高雅鑫，張蒙冉，侯麗真，高 潔，王鳳忠, ，李淑英,

（1.中國農業(yè)科學院農產品加工研究所, 北京 100193；2.塔里木大學生命科學學院, 新疆阿拉爾 843300）

心血管疾病一直是世界上發(fā)病率和死亡率最高的慢性疾病，該趨勢持續(xù)增長并趨于年輕化[1]?！吨袊难芘c健康疾病報告（2019）》顯示，我國現有心血管疾病患病人數為3.3億，每5例死亡病例中就有2例由心血管疾病引起，占比高達40%[2]，其中血栓是引起心血管疾病人群死亡和致殘的首要原因[3]。目前治療血栓性心血管疾病的臨床藥物多以尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶等纖溶酶原激活劑為主，但這類藥物需靜脈注射，存在半衰期短、毒副作用大、價格昂貴等缺點，不易成為大眾可普遍消費的藥品[4]。

納豆（Natto）是由經枯草芽孢桿菌發(fā)酵蒸煮過的大豆制成的一種功能性食品，因富含納豆激酶而具有防治心血管疾病的功效[5-6]。納豆激酶具有多效溶栓功效，主要表現為可以直接溶解血栓，也可以激活機體的血栓溶解系統(tǒng)并抑制機體的凝血系統(tǒng)[7]。與臨床藥物相比，具有可口服、半衰期長、生產成本低廉、無毒副作用等優(yōu)點[8-9]。因此，納豆制品在日本一直被作為有效預防心血管疾病的最佳食品而備受推崇。日本國立癌癥中心研究結果表明常吃納豆的人群癌癥死亡率比不常吃的人群降低了10%[10]。世界衛(wèi)生組織公布的數據顯示，我國心血管疾病的發(fā)病率是日本的75倍。中國人的飲食追求色香味俱全，因而，獨具“氨臭味”的納豆一直未能在中國消費市場普及。

基于納豆在心血管疾病防治方面的優(yōu)點，領域內專家也一直致力于從事相關研究，但工作重心還是側重于挖掘優(yōu)勢菌種，提高納豆激酶的活性和穩(wěn)定性。同時結合中國人的飲食需求，也陸續(xù)開展了部分納豆風味改良方面的工作。近年來隨著檢測分析技術的進步，領域內專家針對納豆的不良風味開展了物質鑒定工作，以期從根本上改良納豆風味，開發(fā)符合中國人口味且富含納豆激酶的產品?；诖耍菊撐木图{豆特有不良風味“改良”和“物質鑒定”兩方面的研究進展進行綜述，為納豆在我國的市場推廣奠定理論基礎。

1 納豆風味改良

為提高納豆在中國的接受度，改良其風味具有重要的研究意義。針對不良風味的產生，研究者的主要關注點在優(yōu)化和改變發(fā)酵菌種、控制工藝和添加調味料三個方面，以彌補納豆風味的不足。

1.1 菌種的選擇

1.1.1 篩選優(yōu)良菌株 納豆的不良風味是在枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆過程中形成的，菌株之間的個體化差異會引起不良風味物質含量的不同，因而篩選一株優(yōu)良的枯草芽孢桿菌是解決不良風味的重要舉措。劉彥敏等[11]從豆醬、豆豉等我國傳統(tǒng)發(fā)酵大豆制品中篩選得到多株枯草芽孢桿菌，均具有發(fā)酵大豆制作納豆和產納豆激酶的能力，同時獲得了多種品質風味俱佳的本地化納豆。TAKEMURA等[12]敲除了與支鏈短脂肪酸（Branched-chain short fatty acids，BCFAs）合成相關的基因，篩選培育風味優(yōu)良的枯草芽孢桿菌，緩減了納豆的不良風味。

