曹少謙，江 凱，劉 亮,

（1.浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波 315100；2.浙江醫(yī)藥高等專科學校食品學院，浙江寧波 315500）

藍莓酸甜可口，營養(yǎng)豐富，富含花色苷、類黃酮等多種功能活性成分[1?4]。隨著人們對健康生活需求的日益增長，藍莓因其具有明目、護肝、抗癌、抗衰老等多種功效而逐漸受到消費者的青睞[5?9]。但是藍莓因采后易腐爛和發(fā)生褐變而導致其花色苷等功能活性成分降解，嚴重影響了其加工制品的品質，制約了藍莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

花色苷非常不穩(wěn)定，易受pH、溫度、氧、酶、金屬離子和糖等因素的影響而發(fā)生降解[10?13]。雖然花色苷不能直接被多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）氧化，但是花色苷在有多酚類底物和PPO同時存在的情況下會迅速降解，因此，PPO被認為在花色苷的降解中扮演著重要的角色[14?15]。然而，有關藍莓花色苷穩(wěn)定性的研究主要集中在熱處理、超高壓處理等對其穩(wěn)定性的影響上[16?19]，而關于藍莓花色苷耦合氧化降解的報道相對較少，僅Karder對藍莓PPO耦合氧化降解矢車菊素-3-葡萄糖進行了報道，他認為矢車菊素-3-葡萄糖是通過耦合氧化機制與綠原酸或咖啡酸酶促氧化產(chǎn)生的醌形成降解產(chǎn)物而降解[20?22]。但有關花色苷、PPO、底物三者之間的反應量效關系尚待進一步研究。

針對以上問題，本文擬對藍莓花色苷的偶合氧化降解途徑進行研究，闡明花色苷偶合氧化降解過程中的量效反應規(guī)律，為進一步探尋藍莓在貯藏及加工過程中花色苷降解的調控措施提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓 品種園藍，選擇新鮮、無機械損傷的藍莓，貯藏于?18 ℃下備用；乙醇、丙酮、乙酸乙酯、鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、檸檬酸、檸檬酸三鈉、鄰苯二酚、無水硫酸銨、PVPP 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；苯基-瓊脂糖凝膠CL-4B（Phenyl-Sepharose CL-4B） Pharmacia公司。

JJ-2高速組織搗碎機 金壇市淮誠實驗器材廠；UV-1700 SPC紫外可見分光光度計 SHIMADZU公司；90-3型磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠有限公司；5804R冷凍離心機 Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓花色苷的提取分離 參照荔枝表皮花色苷的提取方法[23]。將冰凍的藍莓與丙酮以1:5的固液比進行混合，置于打漿機中打漿。在4 ℃下靜置提取4 h后過濾，濾液通過旋轉蒸發(fā)除去丙酮，所得濃縮液用大孔樹脂柱層析分離純化，收集40%乙醇洗脫組分，再旋轉蒸發(fā)除去乙醇。所得旋蒸液用乙酸乙酯萃取，收集水相并再次旋轉蒸發(fā)濃縮，即得藍莓花色苷提取物，置于4 ℃的貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 花色苷濃度的測定 采用pH示差法[24]。2.0 mL花色苷提取液用pH1.0的緩沖液稀釋至25 mL，另取2.0 mL花色苷提取液用pH4.5的緩沖液稀釋至25 mL，510 nm處測定吸光值A。按下面公式計算含量：

式中，484.82是氯化矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量；24825是氯化矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)；DF為稀釋度。

1.2.3 藍莓PPO提取、分離純化 參照本實驗室提取水蜜桃PPO的方法[25]。在獲得藍莓PPO粗提液后，用Phenyl- Sepharose CL-4B（2 cm×20 cm）柱進行分離純化。上樣液（NH4）2SO4飽和度為35%，流速為2 mL/min，收集50 mmol/L磷酸緩沖液（pH6.8）洗脫下柱液中有酶活的組分，并在此緩沖溶液中透析過夜后備用。

1.2.4 PPO活性測定 采用分光光度法[25]，分別加入1.8 mL磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0）、1 mL 10 mmol/L鄰苯二酚，調零后快速加入0.2 mL酶液，并開始計時，每隔30 s記錄400 nm吸光度值，計時3 min，平行測定3次。以每分鐘吸光值增加0.001為一個酶活性單位。

1.2.5 不同鄰苯二酚濃度對偶合氧化反應的影響在比色皿中分別加入0.2 mL的花色苷溶液（反應體系中的終濃度為54 mg/L）和不同體積的20 mmol/L鄰苯二酚，鄰苯二酚在體系中的終濃度分別為0.67、1、1.33、1.67、2、2.67、3.33 mmol/L，加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH3.5）至2.8 mL，再加入0.2 mL的PPO混合均勻（總反應體系3 mL，15 ℃），在350~600 nm下，以2 min為一個間隔，對反應體系進行掃描，記錄峰值變化。

