汪夢俊 綜述，申碩 審校

武漢生物制品研究所有限責任公司病毒性疫苗研究一室，湖北 武漢 430207

近年來，由冠狀病毒（coronavirus，CoV）引起的呼吸道綜合征大流行愈加頻繁，從2003 年的SARS（severeacuterespiratory syndrome），到2012 年的MERS（Middle East respiratory syndrome），再到 2019 年的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）。這些病毒可在包括人類在內(nèi)的多種哺乳動物間傳播，并可經(jīng)空氣途徑由呼吸道入侵機體，極易造成大范圍流行。在所有的RNA 病毒中，CoV 具有最大的基因組結(jié)構(gòu)。CoV 擁有一套獨特且復(fù)雜的復(fù)制策略，與其龐大的基因組相適用，即由NSP1-NSP16組成的酶系統(tǒng)。這些NSP 由2 個大的蛋白聚合體（polypeptide1a 和 polypeptide 1a ／ 1b，pp1a 和pp1ab）酶切而來，能發(fā)揮各種與病毒復(fù)制相關(guān)的分子活性，如 RNA 依賴的 RNA 聚合酶活性（NSP12）、解旋酶活性（NSP13）、mRNA 封閉活性（NSP14 和 NSP16）和保真性調(diào)節(jié)活性（NSP14）等。盡管我們對CoV 的NSP 有一定了解，但嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）在全球的快速蔓延以及新變異株的不斷出現(xiàn)，讓我們意識到對CoV NSP 的認識仍存在許多不足之處。

本文對目前已報道的CoV NSP 的結(jié)構(gòu)及功能作一個系統(tǒng)的歸納和總結(jié)，以期進一步了解SARSCoV-2 的復(fù)制和NSP 功能，進而發(fā)現(xiàn)藥物新靶點以及制定疫苗研制策略，為疾病預(yù)防、治療和阻斷SARSCoV-2 及其變異株在全球的傳播提供參考。

1 CoV 的分類

CoV 指巢狀病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）的病毒，目前還可細分為2 個亞科、5 個屬、27 個亞屬以及39 個種［1］。隨著 COVID-19 疫情的發(fā)展，WHO 又將 SARSCoV-2 的變異株進一步分為 alpha、beta、gamma 和delta等變異株。所有的巢狀病毒目病毒均為有包膜的單鏈正義RNA 病毒，不同病毒間的主要差異在于擁有的結(jié)構(gòu)蛋白的數(shù)量、類型和大小不同，并由此形成了各種形態(tài)和結(jié)構(gòu)不同的核衣殼及病毒顆粒。

冠狀病毒科是巢狀病毒目中最大的1 個科，包含 2 個亞科，分別為 Coronavirinae 和 Torovirinae，而基于血清型的差異，CoV 可分為4 個屬，即冠狀病毒亞科中的 α 冠狀病毒（α-coronavirus，α-CoV）、β 冠狀病毒（β-coronavirus，β-CoV）、γ 冠狀病毒（γ-coronavirus，γ-CoV）和 δ 冠狀病毒（δ-coronavirus，δ-CoV）［2］，見圖 1。目前，能夠在人群中傳播的主要為α-CoV 及β-CoV，包括引起 SARS、MERS 和 COVID-19 的幾類 CoV［3］。

圖1 CoV 主要分類及基因組特征Fig. 1 Classification and genomic feature of CoV

2 CoV 的基本特征

CoV 是一種有囊膜包裹的80 ~ 220 nm 的二十面體球形顆粒，主要由 S 蛋白（spike protein）、M 蛋白（membrane protein）、E 蛋白（envelope protein）和 N蛋白（nucleocapsid protein）4 種結(jié)構(gòu)蛋白組成。

S 蛋白是重要的中和抗原蛋白，也是疫苗設(shè)計的常用靶點，以三聚體的形式存在于病毒顆粒表面［4-5］，呈刺突狀，屬于Ⅰ型病毒融合蛋白，單體大小一般為126 ~ 180 kD，通常帶有多位點約40 kD 的N-linked糖基化修飾基團［6］，能夠與宿主細胞表面特異受體結(jié)合進而介導(dǎo)病毒進入宿主細胞［7］。大多數(shù)CoV 的S蛋白進入宿主細胞后會被胞內(nèi)的furin-like 或其他蛋白酶切割成S1 和S2 兩個亞基，分別具有受體結(jié)合和膜融合功能。M 蛋白是CoV 顆粒中分子含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，被認為與病毒顆粒的形成有關(guān)［8］。其單體大小為25 ~ 30 kD，有3 個跨膜結(jié)構(gòu)域，通常會帶有N-liked 的糖基化修飾［9］。小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）的相關(guān)研究表明，M 蛋白與NSP15 及N 蛋白的結(jié)合被認為是病毒顆粒選擇性包裝的關(guān)鍵［10］。E 蛋白是一個大小為8 ~12 kD的跨膜蛋白，在不同的CoV 中具有高度的特異性，由1 個短的親水性N-末端、1 個長的親水性C-末端及中間一段長的疏水區(qū)域組成。以多種多聚體的形式存在，并且具有離子通道活性［11］。N 蛋白能夠與病毒基因組RNA 結(jié)合，構(gòu)成病毒顆粒的核衣殼結(jié)構(gòu)。包括2 個獨立的折疊結(jié)構(gòu)域：N-末端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）和 C-末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD），兩者均能與 RNA 結(jié)合，且可能具有協(xié)同作用［12-13］。同時，N 蛋白可與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列（transcription-regulating sequence，TRS）以及基因組折疊信號結(jié)合，這可能與病毒基因組的表達調(diào)控有關(guān)［14-15］。而在某些 β-CoV 中，還發(fā)現(xiàn) 1 個短的蛋白突起（hemagglutinin-esterase，HE），具有乙酰酯酶活性，能夠與宿主細胞表面的糖蛋白結(jié)合，增強S 蛋白介導(dǎo)的病毒侵入作用［16］。