1.1.2 添加風味菌株 在枯草芽孢桿菌的基礎上，通過與其他菌株進行混菌發(fā)酵改良風味，如乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌等產酸菌及毛霉、酵母等真菌[13-15]，其產生的酶類作用于納豆中的不良風味物質，綜合提升納豆的風味品質。JHAN等[16]通過枯草芽孢桿菌和保加利亞乳桿菌的共培養(yǎng)，所得產品不僅風味良好，還含有抗氧化因子和大量潛在的益生菌。何人可等[17]采用嗜熱鏈球菌對納豆進行二次發(fā)酵，并優(yōu)化了二次發(fā)酵工藝，使得納豆不良風味下降。高澤鑫等[15]以發(fā)芽的黃豆為原料，將毛霉擴大培養(yǎng)后，再與枯草芽孢桿菌按照一定菌種比混合發(fā)酵，得到的豆豉產品不良風味明顯減少。也有研究通過添加釀酒酵母使納豆不良風味降低的同時，還產生淡淡的醇香[18]。可見添加風味菌株的混合發(fā)酵可以有效提高納豆的感官品質，改善納豆的不良風味。

1.2 工藝的控制

1.2.1 調整原料碳氮比 發(fā)酵原料中含氮量是影響納豆風味的決定因素，所以有學者嘗試通過改變豆類品種或添加外來碳源的方式來改良納豆的風味[19]。有研究表明蠶豆中淀粉含量較高，不需要添加碳源，便能實現高效發(fā)酵，其口感和風味均得到了改善[20]，故而，蠶豆、蕓豆、紅豆、鷹嘴豆等豆類逐漸被開發(fā)為新型納豆[20-21]。張杰等[22]將糯米和小黃豆按2:8的比例混合發(fā)酵，有效減少了游離氨的過度產生，改良了納豆風味。董岳峰等[23]選擇薏米與大豆搭配發(fā)酵薏米納豆，薏米糖質含量比大豆高，調整了含氮比例，降低了游離氨的同時也改善了產品口感。因此，采用不同品種的豆類或添加其它富含碳水化合物的雜糧，可實現高效發(fā)酵，同時改善其原有風味和口感。

1.2.2 優(yōu)化發(fā)酵條件 納豆的營養(yǎng)品質和感官風味與發(fā)酵工藝直接相關，在不同工藝條件下可產生極為不同的質地與風味。工藝優(yōu)化多從大豆前處理、發(fā)酵和后熟三個階段展開研究，涉及到的工藝環(huán)節(jié)包括原料浸泡時間、料液比、蒸煮方式及溫度和時間、接菌溫度、接菌量、發(fā)酵及后熟時間、儲存溫度和時間等[19,24]。關茵等[25]對原料浸泡的料液比、蒸煮溫度、接菌量及發(fā)酵時間等進行了優(yōu)化，以氨氣味為衡量指標，獲得了不良風味最少的發(fā)酵工藝。也有研究通過增加大豆含水量為60%，調整大豆厚度為3 cm等條件，降低了納豆中游離氨的產生[26]。通過優(yōu)化上述條件，使菌種保持最佳的生長狀態(tài)，調控微生物與大豆的互作過程，進而影響不良風味物質的形成，以制作風味及納豆激酶等營養(yǎng)功能指標均良好的納豆。

1.3 調味品的添加

1.3.1 鮮食納豆的調味 為了滿足消費者對口感風味以及營養(yǎng)健康的雙重需求，現有納豆主要是通過添加調味劑和香料等緩和其不良風味。主要有兩種添加輔料的方式：一種是在發(fā)酵過程中加入不同的調味料，如用花椒、十三香、咖喱粉等調料水浸泡大豆，或者在后熟階段加入食鹽、辣椒、茴香等調料，不僅有效掩蓋了納豆的不良風味，也賦予了其易被消費者接受的獨特風味[27]；一種是以新鮮納豆為基礎，附帶粉包或醬包一起銷售，涉及調味品（芥末、咖喱、孜然等）、調味醬（芝麻醬、糖豆醬、辣椒醬等）以及果醬（芒果、藍莓、草莓等），食用時攪拌均勻即可[26,28]，按自己喜好調制口味各異的風味鮮食納豆。

