexCarboPacPA-10 4 mm × 250 mm分析柱、DionexCarboPacPA-10 4 mm × 50 mm 保護(hù)柱購自美國 Thermo 公司；0. 22 μm 濾膜和 10 K 超濾膜購自美國PALL 公司；ICS-5000 色譜分析系統(tǒng)（脈沖安培檢測器、變色龍7. 0 工作站）購自美國Thermo 公司。

1. 3 溶液制備

1. 3. 1 水解液 取1. 5 mL 10 mol ／L 氫氧化鈉溶液加超純水定容至10 mL，備用。

1. 3. 2 洗脫液 取204.15 g 三水醋酸鈉，用1 500 mL超純水溶解后，經(jīng)0. 22 μm 濾膜過濾，脫氣后加入19. 5 mL 50%氫氧化鈉，備用。

1. 4 游離多糖的分離 取750 μL 供試品分別于409 700、498 500、596 100 × g 離心 30 min，取上清400 μL，即為游離多糖供試品溶液。分別檢測各離心力條件下游離多糖供試品溶液中的多糖含量及蛋白殘留量。

1. 5 供試品及定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1. 5. 1 PRP 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋 將Hib PRP 國際標(biāo)準(zhǔn)品用超純水稀釋至19.616 μg／mL，即為PRP 儲備液。再將PRP 儲備液用0. 9%氯化鈉溶液稀釋，獲得濃度為0. 77、1. 53、3. 06、6. 13、12. 26 μg ／mL 標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1. 5. 2 供試品稀釋 取100 μL 供試品，加入300 μL 0. 9%氯化鈉溶液混勻，即為多糖供試品溶液。

1. 5. 3 水解 取多糖供試品溶液、游離多糖供試品溶液及 Hib PRP 標(biāo)準(zhǔn)品各 400 μL，分別加入 100 μL水解液，室溫放置約16 h，水解結(jié)束后用10 K 超濾膜超濾，收集濾過液備用。

1. 6 色譜條件 分析柱：DionexCarboPacPA-10 4 mm×250 mm；保護(hù)柱：DionexCarboPacPA-10 4 mm×50 mm；洗脫液洗脫程序見表 1；流速：1. 2 mL ／ min；進(jìn)樣量：60 μL；柱溫：30 ℃。

表1 梯度洗脫程序Tab. 1 Program of gradient elution

1. 7 方法的驗(yàn)證

1. 7. 1 專屬性 按1.6 項(xiàng)色譜條件分別檢測PRP 標(biāo)準(zhǔn)品、多糖供試品溶液、游離多糖供試品溶液（批號均為14）、空白對照多糖含量。

1. 7. 2 線性 按1.6 項(xiàng)色譜條件檢測不同濃度（0.77、1. 53、3. 06、6. 13、12. 26 μg ／ mL）PRP 標(biāo)準(zhǔn)品工作液多糖含量。以PRP 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 7. 3 定量限 將 0. 77 μg ／ mL PRP 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至約2 ng ／ mL，按1. 6 項(xiàng)色譜條件檢測多糖含量，以信噪比10 ∶1 為定量限。

1. 7. 4 精密度

1. 7. 4. 1 重復(fù)性 按1. 6 項(xiàng)色譜條件重復(fù)檢測游離多糖供試品溶液（批號14）6 次，計算峰面積、游離多糖含量及塔板數(shù)的RSD。

1. 7. 4. 2 中間精密度 取2 批待測游離多糖供試品，按1. 6 項(xiàng)色譜條件在不同時間分3 次檢測游離多糖含量，計算RSD。

1. 7. 5 穩(wěn)定性 取游離多糖供試品溶液（批號14），按1. 6 項(xiàng)色譜條件在24 h 內(nèi)連續(xù)檢測20 次，計算峰面積、游離多糖含量及塔板數(shù)的RSD。

1. 7. 6 準(zhǔn)確度 取游離多糖供試品溶液（批號14），分別加入高、中、低（1.171 4、1.464 3 和 1.757 1 μg ／mL）3 個濃度的Hib PRP 多糖，按1. 4 項(xiàng)分離游離多糖，按1. 5. 3 項(xiàng)進(jìn)行供試品的水解，按1. 6 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測，計算游離多糖的平均加標(biāo)回收率均值及RSD。

1. 8 方法的初步應(yīng)用 用建立的方法測定13 批Hib結(jié)合疫苗游離多糖含量，同時與乙醇沉淀法檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2. 1 游離多糖分離條件選擇 不同離心力（409 700、498 500、596 100 × g）下，游離多糖供試品溶液中的游離多糖含量分別為8. 55%、7. 88%和5. 36%，蛋白含量分別為 8. 65、0 和 0 μg ／ mL。

2. 2 專屬性 PRP 標(biāo)準(zhǔn)品、多糖供試品溶液、游離多糖供試品溶液在相應(yīng)位置均出現(xiàn)明顯色譜峰，而空白對照無對應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，專屬性良好，見圖1。