除了CoV 外，CoV 內(nèi)還存在一定數(shù)目的輔助蛋白（accessory protein）。不同CoV 中輔助蛋白的數(shù)目不同，但均對病毒的復(fù)制和功能具有重要的影響［17-19］。目前，對于輔助蛋白的具體功能尚不完全清楚，但已有研究證明，在 SARS-CoV 的 VLP 中存在 3a、ORF6、7a、7b 等輔助蛋白，在 SARS-CoV-2 中，3a 蛋白分子豐度被證明相當于或超過 M 蛋白［9，20-22］。

值得注意的是，CoV 還具有一套較前兩者更為保守且獨特的NSP 系統(tǒng)，這些NSP 由ORF1ab 編碼的pp1a 和pp1ab 經(jīng)酶切而來，能夠形成CoV 復(fù)制所必需的復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（replication transcription complex，RTC）。RTC 包含許多參與 RNA 復(fù)制的酶，如 3′-5′核酸外切酶（NSP14），這一蛋白酶在其他 RNA 病毒中均未被發(fā)現(xiàn)，被認為與RTC 的校對功能相關(guān)。

3 CoV 的基因組結(jié)構(gòu)

如圖2 所示，CoV 的基因組主要可分為2 個部分，從 5′-端開始約 2 ／ 3 的區(qū)域為 ORF1a 和 ORF1b。ORF1a 可表達1 個包含NSP1 ~ NSP11 的多蛋白聚合物（pp1a），ORF1b 則被位于 NSP11 上的 ORF1a 終止子終止。但在某些情況下，當核糖體移動至NSP11區(qū)域時，CoV 能夠通過一種特殊的核糖體移碼機制［23-24］，跳過 ORF1a 的終止密碼子，使 ORF1a 和ORF1b 共表達出完整的包含16 個 NSP 的pp1ab。pp1ab 在糜蛋白酶樣蛋白酶（3CLpro）／ Mpro（main protease）及木瓜蛋白酶樣蛋白酶（papain-like protease，PLpro）的作用下加工成 16 種 NSP［25-26］，這些NSP 能誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生雙層囊泡（double-membrane vesicle，DMV）結(jié)構(gòu)，并由此組裝成RTC。在RTC 的幫助下，CoV 能夠以不連續(xù)轉(zhuǎn)錄的方式合成一套嵌套的亞基因組 RNA（subgenomic RNA，sgRNA）［27］。這些sgRNA 具有共同的 5′-前端和 3′-末端序列，其轉(zhuǎn)錄由位于不同ORF 之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列調(diào)控［28］。由于RNA 病毒復(fù)制過程中的突變率遠高于DNA 病毒，RNA 病毒的基因組長度通常小于10 kb。然而，CoV 具有遠大于其他RNA 病毒的基因組，這可能與其特有的NSP 系統(tǒng)有關(guān)，如能夠發(fā)揮3′-5′核酸外切酶活性的NSP14，賦予了CoV RTC 校對活性和生存適應(yīng)能力。

從 CoV RNA 基因組 3′-端開始占基因組約 1 ／ 3的區(qū)域是表達結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白的區(qū)域，通常包含至少 4 個 ORF，分別編碼 S 蛋白、M 蛋白、E 蛋白和N 蛋白。此外，CoV 通常還存在數(shù)目不定的編碼輔助蛋白的開放型閱讀框（open reading frame，ORF），如 SARS-CoV-2 中的 ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8 和 ORF10 等［29］。所有結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白均以 sgRNA 形式編碼［27］。

