王 薇， 薛從建， 陳秋緣， 劉巧燕， 李心忠， 劉 洋，5

熱休克蛋白90(heat shock proteins，HSP90)是一種ATP能量依賴型蛋白質(zhì)分子，主要參與調(diào)控客戶蛋白的活化、折疊等過程，發(fā)揮其分子伴侶的作用。在腫瘤細(xì)胞中，HSP90表達(dá)高于正常細(xì)胞2～10倍，且主要處于活化狀態(tài)[1-3]。許多HSP90的客戶蛋白與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、表皮生長因子受體、人表皮生長因子受體-2、血管內(nèi)皮生長因子、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT等。通過對HSP90活性的抑制就可同時(shí)抑制多種客戶蛋白，從多個(gè)信號通路抑制腫瘤，提高靶點(diǎn)藥物的抗腫瘤活性及減少由單一靶點(diǎn)抑制所引起的耐藥性[4-6]。目前研究最多的是間苯二酚類HSP90N端抑制劑。STA-9090和AT13387是該類代表藥物，均已進(jìn)入臨床[7-8]，其合成中均有中間體5-異丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛(CAS號1071151-44-4，結(jié)構(gòu)見圖1)，而該中間體價(jià)格昂貴且需進(jìn)口。本研究對該中間體的合成工藝進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)[9-10]，為設(shè)計(jì)合成新型間苯二酚類HSP90抑制劑及降解劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5298，上海申生科技有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；超導(dǎo)核磁共振波譜儀(AVANCE Ⅲ，Bruker-BioSpin)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(6410 Triple Quad LC/MS，安捷倫科技有限公司)；數(shù)字熔點(diǎn)儀(WRS-1B，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平(BSA-224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.2 試劑 氫氧化鉀和氧氯化磷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；2,4-二羥基苯乙酮和三乙基硅烷(上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司)；碘甲烷、三氟乙酸、甲基溴化鎂(上海安耐吉化學(xué)有限公司)。以上試劑均為化學(xué)純。

1.2 方法 以2,4-二羥基苯乙酮為原料，對2,4位上的酚羥基進(jìn)行甲基保護(hù)，利用格氏試劑甲基溴化鎂將5位酮變成異丙醇，再利用三乙基硅烷和三氟乙酸脫去羥基，最后通過三氯氧磷和N,N-二甲基甲酰胺制成的Vilsmeier試劑引入甲?；?，得到目標(biāo)中間體5-異丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛，合成路線見圖1。

圖1 5-異丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛合成路線Fig.1 Synthesis route of 5-isopropyl-2,4-dimethoxybenzaldehyde

1.2.1 化合物2的制備 取100 mL圓底燒瓶，將化合物1[2,4-二羥基苯乙酮(5.00 g,32.89 mmol)]溶于N,N-二甲基甲酰胺(9 mL)，加入無水碳酸鉀(9.00 g,65.22 mmol)。將其冷卻至0 ℃，緩慢滴加碘甲烷(6 mL,92.55 mmol)。滴加完畢后升至室溫反應(yīng)2 h。薄層層析(thin layer chromatography,TLC)監(jiān)測反應(yīng)完全后，過濾除去固體，粗濾液用飽和食鹽水洗滌，乙酸乙酯萃取，然后進(jìn)行濃縮，剩余物用硅膠柱色譜層析分離純化(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)，得化合物2共5.85 g，為白色晶狀固體。

1.2.2 化合物3的制備 100 mL雙頸瓶中，加入攪拌子，氮?dú)獗Ｗo(hù)下將化合物2,4-二甲氧基苯乙酮(5 g,27.75 mmol)溶于四氫呋喃(50 mL)中并冷卻至0 ℃，緩慢滴加甲基溴化鎂的四氫呋喃溶液(12 mL,36.00 mmol,3 mol/L),滴加完畢后緩慢升至室溫反應(yīng)16 h。TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，先后加入水(5 mL)、飽和氯化銨溶液(20 mL)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥后過濾除去干燥劑，濃縮后硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)，得化合物3共5.00 g，為無色透明油狀物，產(chǎn)率91.7%。

1.2.3 化合物4的制備 50 mL圓底燒瓶中加入攪拌子，將化合物2-(2,4-二甲氧基苯基)丙-2-醇(3.0 g,15.28 mmol)溶于二氯甲烷(30 mL)中并在冰箱預(yù)冷卻至-10 ℃，加入三乙基硅烷(4.50 g,58.60 mmol)，緩慢滴加三氟乙酸(6.90 g,63.84 mmol)，滴加完畢后緩慢升溫至室溫反應(yīng) 5 h，TLC點(diǎn)板監(jiān)測原料轉(zhuǎn)化完全，停止反應(yīng)。反應(yīng)液濃縮后溶于乙酸乙酯，先后用飽和碳酸氫鈉溶液、鹽水洗滌。有機(jī)相經(jīng)干燥，過濾后濃縮干后得粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析(石油醚)得化合物4共2.72 g，為無色透明油狀物。