1.2.6 不同花色苷濃度對偶合氧化反應的影響 在比色皿中加入0.1 mL 20 mmol/L的鄰苯二酚和不同體積的花色苷，花色苷的在體系中的終濃度分別為18、27、40.5、54、81、108、135 mg/L，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH3.5）至2.8 mL，再加入0.2 mL的PPO混合均勻（總反應體系3 mL，反應體系在520 nm處的吸光值在0.15~1.5之間，15 ℃），在350~600 nm下，以2 min為一個間隔，對反應體系進行掃描，記錄峰值變化。

1.2.7 PPO濃度對偶合氧化反應的影響 在比色皿中加入0.2 mL花色苷（反應體系中的終濃度為54 mg/L），0.1 mL 20 mmol/L鄰苯二酚和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH3.5），加入不同體積的藍莓PPO混合均勻（總反應體系3 mL，15 ℃），PPO在體系中的終酶濃度分別為7.5、15、22.5、30、37.5、45 U/mL，在350~600 nm下，以2 min為一個間隔，對反應體系進行掃描，記錄峰值變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel進行統(tǒng)計分析，并計算標準偏差。

2 結果與分析

2.1 花色苷-PPO-鄰苯二酚之間的相互作用

結果表明，在僅有藍莓PPO或鄰苯二酚存在的情況下，藍莓花色苷在1 h內并沒有發(fā)生明顯降解。但在鄰苯二酚與藍莓PPO同時存在時，花色苷開始逐漸降解?；ㄉ?PPO-鄰苯二酚反應體系在不同波長下的吸光值變化如圖1所示，隨著反應的進行，該反應體系在花色苷的特征吸收峰（520 nm）附近的吸光值逐漸降低，說明在鄰苯二酚存在的條件下，PPO與花色苷之間發(fā)生了偶合氧化反應。偶合氧化反應先是由PPO將鄰苯二酚氧化成苯醌，苯醌再與花色苷反應生成無色物質[26]。基于上述理論，在藍莓花色苷的偶合氧化體系中應有兩類主要的反應，一是鄰苯二酚的酶促氧化反應，該反應產(chǎn)物的特征吸收峰在400 nm附近，會導致反應體系在400 nm附近的吸光值不斷增加；二是花色苷與醌類物質的氧化反應，該反應最終導致花色苷不斷被氧化降解。

圖1 鄰苯二酚存在的情況下藍莓花色苷耦合氧化降解體系光譜圖Fig.1 Spectrophotometric recordings for the degradation of blueberry anthocyanins in the presence of catechol and PPO

藍莓花色苷-PPO-鄰苯二酚偶合氧化反應體系在不同波長下吸光值變化研究結果顯示（圖2），反應體系在520 nm處的吸光值降低最快，并形成一個倒峰，此變化由花色苷與醌類物質的氧化反應所致。然而，400 nm處的吸光值雖然在不斷增加，但并沒有在400 nm處觀察到一個正增長的吸光值變化峰，這與前期研究荔枝花色苷的偶合氧化降解反應時所得結果不一致[23]。這可能是由于本研究所用藍莓花色苷為粗提物，是含有多種花色苷以及其他酚類物質的混合物，而在荔枝花色苷的研究中用的是經(jīng)過純化的單一花色苷。

圖2 藍莓花色苷耦合氧化體系不同波長吸光值變化Fig.2 Changes in absorbance of the model system at different wavelengths during the coupled oxidation of blueberry anthocyanins

在藍莓花色苷的耦合氧化降解反應的前20 min內，花色苷的lnC/C0降解曲線為一條直線，說明在這段時間內，花色苷的偶合氧化降解符合一級反應動力學模型。但20 min后，其降解速率大大降低（圖3）。同時，在400 nm處的吸光值的變化在前20 min線性增加，但20 min后，其變化速率略有降低。該結果可能是由于隨著花色苷大量的被耦合氧化降解，花色苷濃度下降，鄰苯二酚與花色苷分子間的碰撞概率下降，導致降解速率逐漸減小所致[23]。

圖3 花色苷的耦合氧化降解與鄰苯二酚的酶促氧化Fig.3 Coupled oxidation of blueberry anthocyanins and enzymatic oxidation of catechol

2.2 鄰苯二酚濃度對偶合氧化反應的影響

鄰苯二酚濃度對偶合氧化降解體系中花色苷降解速率的影響如圖4所示。鄰苯二酚濃度的增加會導致花色苷的降解速率的增加。當鄰苯二酚濃度低于于1.33 mmol/L時，花色苷的降解速率隨著鄰苯二酚濃度的增加而迅速增加；而當鄰苯二酚濃度高于1.33 mmol/L時，鄰苯二酚濃度的變化對花色苷降解速率的影響逐漸變小。

圖4 鄰苯二酚濃度對花色苷降解速率的影響Fig.4 Effect of catechol concentration on coupled oxidation of blueberry anthocyanins