4 CoV 的NSP

在不同的CoV 中，NSP 的結(jié)構(gòu)及功能一般而言相對保守，這意味著這些NSP 在CoV 的生命周期中扮演著相當重要的角色。CoV NSP 的主要功能見表 1［30］，根據(jù) NSP 在 CoV 中發(fā)揮的主要功能的不同，可以把 CoV 的 NSP 分為 4 類（如圖 2 中Function所示）。NSP1 和NSP2 主要通過干擾宿主細胞正常的生物學功能來抑制宿主細胞對病毒復(fù)制和增殖的影響，而其本身并不會發(fā)揮RNA 復(fù)制相關(guān)的功能。NSP3 ~ NSP6 能夠介導(dǎo)DMV 的形成，同時具有3CLpro和 PLpro兩種蛋白酶活性，能夠?qū)?pp1a ／ pp1ab切割成單獨的NSP，是RTC 形成的必需分子［31］。NSP7 ~ NSP11 具有病毒引物合成的活性，多為其他NSP 的輔助分子。NSP12 ~ NSP16 是RNA 復(fù)制酶最核心的部分，行使RNA 復(fù)制、加帽、校對和修飾等功能。

表1 CoV NSP 的主要功能Tab. 1 Main functions of CoV NSP

圖2 SARS-CoV-2 的基因組結(jié)構(gòu)Fig. 2 Genomic structure of SARS-CoV-2

4. 1 NSP1 NSP1 是 CoV 基因組 RNA 編碼的第 1個蛋白質(zhì)，由 pp1a ／ 1ab 經(jīng) PLpro 酶切而來。目前主要被發(fā)現(xiàn)在 α-CoV 及 β-CoV 中，在 γ-CoV 及 δ-CoV中還未發(fā)現(xiàn)［32-33］。不同譜系CoV 間的NSP1 基因序列缺乏明顯的同源性［34］。對已知CoV NSP1 的研究表明，不同CoV 阻遏宿主細胞基因表達以及對抗宿主固有免疫具有不同的機制［35-37］。

在對SARS-CoV 研究中，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV 的NSP1能夠通過與核糖體的40S 小亞基結(jié)合，介導(dǎo)宿主mRNA 5′-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）附近的區(qū)域被核酸內(nèi)切酶酶切［38-40］。而由于病毒mRNA存在1 個5′-端前導(dǎo)序列，使得病毒自身的mRNA 避免被切割［41］。同時，大量的研究表明，SARS-CoV 的NSP1 在抑制宿主細胞固有免疫、誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生細胞因子和趨化因子［42］、阻滯細胞周期［43］及擾亂核孔復(fù)合物Nup93 的定位等方面也發(fā)揮著重要作用，這些功能的實現(xiàn)可能與SARS-CoV NSP1 上的β-barrel 結(jié)構(gòu)有關(guān)［44］。而在對 SARS-CoV-2 的研究中，NSP1 與核糖體40S 小亞基之間的相互作用已被證明與其第 164 位賴氨酸殘基（K164）高度相關(guān)［45］。而反向遺傳學實驗也證明了SARS-CoV-2 NSP1 C-末端結(jié)構(gòu)域與α-干擾素的mRNA 降解相關(guān)［46］。但NSP1如何與其本身mRNA 保守的5′-UTR 之間相互作用，從而避免自身mRNA 降解的機制目前尚不清楚。

4. 2 NSP2 NSP2 主要由1 個重復(fù)的折疊結(jié)構(gòu)域組成，在不同CoV 中的序列同源性較低，通常被認為不是病毒復(fù)制所必需的一個元件，但其具體的功能尚不清楚。在對MHV 的研究中，NSP2 被發(fā)現(xiàn)能夠與 NSP1、NSP5、NSP7、NSP8、NSP9、NSP10、NSP12 和NSP13 等協(xié)同作用［47］。在對傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）的研究中，NSP2 顯示出較弱的抗依賴雙鏈RNA 的蛋白激酶（doublestranded RNA activated protein kinase，PKR）活性，意味著其可能參與了NSP1 的抗宿主細胞固有免疫反應(yīng)［30］。同時，蛋白組學相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，NSP2 能夠與抑制素1 和2 結(jié)合，意味著NSP2 可能參與了病毒抗宿主細胞固有免疫的過程［48］。

4. 3 NSP3 NSP3 是CoV 中最大的多結(jié)構(gòu)域非結(jié)構(gòu)蛋白，且不同冠狀病毒屬中的CoV NSP3 擁有的結(jié)構(gòu)域數(shù)量和組成也存在差異，一般包括10 ~ 16 個結(jié)構(gòu)域［49］，其中 8 個結(jié)構(gòu)域在所有 CoV 的 NSP3 中均有發(fā)現(xiàn)，見圖3。