1.3.2 鮮食納豆的深加工 隨著冷藏時間的延長，鮮食納豆的活菌數及部分生物活性物質均有所降低，口感和風味也會逐漸下降，有研究證明冷藏3 d是其最佳食用時間[29]，冷藏時間較短，嚴重影響了產品的接受度和市場的銷售。因此，衍生出經過干燥、粉碎深加工后制得的納豆系列產品，以納豆烘干粉和納豆凍干粉為主，既能避免其在冷藏過程中由于菌株代謝出現不良風味加重的現象，又能延長保質期[30]，納豆粉可以用合適溫度的熱水直接沖調飲用[31]；也可以結合膠囊和壓片工藝，復配木糖醇、甘露醇、奶粉等多種輔料，開發(fā)不同系列的納豆膠囊和納豆糖果、奶片等咀嚼片[32-33]；又或者研制成中國人喜愛的糕點，搭配綠茶粉、木糖醇、海藻糖、食用油，加工成茶香納豆糕[34]，更貼合中國消費者的飲食習慣和口味偏好。

2 納豆不良風味物質鑒定

雖然大豆原料自身帶有豆腥味，包括1-辛烯-3-醇、己醛、2-戊基呋喃等化合物[35-36]，但是發(fā)酵可以有效降低豆制品的豆腥味，賦予其新的感官風味[37]。因此，納豆不良風味源于微生物與大豆的互作，并有學者證明在蛋白酶的作用下，蛋白質會降解為小肽和氨基酸，但氨基酸會進一步降解產生不良風味物質[38]。不斷有研究分析并鑒定納豆中不良風味物質，主要是異丁酸甲酯、氨、2-甲基丁酸、吡嗪等揮發(fā)性化合物[39-40]。近年來，LIU等[41]研究表明 2,5-二甲基吡嗪，2,3,5-三甲基吡嗪，2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-甲基-6-乙基吡嗪對納豆風味有很大貢獻。KEITAROU等[42]研究證明異戊酸、三甲基吡嗪對枯草芽孢桿菌發(fā)酵食品的風味有很大貢獻。HONG等[43]認為在納豆發(fā)酵過程中，合成的異丁酸和異戊酸引起了納豆中難聞的氣味。因此，納豆中不良風味物質主要歸類為游離氨、吡嗪和BCFAs，這些物質均與氨基酸代謝有關，例如，谷氨酸和精氨酸等涉及游離氨的釋放[44]，絲氨酸和蘇氨酸等涉及吡嗪的形成[45]，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸是支鏈醛和BCFAs的前體化合物[46]。

2.1 游離氨

游離氨是一種有刺激性臭味的氣體，類似于臭雞蛋和蔬菜腐敗的味道，也是納豆中公認的不良風味?？莶菅挎邨U菌代謝產游離氨的主要途徑是聯合脫氨基作用和轉氨作用，而非脫羧作用[47]。已有學者證實，枯草芽孢桿菌的產游離氨代謝至少與5種氨基酸有關[48]：在蛋白酶的作用下，精氨酸分解轉化為鳥氨酸，同時生成尿素，再經尿素酶降解產游離氨；同樣，天冬酰胺由酶催化產生天冬氨酸并釋放游離氨，在天冬氨酸酶催化下繼續(xù)產生延胡索酸和游離氨。然而，枯草芽孢桿菌產氨主要是通過谷氨酸代謝，谷氨酸脫氫酶（GDH）是整個代謝的關鍵酶，在該菌株內，GDH由rocG基因和gudB基因編碼，致力于谷氨酸的降解，同時產生游離氨，不參與谷氨酸的合成[49]，并且在氮源豐富的發(fā)酵基質下，編碼GDH的rocG基因很活躍[50]，因此，游離氨確為引起納豆不良風味的物質，也印證了“發(fā)酵原料中含氮量的差異和菌種之間的個體差異會產生不同程度氨臭味的納豆產品”的事實。

