補(bǔ)陽還五湯對(duì)rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Ang/Tie-2蛋白表達(dá)的影響

張 婷，齊 婧，劉 侃，王 玥

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1. 腦病一科；2.神經(jīng)內(nèi)科；3.疼痛康復(fù)科， 湖南 長沙 410007)

腦血管疾病是威脅人類生命安全的疾病之一。急性腦缺血損害的區(qū)域可分為腦缺血核心區(qū)和缺血半暗區(qū)。腦缺血發(fā)生后，核心缺血區(qū)的腦組織會(huì)發(fā)生不可逆損傷，神經(jīng)元細(xì)胞在很短的時(shí)間內(nèi)會(huì)出現(xiàn)壞死，而缺血半暗區(qū)的腦組織相對(duì)輕度損傷，神經(jīng)細(xì)胞則以凋亡為主[1]。神經(jīng)元有恢復(fù)的潛力，如果能夠及時(shí)阻止缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，可明顯的改善腦梗死以及患者的預(yù)后[2]。因此，尋找有效的藥物改善腦缺血后神經(jīng)受損，成為目前研究的熱點(diǎn)問題。補(bǔ)陽還五湯是中醫(yī)治療缺血性腦血管疾病的傳統(tǒng)經(jīng)典方劑，具有抑制血栓形成、擴(kuò)張腦血管、抗氧化損傷、降低血粘度和增加腦血流量等藥理作用[3]。相關(guān)研究表明，補(bǔ)陽還五湯在治療缺血性腦血管疾病中效果顯著[4]。血管生成素(Ang)是血管生長因子家族中的一員，在腦缺血后可以促進(jìn)血管新生，抑制炎癥反應(yīng)和減少氧自由基的產(chǎn)生[5]。Tie-2是一種常見的血管內(nèi)皮特異性的酪氨酸激酶受體[6]。Ang-1可維持血管內(nèi)皮穩(wěn)定，促進(jìn)血管成熟。作為Ang-1的功能拮抗劑，Ang-2可破壞血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)，與內(nèi)皮細(xì)胞增殖密切相關(guān)[7]。Ang與其特異性受體 Tie-2在缺血半暗帶血管重構(gòu)、側(cè)枝循環(huán)的形成中起著重要作用[8]。所以在這項(xiàng)研究中，通過補(bǔ)陽還五湯干預(yù)rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及Ang/Tie-2蛋白表達(dá)，有助于探討補(bǔ)陽還五湯對(duì)血管生成的機(jī)制，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試藥和儀器

1.1.1 動(dòng)物 雌性和雄性的健康Wistar大鼠，體重180～210 g，購自于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(湘)2020-0017，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(湘)2020-0009，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員上崗證號(hào)為1901271。動(dòng)物飼養(yǎng)于20～23 ℃，濕度為45%～70%的動(dòng)物房中。

1.1.2 試藥 補(bǔ)陽還五湯處方源自杰作《醫(yī)林改錯(cuò)》，藥方組成為黃茂120 g、赤芍4.5 g、當(dāng)歸尾6 g、紅花3 g、地龍3 g、川芎3 g、地龍3 g。方中藥材購自湖南省藥材公司飲片加工廠，由湖南中醫(yī)藥研究院鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。由處方推算，按照體質(zhì)量60 kg計(jì)算，人與大鼠的換算系數(shù)為6.25。TRIzol試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào):C502017)，山羊抗兔IgG(上海山浦化工有限公司，貨號(hào):EPR100209)，Ang-1、Ang-2、Tie-2抗體(美國Chemico公司，貨號(hào):SC361784、SC361359、SC362123)。