圖3 不同CoV NSP3 的主要結(jié)構(gòu)域Fig. 3 Main structural regions of various CoV NSP3

NSP3 不同結(jié)構(gòu)域在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮著不同功能，其能夠通過自身的PL1pro和PL2pro（PLpro）結(jié)構(gòu)域從 pp1a 和 pp1ab 中釋放 NSP1、NSP2 和自身［50］，并與其他NSP 結(jié)合形成RTC。有研究表明，NSP3 能夠與 NSP5、NSP6 共同誘導(dǎo)SARS-CoV 感染細胞中DMV 的形成，且主要由NSP3 C-末端的某一結(jié)構(gòu)域所介導(dǎo)［31，51］。Ubl1 結(jié)構(gòu)域能夠與病毒基因組的 5′-UTR 和N 蛋白的絲氨酸和精氨酸富集區(qū)（SR 區(qū)）相互作用［52］，這種相互作用可能是病毒感染早期RTC與病毒基因組結(jié)合的基礎(chǔ)［15，52-53］，而 MHC 中 Ubl1核心區(qū)域（19 ~ 111 位氨基酸殘基）的缺失也會導(dǎo)致病毒無法正常復(fù)制［15，53-54］。NSP3 能夠通過宿主的翻譯后修飾系統(tǒng)來幫助病毒對抗宿主的固有免疫。以最近的1 篇關(guān)于SARS-CoV-2 的研究為例，研究者發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 感染細胞后的去泛素化和去甲酰化修飾與MERS-CoV 相近，均高于SARS-CoV。SARS-CoV-2 的PLpro 的半胱氨酸酶和脫乙酰酶活性可能是其多種蛋白水解功能中最重要的，并且似乎具有種屬特異性［55］。NSP3 中還有一個保守的大結(jié)構(gòu)域（Mac1），其具有的ADP 核糖蛋白水解酶活性對于病毒的復(fù)制不是必需［56］，但在病毒致病過程中發(fā)揮重要的作用。

4. 4 NSP4 NSP4 是一種長度約500 個氨基酸殘基的跨膜蛋白，主要包括4 個跨膜結(jié)構(gòu)域和1 個保守的位于胞漿的C-末端結(jié)構(gòu)域［57］。第1 個跨膜結(jié)構(gòu)域位于蛋白第32 位氨基酸殘基之后，包含1 個酶切信號序列。其他3 個跨膜結(jié)構(gòu)域位于280 ~ 400 氨基酸殘基之間，最后留下約100 個氨基酸殘基的C-末端結(jié)構(gòu)域［57-58］。有研究表明，當其C-末端的結(jié)構(gòu)域缺失時，病毒的復(fù)制會受到一定影響［59］。而研究人員通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)，NSP4 與NSP2 能夠相互作用。當把不同病毒的NSP4 共表達在一個細胞時，也觀察到了不同的NSP4 分子之間的相互作用［60］。在 SARS-CoV 中，NSP4 是病毒 DMV 形成的重要組分，一項利用 293T 表達的研究表明，SARSCoV 的NSP3 和NSP4 全長共表達會導(dǎo)致細胞膜全面配對，并且配對的膜之間會保持與自然感染SARSCoV 所形成的 DMV 相同的距離［31］。而對 MHV 的研究表明，其NSP3 和NSP4 的C-末端之間能夠發(fā)生相互作用［60］，這種相互作用能夠影響DMV 的形成以及RTC 在DMV 上的錨定，對于CoV 的復(fù)制至關(guān)重要［61］。

4. 5 NSP5 NSP5 也被稱為3CLpro，是一種大小約33. 8 kD 的半胱氨酸蛋白酶。包括2 個活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)域（Ⅰ和Ⅱ）和1 個介導(dǎo)NSP5 形成二聚體的結(jié)構(gòu)域（Ⅲ），結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ之間由1 個長環(huán)連接。3CLpro的活性位點位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ的間隙之間，并具有 Cys-His 催化二元結(jié)構(gòu)（Cys145 和 His41）［62］。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在所有的巢狀病毒目病毒中，NSP5均可與NSP12 及NSP13 一同構(gòu)成完整的病毒RNA復(fù)制酶［63］。NSP5 的功能與糜蛋白酶相似，是CoV中一種 Mpro，主要負責 pp1a ／ 1ab 上 11 個特異位點的酶切［64-65］，產(chǎn)生的酶切產(chǎn)物（NSP4 ~ NSP16）將會在DMV 上組裝成RTC［66］。蛋白組學的相關(guān)研究表明，NSP5 可直接與NSP12 或NSP14 結(jié)合，或者與NSP10、NSP12 和 NSP14 形成的復(fù)合物結(jié)合［67-69］，表明NSP5 在RNA 的復(fù)制及DMV 的形成中可能發(fā)揮著重要的作用［70］。

4. 6 NSP6 根據(jù)TMHMM 2.0 軟件預(yù)測，大多數(shù)CoV的NSP6 包含7 個跨膜區(qū)域［71］，但也有文獻報道，NSP6 僅有6 個跨膜區(qū)域，且2 個末端均在膜的胞質(zhì)側(cè)［58，72］，這些跨膜區(qū)域被認為與 RTC 能夠錨定在細胞膜上有關(guān)［58］。NSP6 主要存在于宿主細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其膜外區(qū)域存在多個與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜高親和力的苯丙氨酸殘基，使得NSP6 能穩(wěn)定與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合［73］。NSP6 與 NSP3、NSP4 相同，均是 SARS-CoV 形成DMV所必需的［74］。當NSP6 單獨表達時，能夠引起宿主細胞發(fā)生膜增殖，NSP6 過度表達時，則會干擾宿主細胞的膜運輸過程［58，72］，導(dǎo)致膜泡在微管復(fù)合體周圍聚集［31］。同時，NSP6 還能夠誘導(dǎo)包含 Atg5 和LC3-Ⅱ小泡的細胞自噬［72］。一項酵母雙雜交系統(tǒng)的實驗證明，SARS-CoV 的 NSP6 能夠與 NSP2、NSP8、NSP9和輔助蛋白9b 等相互作用［75］。