2.2 吡嗪類化合物

吡嗪是傳統(tǒng)發(fā)酵食品風味的重要貢獻者，可以促進食品的整體香氣，如中國白酒，及以大豆和可可豆為基礎的發(fā)酵食品，主要為2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪[51]。GC-O嗅聞分析中對2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪的風味整體描述為“焙烤味、堅果味、霉味和泥土味”[52]，該類化合物閾值較低，在其含量較低的情況下就能呈現優(yōu)良風味，含量過高可能會呈現“霉味、泥土味”等不良風味[53]，因而，極可能由于2,5-二甲基吡嗪在納豆中合成量過多，遠遠超過其閾值而引起納豆制品產生不愉快氣味。CHRISTIAN等[45]已明確枯草芽孢桿菌中2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪的主要合成途徑，主要涉及蘇氨酸的合成與降解（圖1）。天冬氨酸代謝合成蘇氨酸，經L-蘇氨酸-3-脫氫酶（TDH）催化產生氨基丙酮，通過氧化、環(huán)化等非酶促反應生成2,5-二甲基吡嗪，而氨基丙酮還可以代謝生成丙酮酸，通過縮合生成α-乙酰乳酸，再脫羧產生乙偶姻，進而被分泌到胞外，和游離氨發(fā)生非酶促反應，生成四甲基吡嗪[54]。整個發(fā)酵體系在不添加任何前體物質（蘇氨酸、乙酰丙酮）的前提下，主要存在2,5-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪，幾乎沒有四甲基吡嗪，2,3,5-三甲基吡嗪的合成機制與2,5-二甲基吡嗪類似[55]；此外，氧氣的有效利用，會引起吡嗪類化合物的過量合成[34]，枯草芽孢桿菌是一種好氧菌，發(fā)酵體系內氧氣充足的時候代謝加速，可能引起了納豆中吡嗪類化合物大量聚集，進而使納豆產生風味劣變。

圖1 2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪合成的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways for the synthesis of 2,5-dimethylpyrazine and tetramethylpyrazine

2.3 支鏈短脂肪酸

支鏈短脂肪酸（BCFAs）一般是碳原子數小于6的有機脂肪酸，主要包括異丁酸、異戊酸、異己酸、2-甲基丁酸等。GC-O嗅聞分析中對異戊酸等BCFAs的風味描述為“銀杏果臭味、酸味、刺激的酸敗味”[56]，佐證了BCFAs與納豆的不良風味有關。BCFAs主要通過支鏈氨基酸的分解代謝產生，即亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸，該代謝通路涉及的合成基因和關鍵酶在不同種屬微生物中差異較大。在枯草芽孢桿菌內，β-酮?；??；d體蛋白合酶III（FabH）是合成BCFAs的關鍵酶[57]，此外，支鏈α-酮脫氫酶復合物（BCKDC）也被證實為BCFAs合成代謝途徑的一種關鍵限速酶[58]。但在不同的枯草芽孢桿菌中其合成的關鍵基因和表達差異極為顯著，因此支鏈氨基酸對不良風味的貢獻與菌株本身有一定的相關性。

3 應用與展望

目前預防和治療心血管疾病的納豆產品越來越受到關注，但由于其特有的不良風味，仍然不能被我國人群廣泛接受。因此，采用合適的風味改良方式暫時緩解納豆風味問題，如改變發(fā)酵菌種、優(yōu)化工藝等，以初步滿足中國人食用納豆的基本需求，是納豆進入我國市場的重要舉措。但是，從根本上明確納豆不良風味的物質基礎及其產生途徑，是有效控制和消除納豆不良風味的根本所在。隨著多組學分析技術及遺傳操作手段的發(fā)展，使得解決上述問題并通過靶向控制發(fā)酵過程中不良風味物質合成相關基因的表達和調控成為可能?？梢姡{豆產品中風味的定向改良具有很好的發(fā)展前景。