馬靜 ，陳開(kāi)廷 ，曹美娜 ，劉玉婷 ，馬婧 ，高金亮

1. 包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014000；2. 鄂爾多斯市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙 古鄂爾多斯 017000

大腸埃希菌（Escherichia coli）具有遺傳背景清楚、價(jià)格低廉、易于操作、蛋白表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)［1］。外源基因可在大腸埃希菌中高水平表達(dá)具有正確一級(jí)結(jié)構(gòu)的重組蛋白，但由于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的差異會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤折疊，從而產(chǎn)生沒(méi)有生物活性且不溶的包涵體。包涵體的形成可能與蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的溫度、時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度等誘導(dǎo)條件有關(guān)。有研究表明，如果蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在二硫鍵，則大腸埃希菌的內(nèi)環(huán)境更容易導(dǎo)致其形成包涵體［2］。但包涵體也具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如在大腸埃希菌中的表達(dá)產(chǎn)量高、結(jié)構(gòu)緊密、易于從其他細(xì)胞成分中分離，以及不易被降解等特性［3］，這些特性有利于對(duì)包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的初步提純。

對(duì)包涵體進(jìn)行變性溶解后復(fù)性，可獲得具有生物活性的重組蛋白。其具體過(guò)程為：將含有包涵體的大腸埃希菌裂解，經(jīng)低速離心后棄上清液留沉淀，用含洗滌劑的洗滌液洗滌沉淀后獲得包涵體粗提物；用增溶劑高濃度鹽酸胍或尿素通過(guò)破壞蛋白質(zhì)間的聚集達(dá)到增溶重組蛋白的目的；然后復(fù)性，通過(guò)將增溶劑的濃度降低或者完全清除，使蛋白恢復(fù)天然狀態(tài)。為了提高蛋白的復(fù)性效率和減少聚集現(xiàn)象的產(chǎn)生，會(huì)添加少量還原劑、小分子聚合物、表面活性劑或者分子伴侶等。

蜱是體外吸血節(jié)肢動(dòng)物，可攜帶細(xì)菌、病毒、立克次體等多種病原體。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中從青海血蜱的cDNA 文庫(kù)中克隆出1 個(gè)陽(yáng)性克隆，其編碼的蛋白質(zhì)含有多個(gè)半胱氨酸，可能形成多對(duì)二硫鍵，將該陽(yáng)性克隆暫命名為Hq002（因申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利，序列暫未公布）。BLASTPA 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與扇頭硬蜱（Rhipicephalus hemaphysaloides）［4］的rhipilin-2 相似。將該陽(yáng)性克隆的開(kāi)放閱讀框（ORF）插入原核表達(dá)載體pET-30a 中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a-Hq002。本研究將重組質(zhì)粒pET-30a-Hq002 轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，誘導(dǎo)表達(dá)其重組蛋白，通過(guò)對(duì)該包涵體蛋白進(jìn)行變性、復(fù)性，獲得可溶性的重組蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1. 1 菌株及質(zhì)粒 重組質(zhì)粒pET-30a-Hq002 由鄂爾多斯市中心醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；質(zhì)粒pET-30a（+）購(gòu)自美國(guó) Novagen 公司；E. coli Rosetta（DE3）購(gòu)自唯地生物技術(shù)有限公司。

1. 2 主要試劑 異丙基硫代-β-D 半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kan+）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購(gòu)自博士德生物工程有限公司；彩虹180 廣譜蛋白Marker（11-180 kD）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭鞍准兓瘶?shù)脂Ni-NTA Agrose購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。

1. 3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-30a-Hq002轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta（DE3），挑取單菌落接種至5 mL LB 培養(yǎng)液（含 50 μg ／ mL Kan+）中，37 ℃，200 r ／ min振搖培養(yǎng)過(guò)夜；取1 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于1 L 2 × YT 培養(yǎng)液（含 50 μg ／ mL Kan+）中，37 ℃，200 r ／ min 振搖培養(yǎng)；至A600達(dá)0. 8 ~ 1. 0 時(shí)，加入IPTG 至終濃度為 0. 1 mmol ／ L，26 ℃誘導(dǎo)表達(dá) 6 h；將獲得的重組菌進(jìn)行12% SDS-PAGE 鑒定。