4. 7 NSP7 NSP7 在CoV 中是相對保守的，但在不同巢狀病毒目病毒間的序列同源性較低。利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和 X-射線衍射對 SARS-CoV 的 NSP7 ／ NSP8 十二烷基復(fù)合物進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，NSP7 包含4 個不同位置及空間方位的α-螺旋，預(yù)示著NSP7 的蛋白構(gòu)型可能主要受到NSP8 相互作用的影響。NSP7 最顯著的特點是3 個位于同一平面的α-螺旋，三者通過2 個環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接，這種獨特的結(jié)構(gòu)能夠通過疏水側(cè)鏈間的相互作用維持NSP7 的穩(wěn)定性［76］。NSP7 的二聚體能夠與 NSP5、NSP8、NSP9 和 NSP3 等相互作用［77］。NSP7 與NSP8 的相互作用可能與其N-末端保守的螺旋束結(jié)構(gòu)有關(guān)［41］。體外的共表達試驗證明SARSCoV 的 NSP7 ／ NSP8 復(fù)合物能夠影響 NSP12 的活性，而反向遺傳學研究表明，當對SARS-CoV NSP7內(nèi)特定氨基酸殘基進行替換后，病毒的復(fù)制將會受到影響［78］。此外，MHV 的 NSP7 已被證明能夠與NSP1 和 NSP10 特異性結(jié)合［47］。

4. 8 NSP8 NSP8 是 CoV 中 1 個高度保守的蛋白，其三級結(jié)構(gòu)呈“高爾夫球桿”狀，包含一個N-末端“軸”結(jié)構(gòu)域和一個C-末端“頭部”結(jié)構(gòu)域［79］。對SARSCoV-2 NSP8 的研究表明，NSP8 的 N-末端由 1 個長的α-螺旋及2 個短的螺旋結(jié)構(gòu)組成，具有高度的可變性，其表面帶有正電荷，主要參與核酸與NSP7 和NSP12 的相互作用以及復(fù)合物的形成［80］。NSP8 的C-末端結(jié)構(gòu)域主要包含4 個α-螺旋結(jié)構(gòu)，能夠與NSP7 通過5 個α-螺旋形成異二聚體。在SARS-CoV中，NSP8 能與NSP7 共同形成一個規(guī)則的十六聚體結(jié)構(gòu)［81］。進一步的研究表明，這種十六聚體的形成與NSP8 N-末端的長α-螺旋有關(guān)，當水解去除NSP8 N-末端的長α-螺旋后，剩余的NSP8 結(jié)構(gòu)僅能與NSP7形成1 個四聚體結(jié)構(gòu)［80］。對NSP8 的功能研究表明，NSP8 能夠與RNA 模板上5′-（G ／ U）CC-3′結(jié)合來啟動互補寡聚核苷酸的合成，被認為具有次級的RdRp活性［41］，能夠在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中為NSP12 提供RNA 引物［82］。反向遺傳學及生物化學的研究表明，SARS-CoV 的 NSP8 的 183（P）和 190（R）位氨基酸殘基與其NSP12 結(jié)合活性相關(guān)，而58（K）位氨基酸殘基則能與RNA 結(jié)合［78］，兩者使得NSP8能夠調(diào)節(jié)RNA 聚合酶活性。

4. 9 NSP9 NSP9 是 CoV 繼 NSP5 后第 2 個從復(fù)制酶上脫離下來的蛋白亞基，大小約110 個氨基酸殘基。其核心由1 個六股封閉的“β-barrel”和一系列向外伸出的延伸環(huán)組成。其他一些單獨的“β-strand”、C-末端 α-螺旋和 N-末端“β-strand”通過環(huán)與“β-barrel”連接。在C-末端α-螺旋間范德華力的作用下，NSP9能夠形成一個二聚體構(gòu)象［83］。SARS-CoV NSP9 二聚體晶體結(jié)構(gòu)顯示，二聚體中每個NSP9 單體均含有1 個由7 條鏈和1 條螺旋排列成的緊湊的錐形區(qū)域，其兩側(cè)是C-末端螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋含有2 個疏水位點，其中一個面向內(nèi)側(cè)，另一個與第2 單體的螺旋相互作用，維持二聚體的穩(wěn)定性［84］。

NSP9 以二聚體的形式發(fā)揮生物活性，能夠以非連續(xù)方式與核酸特別是RNA 分子結(jié)合［85-87］。對NSP9 的反向遺傳學研究表明，NSP9 內(nèi)的點突變可阻斷 CoV 的復(fù)制［86，88］。對于 NSP9 的具體功能及作用機制目前尚不明確?？梢源_定的是，NSP9 可與NSP8 和NSP12 相互作用，并共定位在膜復(fù)制型的細胞器上［89-90］。