1.1.3 儀器 離心機(jī)(德國Sigma公司)；超低溫冰箱(Eppendorf中國有限公司)；酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和建模 將78只大鼠隨機(jī)分為6組，每組13只，分別為正常組、模型組、rt-PA組、rt-PA+補(bǔ)陽還五湯低劑量組(rt-PA+補(bǔ)1組)、rt-PA+補(bǔ)陽還五湯中劑量組(rt-PA+補(bǔ)2組)、rt-PA+補(bǔ)陽還五湯高劑量組(rt-PA+補(bǔ)3組)。除了正常組，其他5組參照包新杰等人的方法[9]建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型(MCAO)，術(shù)前12 h禁食禁水，采用3 mL/kg水合氯醛(10%)腹腔麻醉，待麻醉完成將動(dòng)物放在操作臺(tái)上仰臥，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈，采用動(dòng)脈夾結(jié)扎頸內(nèi)、頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在從頸總動(dòng)脈切口插入魚線，插入18 mm的深度，遇阻力時(shí)停止，在大腦中動(dòng)脈起始端堵死大腦中動(dòng)脈，再將頸總動(dòng)脈連同魚線一起結(jié)扎，縫合皮膚。

1.2.2 給藥 造模結(jié)束30 min后，rt-PA組、rt-PA+補(bǔ)1組、rt-PA+補(bǔ)2組、rt-PA+補(bǔ)3組的大鼠尾靜脈按照10 mg/kg注射rt-PA。注射rt-PA 24 h后，正常組、模型組、rt-PA組給予等量的蒸餾水灌胃，灌胃容積為1 mL/100 g。補(bǔ)陽還五湯中藥方組成為黃茂120 g、赤芍4.5 g、當(dāng)歸尾6 g、紅花3 g、地龍3 g、川芎3 g、地龍3 g。1/2的方劑為rt-PA+補(bǔ)1組(7.42 g/kg)，原方劑為rt-PA+補(bǔ)2組(14.84 g/kg)，方劑的2倍rt-PA+補(bǔ)3組(29.69 g/kg)，各組藥物混合溶于沸騰的蒸餾水中，早晚各1 mL灌胃治療，連續(xù)14 d。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 于用藥14 d后，給予大鼠2%的戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，斷頭，取梗死區(qū)腦組織，多聚甲醛固定20 min，石蠟包埋，切成2 μm的切片，酒精梯度，加入50 μL的TUNEL檢測(cè)液，常溫孵育1 h，PBS沖洗2次，每次10 min，使用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，對(duì)藍(lán)色熒光細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 real-time PCR法檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3、Ang-1、Ang-2、Tie-2 mRNA的表達(dá) 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，立即切除腦組織，用Trizol試劑從梗死側(cè)腦組織中提取總RNA。以2 μL總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以5 μL cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為95 ℃5 min、95 ℃ 15 s、82 ℃ 60 s、65 ℃ 20 s,45個(gè)循環(huán),采用2-ΔΔCT計(jì)算Bcl-2、Bax、Caspase-3、Ang-1、Ang-2、Tie-2 mRNA水平。引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 按照試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，取梗死的腦組織，依次浸入二甲苯凈化，石蠟包埋，成5 μm厚的連續(xù)切片，組織切片迅速脫蠟，水化，熱抗原修復(fù)，3% H2O2去離子水，孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗3次，滴加稀釋后的待檢測(cè)抗體，室溫孵育120 min,滴加lgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育15 min,DAB 逐個(gè)顯色，蒸餾水反復(fù)沖洗，蘇木精復(fù)染，水化，清洗，中性膠貼裝，陰性對(duì)照用正常羊血清和PBS代替一抗。光學(xué)顯微鏡下觀察待測(cè)蛋白表達(dá)情況，400倍鏡下選5個(gè)不重復(fù)視野計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每個(gè)視野陽性細(xì)胞的平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況 對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率為(0.79±0.05)%，模型組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率為(5.04±0.27)%，rt-PA組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率為(3.57±0.19)%，rt-PA+補(bǔ)1組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率為(2.93±0.16)%，rt-PA+補(bǔ)2組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率為(2.57±0.13)%，rt-PA+補(bǔ)3組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率為(1.38±0.11)%，模型組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA+補(bǔ)1組、rt-PA+補(bǔ)2組和rt-PA+補(bǔ)3組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率顯著低于rt-PA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A：正常組；B：模型組；C：rt-PA組；D：rt-PA+補(bǔ)1組；E：rt-PA+補(bǔ)2組；F：rt-PA+補(bǔ)3組。