1.2.4 化合物5的制備 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將N,N-二甲基甲酰胺(0.43 mL,5.53 mmol)加入二氯甲烷(8.5 mL)并冷卻至0 ℃，緩慢滴加三氯氧磷(0.51 mL,5.59 mmol)，滴加完畢后繼續(xù)在0 ℃下攪拌反應(yīng)0.5 h，加入1-異丙基-2,4-二甲氧基苯(0.77 g,4.27 mmol)的二氯甲烷溶液(5 mL)，反應(yīng)溫度升至20 ℃并攪拌3 h，TLC點(diǎn)板監(jiān)測原料轉(zhuǎn)化完全后冷卻至0 ℃，緩慢加入水(1 mL)終止反應(yīng)，濃縮反應(yīng)液，采用6 N的氫氧化鈉溶液(0.24 g/mL)中和至pH值=7，粗產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相鹽水洗滌，干燥后濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)過柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)得化合物5共0.86 g，為黃色固體粉末。

2 結(jié) 果

2.1 化合物2的表征 得2,4-二甲氧基苯乙酮(5.85 g)，性狀為白色晶狀固體，收率為97.5%。m.p.40.5～41.3 ℃，LC/MS(ESI,m/z):181.1[M+H]+，203.1[M+Na]+。

2.2 化合物3的表征 得2-(2,4-二甲氧基苯基)丙-2-醇(5.00 g)，性狀為無色油狀液體，收率為91.7%。LC/MS(ESI,m/z):197.1[M+H]+，219.1[M+Na]+。

2.3 化合物4的表征 得1-異丙基-2,4-二甲氧基苯(2.72 g)，性狀為無色透明液體，收率為98.9%。LC/MS(ESI,m/z):181.1[M+H]+,203.1 [M+Na]+。

2.4 化合物5的表征 得5-異丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛(0.86 g),性狀為黃色晶體，收率97.7%。m.p. 47.5～47.7 ℃，LC/MS(ESI,m/z):209.0[M+H]+,231.0 [M+Na]+。其核磁譜圖見圖2、3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 10.19 (s, CHO,1H)，7.51 (s, Ar,1H)， 6.71 (s, Ar,1H)，3.94 (s,2OCH3, 6H)，3.13 [p,J=6.9 Hz, -CH(CH3)2, 1H]，1.13 [d,J=6.9 Hz, -CH(CH3)2,6H]。13C -NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 160.47，158.81，156.74，129.75，124.66，115.10， 94.75，55.93，55.45，26.61，22.69。

圖2 5-異丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛核磁氫譜圖Fig.2 1H NMR spectrum of 5-isopropyl-2,4-dimethoxybenzaldehyde

圖3 5-異丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛核磁碳譜圖Fig.3 13C NMR spectrum of 5-isopropyl-2,4-dimethoxybenzaldehyde

3 討 論

本研究以2,4-二羥基苯乙酮為原料，用四步合成了HSP90抑制劑中間體5-異丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛，總產(chǎn)率達(dá)到86.3%。第一步反應(yīng)2,4-二甲氧基苯乙酮合成因碘甲烷易揮發(fā)有毒性，實(shí)驗(yàn)條件改為0 ℃和避光后，收率由原文獻(xiàn)[9]的80%提高到97.5%。第二步格式試劑親核加成反應(yīng)要嚴(yán)格要求做到無水無氧操作，格氏試劑用注射器緩慢加入反應(yīng)體系中，產(chǎn)率為91.7%，與原文獻(xiàn)99%接近。第三步反應(yīng)中三乙基硅烷和三氟乙酸按照原文獻(xiàn)的量進(jìn)行投料后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率極低，而將投料量擴(kuò)大到原文獻(xiàn)的兩倍量后發(fā)現(xiàn)原料完全反應(yīng)，收率由原文獻(xiàn)的93.0%提高到98.9%。第四步反應(yīng)1-異丙基-2,4-二甲氧基苯與DMF在三氯氧磷作用下進(jìn)行Vilsmeier-Haack-Arnold甲?；磻?yīng)，在5位引入醛基得到目標(biāo)化合物5-異丙基-2,4-二甲氧基苯甲醛，該反應(yīng)實(shí)際是芳環(huán)親電取代反應(yīng)。由于2位和4位甲氧基的定位效應(yīng)和空間位阻效應(yīng)影響，甲?；a(chǎn)物主要在5位，而不是3位。

結(jié)果部分目標(biāo)產(chǎn)物的核磁氫譜已標(biāo)注出化學(xué)位移對用的氫，10.19單峰為醛氫，7.51 和6.71 兩個(gè)單峰為芳環(huán)上兩個(gè)氫，3.94單峰為甲氧基上6個(gè)氫，3.33為水峰，3.13為異丙基上仲氫峰，1.13為異丙基上甲基氫峰。13C -NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 160.47為醛基碳，158.81為4位芳碳，156.74為2位芳碳，129.75、124.66及115.10分別為1、6及5位芳碳， 94.75為3位芳碳，55.93和55.45為兩個(gè)甲氧基碳，26.61為異丙基上叔碳峰，22.69為異丙基上兩個(gè)伯碳，氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致。

經(jīng)過優(yōu)化的合成路線操作簡單，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，易純化，適合中試放大生產(chǎn)，為設(shè)計(jì)合成新型間苯二酚類HSP90N端抑制劑和降解劑奠定了良好的基礎(chǔ)。