4. 10 NSP10 NSP10 在 SARS-CoV 中是由 139 個氨基酸殘基構(gòu)成的非酶病毒蛋白，在病毒復(fù)制過程中能夠通過調(diào)節(jié)NSP14 和NSP16 的活性來提高CoV復(fù)制過程中的保真性［91］。 SARS-CoV NSP10 ／NSP16的異二聚體晶體結(jié)構(gòu)表明，NSP10 帶正電荷的疏水表面能夠與NSP16 表面帶負電荷的疏水囊相互作用，穩(wěn)定NSP10 與S-腺苷甲硫氨酸的結(jié)合位點。NSP10 的中心存在 1 對反平行的“β-strand”，其一側(cè)被重疊的“l(fā)oop”結(jié)構(gòu)包圍，另一側(cè)被1 個螺旋結(jié)構(gòu)域包圍，螺旋結(jié)構(gòu)域和“l(fā)oop”結(jié)構(gòu)形成2 個“zinc finger”結(jié)構(gòu)［92］。

酵母雙雜交試驗表明，NSP10 二聚化后能夠與NSP1、NSP7、NSP14 和 NSP16 相互作用［47，93］。在一項針對MHV 溫度敏感型突變株的研究中，發(fā)現(xiàn)NSP10突變會導(dǎo)致病毒的負鏈RNA 合成不足［94-95］。最近的一項研究表明，NSP10 在與NSP14 和NSP16 相互作用的同時，還能夠調(diào)控后兩者的ExoN 活性及Ribose-2’-O-MTase*’-O-MTase）活性［92］。但 NSP10 對ssRNA和dsDNA ／ dsRNA 的親和力較弱，表明該蛋白可能是作為復(fù)合體的一部分發(fā)揮作用。

4. 11 NSP11 NSP11 是 pp1a ／pp1ab 上緊接著 NSP10的一段高度可變的、長度為11 ~ 23 個氨基酸殘基的多肽段。其對應(yīng)的RNA 區(qū)域中包含一段讀碼轉(zhuǎn)換的信號，能夠介導(dǎo)翻譯到該位點的核糖體發(fā)生移位，使ORF1b 能夠正確地移碼后表達。在SARSCoV 中，NSP11 是 1 個包含 13 個氨基酸殘基的多肽，由 pp1a 在 NSP10 ／ NSP11 連接處的 C-末端加工而來。而位于 NSP10 ／ NSP11 連接處與 ORF1a ／ 1b移碼位點之間NSP11 的N-末端序列，移碼后也可作為 NSP12 N-末端的一部分。NSP10 ／ NSP11 復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)顯示，盡管寡聚和堆積的晶體在整體結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，但其核心的NSP10 結(jié)構(gòu)幾乎無差異，表明NSP11 可能主要是作為核糖體翻譯轉(zhuǎn)換機制的一部分發(fā)揮功能，而對于NSP10 的功能則無顯著影響。

4. 12 NSP12 現(xiàn)有研究表明，NSP12 包含至少2 個結(jié)構(gòu)域，即具有核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性的NiRAN（nidovirus RdRp-associated nucleotidyl transferase）結(jié)構(gòu)域和 C-末端的 RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）結(jié)構(gòu)域。NiRAN 結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)呈“right hand shaped fold”，可劃分為“finger”、“palm”和“thumb”3 個亞結(jié)構(gòu)域，“finger”結(jié)構(gòu)域包括 1 個特征性“helixloop-helix”結(jié)構(gòu)和 2 個“stranded β-sheet”結(jié)構(gòu)。而“palm”結(jié)構(gòu)域由 2 個螺旋結(jié)構(gòu)和 1 個“β-hairpin”結(jié)構(gòu)組成，包含核苷酸轉(zhuǎn)移酶的活性位點［96］?！癴ingerthumb”之間的相互作用形成了NSP7-NSP 異二聚體結(jié)合位點，其中NSP12 和NSP7 之間的大部分接觸是在該位點形成的［97］。此外，SARS-CoV 的NSP12還具有2 個Zn2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被認為與蛋白結(jié)構(gòu)的維持有關(guān)，但不直接參與酶的活性［98］。

單獨NSP12 僅能顯示出較弱的RNA 聚合酶活性，而當其與NSP7 和NSP8 結(jié)合后，自身的活性將得到極大提高［78］。在已研究的SARS-CoV-2 NSP12-NSP7-NSP8 復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中，NSP7-NSP8 異二聚體與NSP12 的相互作用主要發(fā)生在面向NTP 進入通道的聚合酶“thumb”結(jié)構(gòu)域上。NSP12“finger”結(jié)構(gòu)域存在于“thumb”結(jié)構(gòu)域和NSP7-NSP8 復(fù)合物之間，被認為有助于NSP12 與其他RNA 合成必要的成分相互作用，以便其結(jié)合至病毒復(fù)制復(fù)合物中［97］。