2.2 大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá) 模型組中Bcl-2 mRNA的表達(dá)顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA組中Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA+補(bǔ)1組、rt-PA+補(bǔ)2組和rt-PA+補(bǔ)3組中Bcl-2 mRNA的表達(dá)顯著高于rt-PA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組中Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA組中Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA+補(bǔ)1組、rt-PA+補(bǔ)2組、rt-PA+補(bǔ)3組中Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)顯著低于rt-PA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)的影響

2.3 大鼠神經(jīng)細(xì)胞Ang-1的表達(dá)情況 模型組中Ang-1 mRNA的表達(dá)和Ang-1陽性細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA組中Ang-1mRNA的表達(dá)和Ang-1陽性細(xì)胞數(shù)量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA+補(bǔ)1組、rt-PA+補(bǔ)2組和rt-PA+補(bǔ)3組中Ang-1 mRNA的表達(dá)和Ang-1陽性細(xì)胞數(shù)量顯著高于rt-PA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3和圖2。

A：正常組；B：模型組；C：rt-PA組；D：rt-PA+補(bǔ)1組；E：rt-PA+補(bǔ)2組；F：rt-PA+補(bǔ)3組；×40。

表3 補(bǔ)陽還五湯對(duì)Ang-1的表達(dá)的影響

2.4 大鼠神經(jīng)細(xì)胞Ang-2的表達(dá)情況 模型組中Ang-2 mRNA的表達(dá)和Ang-2陽性細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA組中Ang-2 mRNA的表達(dá)和Ang-2陽性細(xì)胞數(shù)量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA+補(bǔ)1組、rt-PA+補(bǔ)2組和rt-PA+補(bǔ)3組中Ang-2 mRNA的表達(dá)和Ang-2陽性細(xì)胞數(shù)量顯著高于rt-PA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表4和圖3。

表4 補(bǔ)陽還五湯對(duì)Ang-2的表達(dá)的影響

A：正常組；B：模型組；C：rt-PA組；D：rt-PA+補(bǔ)1組；E：rt-PA+補(bǔ)2組；F：rt-PA+補(bǔ)3組；×40。

2.5 大鼠神經(jīng)細(xì)胞Tie-2的表達(dá)情況 模型組中Tie-2 mRNA的表達(dá)和Tie-2陽性細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA組中Tie-2mRNA的表達(dá)和Tie-2陽性細(xì)胞數(shù)量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rt-PA+補(bǔ)1組、rt-PA+補(bǔ)2組和rt-PA+補(bǔ)3組中Tie-2 mRNA的表達(dá)和Tie-2陽性細(xì)胞數(shù)量顯著高于rt-PA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表5和圖4。

表5 補(bǔ)陽還五湯對(duì)胞Tie-2的表達(dá)的影響

A：正常組；B：模型組；C：rt-PA組；D：rt-PA+補(bǔ)1組；E：rt-PA+補(bǔ)2組；F：rt-PA+補(bǔ)3組；×40。

3 討論

急性腦梗死是指不同原因引起的腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦部組織缺血、缺氧性壞死，致使神經(jīng)功能缺損[10]。對(duì)于該病的發(fā)生采取快速和有效的治療對(duì)于改善預(yù)后具有重要的作用。早期靜脈溶栓治療急性腦梗死恢復(fù)血流的首要措施，能夠有效減少腦梗死面積，改善神經(jīng)功能缺損，使致殘率大大的降低。重組織纖溶酶原激活物(t-PA)是廣泛的常用靜脈溶栓藥物，t-PA可以使無活性的前體纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，溶解血凝塊中的纖維蛋白，從而達(dá)到血管再通的作用[11]。但溶栓的治療常常會(huì)導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生，如灌注損傷、出血轉(zhuǎn)化或者腦內(nèi)出血等。因此，溶栓藥物與其他中藥的聯(lián)合治療，成為當(dāng)前治療急性腦梗死的熱門話題。腦梗死屬于“中風(fēng)”范疇，是由于氣血逆亂、陰陽失調(diào)引起的半身不遂、不省人事、言語不利、偏身麻木等為主要表現(xiàn)的一種病癥[12]。補(bǔ)陽還五湯是治療中風(fēng)的傳統(tǒng)名方，改善神經(jīng)功能缺失、增加腦血流量、減少梗死面積，抗自由基、抑制神經(jīng)元損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抗炎癥因子等方面發(fā)揮著重要的作用[13]。