2. 3 線性 標(biāo)準(zhǔn)品濃度在 0. 77 ~ 12. 26 μg ／ mL 范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2，離子色譜圖見圖2。

圖2 PRP 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜Fig. 2 Standard curve of PRP

表2 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab. 2 Linear regression equation and correlation coefficient

2. 4 定量限 該方法定量限為1. 875 ng ／ mL。

2. 5 精密度

2. 5. 1 重復(fù)性 游離多糖供試品溶液6 次檢測結(jié)果的峰面積、游離多糖含量及塔板數(shù)的RSD 分別為4. 09%、4. 00%和0. 77%，重復(fù)性良好。

2. 5. 2 中間精密度 2 批游離多糖供試品不同時間3 次檢測結(jié)果游離多糖含量的RSD 分別為2. 61%和2. 48%，精密性良好，見表3。

表3 精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab. 3 Verification for precision

2. 6 穩(wěn)定性 游離多糖供試品溶液24 h 內(nèi)20 次檢測結(jié)果的峰面積、游離多糖含量和塔板數(shù)的RSD 分別為4. 82%、4. 71%和2. 16%，穩(wěn)定性良好。

2. 7 準(zhǔn)確度 供試品溶液游離多糖的平均加標(biāo)回收率均值及RSD 分別為100. 26%和3. 96%，見表4。

表4 準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果Tab. 4 Verification for accuracy

2. 8 方法的初步應(yīng)用 兩種方法游離多糖含量檢測結(jié)果均 ＜20%，在《中國藥典》三部（2020 版）規(guī)定的合格范圍內(nèi)，見圖3。

圖3 兩種方法游離多糖含量檢測結(jié)果的比較Fig. 3 Comparison of free polysaccharide contents determined by two methods

3 討 論

目前，Hib 結(jié)合疫苗是國際公認(rèn)的最為有效的細(xì)菌性疫苗之一［10］，接種Hib 結(jié)合疫苗可有效降低Hib 侵襲性感染的風(fēng)險［11］，使機(jī)體產(chǎn)生有效的應(yīng)答和免疫保護(hù)。但疫苗中的游離多糖含量與其可產(chǎn)生的保護(hù)效果密切相關(guān)，結(jié)合疫苗中游離多糖含量過高會明顯影響大分子結(jié)合物的免疫原性，因此游離多糖含量的檢測是多糖蛋白結(jié)合疫苗純化工藝驗(yàn)證、結(jié)合物原液質(zhì)量控制和穩(wěn)定性研究的重要指標(biāo)［12］。目前游離多糖檢測方法有疏水色譜法、冷酚抽提法、乙醇分步沉淀法、高效液相色譜（HPLC）法等［13-15］。其中冷酚抽提法和乙醇分步沉淀法均是通過加入化學(xué)沉淀劑使結(jié)合多糖沉淀達(dá)到分離游離多糖的目的，但額外引入的化學(xué)沉淀劑會對色譜柱造成損傷，使其壽命縮短，甚至干擾測定。

本研究利用結(jié)合多糖與游離多糖分子大小、沉降系數(shù)［16］等不同的原理，采用超速離心的方法將供試品中結(jié)合多糖與游離多糖進(jìn)行分離，并將其在堿性條件下水解，通過HPAEC-PAD 法測定游離多糖含量。本研究還對不同離心力下上清中的游離多糖及蛋白含量進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，離心力在409 700 × g 時，上清中有明顯蛋白殘留，即有結(jié)合物殘留；離心力在596 100 × g 時，上清中未檢出蛋白殘留，但游離多糖含量明顯下降，僅為建立方法檢測結(jié)果的68%。因此，最終選擇498 500 × g 作為供試品游離多糖分離條件。

本研究建立的方法專屬性良好，空白對照在多糖峰相應(yīng)位置無對應(yīng)色譜峰。精密度和穩(wěn)定性RSD 均 ＜5%，加標(biāo)回收率為92. 40% ~ 106. 32%。將建立的方法與乙醇沉淀法比較，兩者游離多糖含量檢測結(jié)果均 ＜20%，在《中國藥典》三部（2020 版）規(guī)定的合格范圍內(nèi)。用建立的方法測定的1 ~ 9 批次供試品的游離多糖含量較乙醇沉淀法明顯偏低，推測用建立的方法測定游離多糖含量低的供試品時，可能較乙醇沉淀法更為靈敏。此外，乙醇沉淀法的測定結(jié)果顯示的是低分子質(zhì)量結(jié)合多糖及游離多糖的總和，而所建立的方法的測定結(jié)果僅顯示游離多糖含量，推測可能低分子結(jié)合物較高分子結(jié)合物更易降解。上述推測尚需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究建立的檢測Hib 結(jié)合疫苗游離多糖含量的超速離心聯(lián)合HPAEC-PAD 法具有良好的專屬性、精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，可作為Hib 結(jié)合疫苗游離多糖含量的測定方法。同時，也為其他多糖蛋白結(jié)合疫苗游離多糖提取和檢測提供了思路。