4. 13 NSP13 NSP13 和 NSP12 是 CoV RTC 中 2 個最核心的成分。其中NSP12 主要發(fā)揮RdRp 功能，而NSP13 則起到解旋酶的作用。在SARS-CoV-2 NSP13的結(jié)構(gòu)預(yù)測模型中，NSP13 位于ORF1ab 中，含有596個氨基酸殘基，空間構(gòu)象呈三角金字塔形，包括5 個與SARS-CoV 和MERS-CoV 類似的結(jié)構(gòu)域，其中1A、2A 和1B 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了金字塔的三角形基部，而連接鋅指結(jié)合域（zinc binding domain，ZBD）和 1B 結(jié)構(gòu)域的莖環(huán)結(jié)構(gòu)域位于金字塔的頂端［99］。

研究發(fā)現(xiàn)，基因組大于7 kb 的正鏈RNA 病毒通常均會編碼解旋酶。這些解旋酶可被劃分成6 個主要的超家族（SF1 ~ SF6），在細胞核酸代謝的各個方面均發(fā)揮作用。而在我們目前發(fā)現(xiàn)的所有解旋酶中，均具有1 個耦合NTP 水解和蛋白構(gòu)象變化的核心結(jié)構(gòu)域，同時也均具有一些起輔助作用的結(jié)構(gòu)域，如幫助解旋酶定位的核蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域［55，100］。生物信息學分析表明，CoV NSP13 屬于超家族SF1，具有包括 NTP 和 dNTP 水解酶、5′-3′的 DNA 和 RNA 解旋酶以及RNA 5′-三磷酸酶在內(nèi)的多種酶活性［100］。

4. 14 NSP14 CoV NSP14 在病毒復(fù)制中發(fā)揮著重要作用，其 N-末端具有核酸外切酶（exonuclease，ExoN）活性，而C-末端則具有依賴S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine，AdoMet）的鳥苷 N7-MTase 活性［101-103］。根據(jù)SARS-CoV 的NSP10 ~ NSP14 的晶體結(jié)構(gòu)顯示，ExoN 結(jié)構(gòu)域包含1 個活性中心以及1 個由5 個“βstrand”組成的扭曲“β-sheet”。NSP14 的 N7-MTase結(jié)構(gòu)域整體呈現(xiàn)為1 個“MTase”折疊，主要由5 個“βstrand”組成［102］。

NSP14 的ExoN 活性可能與CoV RNA 復(fù)制酶的保真性有關(guān)［104］。研究表明，用丙氨酸取代ExoN前2 個活性位點后，SARS-CoV 在細胞中復(fù)制時的保真性會下降15 ~ 20 倍［105-106］。另一項研究表明，體外表達的SARS-CoV NSP14 在體外能夠通過與NSP10 結(jié)合，切除錯配的核苷酸序列，證明NSP10 能夠穩(wěn)定并顯著增強NSP14 的酶活性［78］。此外，NSP14的ExoN 在RNA 合成、抗病毒核苷類似物的抗性、適應(yīng)性、免疫拮抗性和毒力等方面均具有重要作用。其還被認為能夠增加病毒基因組的重組率，促進病毒在自然狀態(tài)下的進化［107］。對SARS-CoV-2 NSP12 蛋白晶體的X 射線衍射分析結(jié)果顯示，NSP14 的N-末端和C-末端結(jié)構(gòu)域之間具有重要的功能性相互作用，其中有3 個外顯子對維持N7-MTase 底物結(jié)合部位核心的α-螺旋結(jié)構(gòu)至關(guān)重要［108］。在一項研究中，研究人員利用反向遺傳學手段證明SARS-CoV 的N7-MTase 能夠通過介導(dǎo)GTP 和dGTP 甲基化，來修飾自身和宿主細胞的mRNA。同時，研究人員還通過點突變的方法確定了N7-MTase 結(jié)構(gòu)域上10 個與GTP 甲基化相關(guān)的氨基酸殘基［109］。此外，位于NSP14 331 ~ 336 和414 ~ 428 之間的氨基酸殘基也被認為是維持NSP14 活性所必需的位點。

4. 15 NSP15 NSP15 是CoV 中一種高度保守的蛋白質(zhì)，能夠在Mn2+的參與下切除病毒負鏈RNA 5′-端的多聚尿苷，幫助病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)識別，確保病毒能夠順利在宿主細胞中復(fù)制［110-111］。SARSCoV-2 的 NSP15 共包含 10 個 α-螺旋和 21 個“β-strand”，可劃分為3 個結(jié)構(gòu)域，即N-末端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域。N-末端結(jié)構(gòu)域由1 個反平行的“β-sheet”組成，包含 2 個 α-螺旋（α1 和 α2），能夠介導(dǎo)NSP15 形成六聚體。中間結(jié)構(gòu)域由10 個“β-strand”組成。C-末端結(jié)構(gòu)域具有核酸內(nèi)切酶活性，由2 個反平行“β-sheet”和 1 個活性催化位點組成［41］。