1. 4 包涵體的粗提取 將誘導(dǎo)的培養(yǎng)物5 039 × g離心15 min；收集菌泥，重懸于50 mL PBS 緩沖溶液（137 mmol ／ L NaCl，1 mmol ／ L KH2PO4，8 mmol ／ L Na2HPO412·H2O，2. 7 mmol ／ L KCl，pH 7. 8）中，置冰上超聲裂解，超聲總時(shí)間30 min（超聲功率28%，超聲時(shí)間5 s，超聲間歇時(shí)間5 s）；將裂解液5 039×g離心10 min；棄上清，沉淀重懸于PBS 緩沖溶液中，離心洗滌2 次；將包涵體重懸于50 mL 洗滌液緩沖液中（2 mol ／ L 尿素，5 mmol ／ L 磷酸鹽，125 mmol ／ L NaCl），超聲處理10 min（超聲功率28%，超聲時(shí)間5 s，超聲間歇時(shí)間 5 s）；5 039 × g 離心 10 min；棄上清，沉淀重懸于洗滌緩沖液中，重復(fù)超聲2 次，充分洗滌包涵體。

1. 5 包涵體的溶解 將充分洗滌后的包涵體重懸于20 mL 變性溶解液（6 mol ／ L 鹽酸胍，20 mmol ／ L 磷酸鹽，500 mmol ／ L NaCl，pH 7. 8）中，進(jìn)一步超聲處理以促進(jìn)包涵體溶解，超聲破碎總時(shí)間為10 min（超聲功率28%，超聲時(shí)間5 s，超聲間歇時(shí)間5 s）；將處理后的包涵體懸液于室溫振搖過(guò)夜，9 380 × g 離心30 min，收集上清。

1. 6 重組蛋白的復(fù)性 將8 mL 蛋白變性溶解液用0.45 μm 過(guò)濾器過(guò)濾后，逐滴加至1 L 復(fù)性緩沖液中（50 mmol ／ L NaH2PO4，0. 5 mol ／ L NaCl，0. 1 mol ／ L KCl，10 mmol ／ L 咪唑，pH 7. 8），期間不停攪拌；稀釋復(fù)性完成后，用0. 45 μm 濾膜過(guò)濾復(fù)性的蛋白溶解液，收集過(guò)濾液。

1. 7 復(fù)性蛋白的純化 用5 倍柱床體積的平衡緩沖液（50 mmol／L NaH2PO4，0.5 mol／L NaCl，0.1 mol／L KCl，10 mmol／L 咪唑，pH 7.8）平衡 2 mL Ni-NTA Agarose預(yù)裝柱；將蛋白溶解液以1. 5 mL ／ min 的速度緩慢過(guò)柱；用5 倍柱床體積的洗滌緩沖液（50 mmol ／ L NaH2PO4，0.5 mol／L NaCl，0.1 mol／L KCl，20 mmol ／ L咪唑，pH 7. 8）洗滌柱；用洗脫緩沖液（50 mmol ／ L NaH2PO4，0.5 mol／L NaCl，0.1 mol／L KCl，250 mmol／ L咪唑，pH 7. 8）將目的蛋白從柱上洗脫下來(lái)。

1. 8 純化產(chǎn)物鑒定 為評(píng)價(jià)重組蛋白的穩(wěn)定性，將洗脫產(chǎn)物分裝后分別至4 和-20 ℃保存7 d 后，20 238×g 離心5 min，收集上清進(jìn)行12%SDS-PAGE鑒定。

2 結(jié) 果

2. 1 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 12% SDS-PAGE 分析顯示，表達(dá)的目的蛋白在細(xì)菌裂解后的沉淀中，相對(duì)分子質(zhì)量約27 000，主要以包涵體形式存在，表達(dá)量占菌體總蛋白的25%，獲得3 g 菌泥。見(jiàn)圖1。

圖1 IPTG 誘導(dǎo) 6 h 的重組 Hq002 蛋白的 SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE profile of rHq002 expressed after induction with IPTG for 6 h

2. 2 蛋白包涵體粗提后的鑒定 裂解后的細(xì)胞碎片經(jīng)2 次PBS 洗滌后，其中水溶性雜質(zhì)顯著減少，再經(jīng)2 次2 mol ／ L 尿素溶液超聲洗滌后，去掉了大腸埃希菌中大量不溶于水的雜蛋白，包涵體中雜質(zhì)明顯減少。見(jiàn)圖2。表明用PBS 緩沖液和2 mol ／ L 尿素重復(fù)洗滌包涵體，可去除大量的水溶性雜質(zhì)和部分水不溶性雜蛋白，達(dá)到粗提包涵體的目的。

圖2 PBS 緩沖液和2 mol ／ L 尿素洗滌后的蛋白包涵體的SDS-PAGE 分析Fig. 2 SDS-PAGE profile of inclusion body washed with PBS buffer and 2 mol ／ L urea

2. 3 復(fù)性蛋白純化后的鑒定 逐滴稀釋復(fù)性后的蛋白溶液可順利通過(guò)0. 45 μm 濾膜，表明重組蛋白在復(fù)性過(guò)程中未發(fā)生聚集。12% SDS-PAGE 分析顯示，純化的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約27 000，與目的蛋白包涵體條帶位置相符，見(jiàn)圖3。洗脫蛋白時(shí)，吸光度達(dá)到最高值時(shí)收集到1.5 mL 純化產(chǎn)物，純化率為19%。