與此同時，鄰苯二酚氧化速率在所選擇的所有濃度范圍內均隨著鄰苯二酚濃度的增加而線性增加（圖5）。這說明在藍莓花色苷的偶合氧化反應體系中，增加鄰苯二酚濃度會導致苯醌生成速率的增加，但這些生成的苯醌并沒有進一步與花色苷發(fā)生反應。其原因可能是：增加鄰苯二酚濃度可能使得鄰苯二酚會與苯醌的反應機率增加，使體系中鄰苯二酚和花色苷會相互競爭與苯醌發(fā)生反應[22]。

圖5 鄰苯二酚濃度對鄰苯二酚氧化速率的影響Fig.5 Effect of concentration of catechol on the oxidation rate of catechol

2.3 花色苷濃度對對偶合氧化反應的影響

當鄰苯二酚濃度不變時，花色苷濃度對對偶合氧化降解體系中花色苷降解速率的影響如圖6所示。隨著體系中初始花色苷濃度的增加，體系中花色苷的降解速率不斷降低。同時，鄰苯二酚的氧化速率隨著花色苷濃度的增加而降低（圖7）。Hemachandran等[27]的研究表明，花色苷可以抑制蘋果PPO的活性，且這種抑制屬于非競爭性抑制模式。本研究中花色苷濃度的增加可能導致藍莓PPO活性被抑制，導致苯醌的生成速率變小，從而導致花色苷降解速率逐漸降低。

圖6 花色苷濃度對花色苷耦合氧化反應速率的影響Fig.6 Effect of concentration of anthocyanins on coupled oxidation of blueberry anthocyanins

圖7 花色苷濃度對鄰苯二酚氧化速率的影響Fig.7 Effect of concentration of anthocyanins on the oxidation rate of catechol

當花色苷濃度大于81 mg/L時，其濃度的增加不再導致鄰苯二酚氧化速率的降低，此時的鄰苯二酚氧化速率趨近與0。這說明在此條件下，體系中所有產(chǎn)生的苯醌幾乎全都與花色苷發(fā)生了偶合氧化反應，所以再進一步增加花色苷濃度，并不會導致降解的花色苷增多，但花色苷濃度的增加使得體系中降解花色苷的相對量變小，所以體系中花色苷的降解速率仍然在降低。

2.4 PPO濃度對偶合氧化反應的影響

如圖8所示，藍莓花色苷偶合氧化降解速率隨著酶濃度的增加而加快，且花色苷降解速率和PPO濃度呈現(xiàn)良好的線性關系。這說明酶濃度的增加導致苯醌的生成量增加，使得能有更多的氧化產(chǎn)物與花色苷發(fā)生偶合氧化反應，從而加快花色苷降解速率。文獻[20,22]分別研究了綠原酸和咖啡酸醌降解花色苷的反應機制，其研究表明當花色苷與底物等摩爾量反應時，反應體系中花色苷的降解速率與綠原酸或咖啡酸的氧化速率之比均為2。這說明當花色苷與底物濃度不變時，花色苷的偶合氧化降解速率與底物的氧化速率成正比，而當酶濃度增加時，底物的酶促氧化速率會線性增加，從而導致了花色苷降解速率的線性增加[23]。

圖8 酶濃度對藍莓花色苷耦合氧化反應速率的影響Fig.8 Effect of concentration of enzyme on coupled oxidation of blueberry anthocyanins

3 結論

本文分別從藍莓中分離提取得到花色苷和PPO，研究了花色苷-PPO-鄰苯二酚的偶合氧化反應機制，鄰苯二酚的酶促氧化生成醌類物質和花色苷與醌類物質的氧化反應是偶合氧化體系中主要的兩類反應。且花色苷的偶合氧化降解符合一級反應動力學模型。同時，本文還探討了花色苷-PPO-鄰苯二酚三者之間的量效反應關系。研究結果表明，在偶合氧化降解體系中，鄰苯二酚、花色苷和PPO濃度均會影響花色苷的降解速率。雖然花色苷的降解速率會隨著鄰苯二酚濃度的增加而增加，但隨著鄰苯二酚濃度的增加，其花色苷的降解速率的增幅卻在逐漸減小?；ㄉ粘跏紳舛仍礁撸浣到馑俾试降?，兩種呈現(xiàn)出較為線性的負相關，而酶濃度的增加會導致花色苷的降解速率線性增加。

根據(jù)實驗結果可以進一步推斷，在藍莓貯藏及加工過程中，藍莓中的PPO會與其組織中的酚類底物結合，產(chǎn)生相應的醌類物質，而這些物質再通過耦合氧化機制導致藍莓花色苷降解，從而最終導致果實或者相關產(chǎn)品的褐變。且其褐變速率與組織中酶的活性、酚類底物以及花色苷含量都有密切的關系。本研究結果有利于進一步揭示藍莓花色苷的降解機制，并為探尋藍莓在貯藏及加工過程中花色苷降解的調控措施提供理論依據(jù)。當然，在后續(xù)的研究中，應進一步利用色譜、液質聯(lián)用以及核磁共振分析等技術手段對耦合氧化產(chǎn)物的結構進行鑒定，從而更深入地闡明藍莓花色苷的降解機制。