腦梗死缺氧缺血性損傷后，腦血管系統(tǒng)側(cè)支循環(huán)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元再生恢復(fù)過程中起著重要的作用。許多血管生成因子與新血管的形成有著密切的關(guān)系，其中血管生成素是促進(jìn)血管形成的重要血管生成因子。Ang-1，Ang-2及Tie-2被認(rèn)為是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Ang-2與Ang-1有60%的同源性，在生理狀態(tài)下均受到嚴(yán)格的調(diào)控[14]。Tie-2廣泛表達(dá)于不同類型的血管內(nèi)皮細(xì)胞上。Ang / Tie-2系統(tǒng)在調(diào)節(jié)新血管的生長、形成和成熟中起著重要作用[15]。

本研究通過低中高劑量的補(bǔ)陽還五湯對(duì)rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠進(jìn)行灌胃治療，驗(yàn)證補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Ang/Tie-2蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯中劑量組和補(bǔ)陽還五湯高劑量組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率顯著低于rt-PA組；補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯中劑量組和補(bǔ)陽還五湯高劑量組中Bcl-2 mRNA的表達(dá)顯著高于rt-PA組，補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯中劑量組和補(bǔ)陽還五湯高劑量組中Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)顯著低于rt-PA組；補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯中劑量組和補(bǔ)陽還五湯高劑量組中Ang-1的表達(dá)顯著高于rt-PA組；補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯中劑量組和補(bǔ)陽還五湯高劑量組中Ang-2的表達(dá)顯著高于rt-PA組；補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯中劑量組和補(bǔ)陽還五湯高劑量組中Tie-2的表達(dá)顯著高于rt-PA組。從而表明，補(bǔ)陽還五湯能夠降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率，提高Bcl-2的表達(dá)，降低Bax和Caspase-3的表達(dá)，同時(shí)提高Ang-1、Ang-2和Tie-2的表達(dá)和陽性細(xì)胞數(shù)量，尤其是高劑量的補(bǔ)陽還五湯最為明顯。Bcl-2、Bax和Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，Bcl-2在細(xì)胞凋亡過程中起著抑制的作用[16]。當(dāng)Bax的表達(dá)增加能夠引起細(xì)胞凋亡[17]，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，通過降解細(xì)胞內(nèi)底物激活細(xì)胞凋亡通路，引起細(xì)胞凋亡[18]。

Ang調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞層向多細(xì)胞毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，當(dāng)Ang-1與其受體Tie-2結(jié)合后，Tie-2在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)活化，促進(jìn)血管的重構(gòu)和成熟[19]。相關(guān)研究表明，Ang-1不僅參與血管完整性的維持，還可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[20]。Ang-1還能抑制內(nèi)皮細(xì)胞通透性，防止微血管滲漏[21]。Ang-2 與 Tie-2 受體結(jié)合能競(jìng)爭(zhēng)性拮抗 Ang-1 與 Tie-2 受體的結(jié)合，抑制 Tie-2 受體的磷酸化，競(jìng)爭(zhēng)性抑制 Ang-1 的血管穩(wěn)定性作用。Ang-2對(duì)血管生成的作用與血管生成因子VEGF有關(guān)，當(dāng)VEGF表達(dá)時(shí)，Ang-2會(huì)抑制Ang-1誘導(dǎo)的Tie-2受體磷酸化，導(dǎo)致血管生成和重構(gòu)，促進(jìn)新毛細(xì)血管的形成[22]。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯對(duì)rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有抑制作用，同時(shí)能夠促進(jìn)Ang-1、Ang-2、Tie-2 mRNA和陽性細(xì)胞數(shù)量的表達(dá)，為今后臨床急性腦梗死藥物的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。