圖3 復(fù)性蛋白純化后的SDS-PAGE 分析Fig. 3 SDS-PAGE profile of re-naturalized protein after purification

2. 4 純化產(chǎn)物的穩(wěn)定性 純化產(chǎn)物4 和-20 ℃存放7 d 后，蛋白溶液澄清，未見(jiàn)沉淀產(chǎn)生。12%SDS-PAGE分析顯示，存放7 d 后的純化產(chǎn)物與初純化產(chǎn)物條帶大小相符，見(jiàn)圖4。表明純化產(chǎn)物在4 和-20 ℃可穩(wěn)定保存，蛋白未出現(xiàn)降解或者聚集。

圖4 純化產(chǎn)物穩(wěn)定性的SDS-PAGE 鑒定Fig. 4 Identification of stability of purified rHq002 by SDSPAGE

3 討 論

大腸埃希菌可高效表達(dá)外源性真核基因，形成致密且不溶于水的包涵體。包涵體具有正確的氨基酸序列，但氨基酸鏈折疊時(shí)由于大腸埃希菌內(nèi)環(huán)境功能缺陷以致空間結(jié)構(gòu)發(fā)生錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致蛋白的生物功能丟失及產(chǎn)生聚集。許多真核生物蛋白中含有二硫鍵，但由于原核細(xì)胞蛋白修飾功能的缺失，半胱氨酸可能會(huì)在分子間或者分子內(nèi)形成錯(cuò)誤的二硫鍵，并且也可能形成還原的半胱氨酸殘基［2，5］。同時(shí)，這些錯(cuò)誤的二硫鍵和殘基的形成可能破壞重組蛋白的空間結(jié)構(gòu)，并為蛋白復(fù)性為具有天然空間結(jié)構(gòu)和具有生物學(xué)活性的重組蛋白帶來(lái)難度。因此，重組蛋白中是否含有及含有半胱氨酸殘基的數(shù)量是蛋白復(fù)性過(guò)程中重要的參考因素，含有多個(gè)二硫鍵的蛋白質(zhì)則可能需要一個(gè)更準(zhǔn)確和復(fù)雜的復(fù)性過(guò)程。

重組菌裂解產(chǎn)物經(jīng)離心后，其沉淀中的主要成分為包涵體，但仍含有許多細(xì)胞碎片，這些細(xì)胞碎片的主要成分為外膜蛋白、質(zhì)粒DNA、磷脂等。MIDDELBERG［6］的研究表明，包涵體中存在的雜質(zhì)可干擾甚至阻礙蛋白的正確折疊，顯著降低蛋白復(fù)性產(chǎn)率。為了能夠盡量去除包涵體中的雜質(zhì)，可根據(jù)這些成分的化學(xué)性質(zhì)選擇合適的洗滌劑。添加酶類(lèi)、洗滌劑、還原劑或低濃度的尿素等可有效去除吸附在包涵體表面的不溶性雜蛋白及膜碎片。超聲促進(jìn)雜質(zhì)溶解，PBS 緩沖液反復(fù)洗滌細(xì)胞碎片可去除大部分水溶性雜質(zhì)，再使用2 mol ／ L 尿素溶液多次洗滌可去除部分水不溶性雜質(zhì)。本研究用PBS 緩沖液-超聲-2 mol ／ L 尿素-超聲的方法，去除了大部分的雜質(zhì)，使包涵體得到初步純化，為更好地復(fù)性提供了參考。

通常使用 6 mol ／ L 鹽酸胍或 8 mol ／ L 尿素變性和溶解包涵體，但6 mol ／ L 鹽酸胍溶液的變性能力強(qiáng)于8 mol ／ L 尿素溶液。利用高鹽離子溶液變性溶解蛋白，使氨基酸鏈打開(kāi)，去除鹽離子后氨基酸鏈能夠重新折疊，形成有生物活性的重組蛋白。常用的復(fù)性方法有稀釋?zhuān)肝龊凸滔嗌V法［7］。為了減少氨基酸鏈的錯(cuò)誤折疊，通常會(huì)在蛋白復(fù)性過(guò)程中添加一些小分子添加劑，如低濃度的尿素變性劑、精氨酸、分子表面活性劑PEG、糖類(lèi)等。含二硫鍵蛋白復(fù)性時(shí)，自由巰基和二硫化物之間的相互轉(zhuǎn)化是一個(gè)還原氧化過(guò)程，因此必須與適當(dāng)?shù)碾娮庸w和受體聯(lián)系起來(lái)。還原劑可破壞氫鍵并為伸展?fàn)顟B(tài)的肽鏈創(chuàng)造還原性環(huán)境，防止形成非天然二硫鍵或二硫鍵的錯(cuò)配。因此，在含多個(gè)半胱氨酸殘基的蛋白復(fù)性過(guò)程中會(huì)添加一些氧化還原物質(zhì)，如氧化型 ／ 還原型谷胱甘肽、半胱氨酸 ／ 胱氨酸等［8］。