在NSP15 突變的CoV 中，若NSP15 活性降低或徹底失活，依賴于DMA5（IF1H1，一種模式識別受體）的IFN 的表達就會增加，并激活宿主細胞對dsRNA的識別，進而激活機體的免疫保護機制，誘導(dǎo)受感染細胞發(fā)生凋亡［110］。有文獻報道，NSP15 的過度表達可幫助病毒更好地應(yīng)對機體的固有免疫反應(yīng)，但目前尚未在實際的病毒感染中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的現(xiàn)象［112］。

4. 16 NSP16 NSP16 的氨基酸序列在不同的CoV中是高度保守的，并且，不同CoV 中NSP16 的結(jié)構(gòu)域和功能均很相似。如SARS-CoV 和MERS-CoV 的NSP16 ／ NSP10 復(fù)合物就表現(xiàn)出相似的結(jié)構(gòu)［113-114］。對 SARS-CoV-2 NSP10 ／ NSP16 的異二聚體的晶體結(jié)構(gòu)分析表明，NSP16 包含298 個氨基酸殘基，內(nèi)部含有“Rossmann-like β-sheet”折疊，被 11 個 α-螺旋、7 個“β-strand”和 2’-O-MTase 催化核心中的“l(fā)oop”結(jié)構(gòu)包圍?！發(fā)oop”和 α-螺旋之間夾雜著由 7 個“β-strand”形成的“β-sheet”［92］。

NSP16 包含 1 個 2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（2’-O-MTase）結(jié)構(gòu)域，與NSP14 一樣能甲基化位于GTP 上的“cap”結(jié)構(gòu)。貓冠狀病毒（feline coronavirus，F(xiàn)CoV）的NSP16能單獨與含“cap”結(jié)構(gòu)的RNA 特異性結(jié)合，并將其甲基從AdoMet 轉(zhuǎn)移至第1 個N7 甲基化底物核苷酸的 2’-O 位置［114-116］。之前的研究表明，敲除 CoV的 NSP16 可阻斷病毒 RNA 合成和復(fù)制［117］。當NSP16失活后，宿主細胞內(nèi)的模式識別受體對病毒RNA的識別就會增強，進而抑制病毒在宿主細胞的復(fù)制增殖，這一現(xiàn)象在SARS-CoV、人冠狀病毒229E（human coronavirus 229E，HCoV 229E）和 MHV 中均有發(fā)現(xiàn)［117］。值得注意的是，在NSP10／NSP16相互作用中包含的NSP10 殘基在CoV 中是高度保守的。最近的研究表明，不同 CoV（FCoV、MHV、SARS-CoV、MERSCoV）的 NSP10 均能夠激發(fā) NSP16 的 2’-O-MTase活性。因此，針對NSP10 ／ NSP16 相互作用的化合物可能具有廣譜的抗CoV 效應(yīng)，而且已有實驗證明了這一觀點［116，118］。

5 展 望

CoV 是人類生命健康的一個巨大威脅，自本世紀以來，由CoV 引起的大流行已發(fā)生過3 起。與此同時，由于CoV 可在包括人類在內(nèi)的多種哺乳動物間傳播，很難徹底戰(zhàn)勝這類病毒。而隨著病毒在自然界不斷變異和重組，未來我們還可能面臨更多由CoV 帶來的威脅。

目前，對于病毒流行性傳染病的防治策略主要集中在疫苗及抗病毒藥物的開發(fā)上。兩者均需對病毒蛋白的結(jié)構(gòu)及其在病毒復(fù)制過程中的功能有一個全面且清晰的認識。CoV 的 NSP 被認為在CoV 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中扮演著重要地角色。而目前對SARS-CoV-2 的研究也證明，ORF1a ／ 1b 基因及蛋白產(chǎn)物的突變，可能對變異株的傳播力、致病性和免疫原性具有一定地影響。

然而，相較于結(jié)構(gòu)蛋白而言，我們對NSP 結(jié)構(gòu)及功能的認識尚不足，因此對其研究是必要且急需的。通過對CoV NSP 結(jié)構(gòu)及功能的研究，我們將會更深入地了解CoV 的復(fù)制過程和發(fā)病機制，這將為CoV 疫苗的設(shè)計（如減毒疫苗株或以減毒株為骨架的滅活疫苗株）及抗病毒藥物開發(fā)提供更可靠的方向和途徑，如以某個NSP 缺陷為基礎(chǔ)，可進行SARSCoV-2 減毒型或復(fù)制缺陷型毒株的研發(fā)，這將為滅活疫苗的生產(chǎn)提供安全、高效的途徑。而針對CoV復(fù)制過程中的一些重要且保守的功能位點，還可設(shè)計廣譜且高效的抗CoV 藥物。這些均將有助于我們更好地應(yīng)對未來還可能出現(xiàn)的CoV 大流行。