本研究用6 mol ／ L 鹽酸胍溶解包涵體，參考BATISTA 等［9］純化方法，直接將蛋白溶解液以逐滴滴加的方式加至大體積緩沖液中復(fù)性蛋白，獲得可溶性的蛋白質(zhì)。rHq002 含有5 個(gè)二硫鍵，在復(fù)性過(guò)程中未添加任何添加劑，去除變性劑后蛋白質(zhì)仍為可溶狀態(tài)未發(fā)生再聚集。提示在大腸埃希菌誘導(dǎo)表達(dá)的過(guò)程中，重組蛋白可能形成了正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)，僅僅可能是因?yàn)榈鞍走^(guò)量導(dǎo)致分子間發(fā)生聚集而形成了包涵體。由于無(wú)需形成新的二硫鍵，蛋白復(fù)性時(shí)不添加氧化還原物質(zhì)也可復(fù)性成功。因此，包涵體形成的原因也將對(duì)蛋白復(fù)性的方式以及添加劑的使用產(chǎn)生影響。蛋白復(fù)性時(shí)，擬復(fù)性蛋白始終處于低濃度狀態(tài)，應(yīng)給予其充足的時(shí)間和空間，促進(jìn)其正確折疊，避免蛋白分子間的再聚集。本研究結(jié)果表明，復(fù)性時(shí)的蛋白濃度對(duì)蛋白復(fù)性具有重要影響。如果蛋白濃度（包括目的蛋白和雜質(zhì)）過(guò)高，則復(fù)性過(guò)程中更易產(chǎn)生蛋白分子間的聚集現(xiàn)象，或者由于復(fù)性過(guò)程中空間不足導(dǎo)致蛋白的錯(cuò)誤折疊，最終將導(dǎo)致復(fù)性失敗［10］。

多數(shù)研究采用先純化后復(fù)性的方式純化包涵體蛋白，即將包涵體溶解后，在變性條件下親和層析純化蛋白，最后經(jīng)相應(yīng)方法復(fù)性目的蛋白［11-13］。經(jīng)過(guò)純化可去除蛋白溶液的雜蛋白，而雜質(zhì)的去除可減少對(duì)蛋白復(fù)性的干擾，降低復(fù)性蛋白質(zhì)發(fā)生聚集的頻率。本研究前期采用了先純化后復(fù)性的方式，但在復(fù)性過(guò)程中重組蛋白析出，無(wú)法成功復(fù)性。受到BATISTA 等［9］研究的啟發(fā)，我們采用先復(fù)性后純化的方式，成功獲得可溶性并穩(wěn)定存在的目的蛋白。去除變性劑后的重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化濃縮后獲得高純度可溶性重組蛋白。結(jié)果表明，該重組蛋白需要在低濃度及溫和條件下才可復(fù)性，與其他蛋白的純化復(fù)性方式存在差異，這種現(xiàn)象可能與重組蛋白的特性有關(guān)。蛋白是否復(fù)性成功，可溶性是最基本的判斷方法，并不能完全證實(shí)其恢復(fù)蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)。除非進(jìn)行一系列功能性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，或者是獲得蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程的影響因素很多，從包涵體的洗滌、蛋白的變性溶解、蛋白的復(fù)性到蛋白純化等一系列過(guò)程，均直接或間接影響蛋白復(fù)性，蛋白的理化學(xué)性質(zhì)可作為蛋白復(fù)性條件的參考［14］。此外，重組蛋白在大腸埃希菌中誘導(dǎo)形成包涵體的過(guò)程以及包涵體的形成方式同樣也是不能忽略的復(fù)性參考因素。重組蛋白的復(fù)性是復(fù)雜而繁瑣的過(guò)程，涉及許多物理和化學(xué)條件，如氧化還原劑濃度、溫度、pH值、鹽離子濃度、時(shí)間等因素。蛋白復(fù)性純化沒(méi)有固定的方式，由于蛋白性質(zhì)的不同，其純化復(fù)性方式也不相同。應(yīng)根據(jù)不同重組蛋白的性質(zhì)及其包涵體的特性進(jìn)行溶液體系的配制及復(fù)性純化方法的篩選［15］，以達(dá)到最大復(fù)性產(chǎn)率。