李紹軍，雷 益，易文全，郝衛(wèi)剛，高元平

(眉山市人民醫(yī)院 1.消化內(nèi)科；2.胃腸外科，四川 眉山 620010)

食管癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其中以食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)最為常見(jiàn)，在中國(guó)ESCC具有較高的發(fā)病率和致死率[1]。目前主要通過(guò)手術(shù)和放化療對(duì)ESCC患者進(jìn)行治療，然而術(shù)后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，長(zhǎng)期放化療導(dǎo)致的耐藥性，使患者5年生存率并未有顯著提高[2]。因此，探討與ESCC發(fā)生有關(guān)機(jī)制可能為改善ESCC預(yù)后提供理論依據(jù)。miRNA是一種內(nèi)源性高度保守的單鏈小分子非編碼RNA，其異常表達(dá)在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在肝癌、卵巢癌等多種腫瘤中呈低表達(dá)狀態(tài)，上調(diào)其表達(dá)后可抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，可能是一種潛在的抑癌基因[4-6]。miRNA通過(guò)特異性靶向結(jié)合mRNA參與細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程及疾病的發(fā)生發(fā)展[7-8]。研究表明腺苷酸激酶(Adenylate kinase 4，AK4)受miR-199a-3p調(diào)控[9]，且AK4與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10-11]，而有關(guān)ESCC中AK4的作用目前還少有研究。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)ESCC組織中miR-199a-3p、AK4的表達(dá)，并分析二者與ESCC患者臨床病理特征間的關(guān)系，可能為ESCC的預(yù)后預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月至2018年6月本院“內(nèi)鏡下粘膜剝離術(shù)(ESD)”留存的ESCC組織標(biāo)本72例，及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本(距離ESCC組織5 cm以上)72例，將收集到的ESCC組織和癌旁組織均平均分為兩部分，一部分置于-80℃冰箱保存，另一部分存于10%中性福爾馬林中，用于制作石蠟標(biāo)本。納入研究對(duì)象中男60例，女12例，年齡40～68歲，平均年齡(58.37±9.15)歲，所有患者均經(jīng)胃鏡活檢診斷為ESCCT1期[12]；患者治療前符合ESD治療指南；術(shù)前均未進(jìn)行放射線治療及化療方式治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝、腎等重大臟器功能不全者；②合并患有其他惡性腫瘤者；③不同意參與此次研究者。

患者病變部位位于食管上段有7例，食管中段有45例，位于食管下段的有20例；根據(jù)分化程度分為高分化4例，中分化52例，低分化16例；根據(jù)病變浸潤(rùn)深度分為粘膜內(nèi)癌55例，其中M1期18例，M2期10例，M3期27例，粘膜下層癌17例，均為SM1期。研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 試劑及儀器 RNA提取試劑盒(DP761)，天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(DRR037A)，TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(RR420A)，日本TaKaRa公司；引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。兔抗人AK4單抗(ab131327)，Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)(ab6721)，英國(guó)abcam公司。二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(ZLI-9017)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。NanoDrop 2000分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR法檢測(cè)ESCC組織及癌旁組織中miR-199a-3p、AK4 mRNA的表達(dá) RNA提取試劑盒提取ESCC組織及癌旁組織RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-199a-3p的表達(dá)水平，反應(yīng)條件為：95℃ 60s，95℃30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。分別以U6、GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算癌組織及癌旁組織中miR-199a-3p、AK4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。miR-199a-3p相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算：ΔΔCt=(CtmiR-199a-3p-CtU6)觀察-(CtmiR-199a-3p-CtU6)對(duì)照；AK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算：ΔΔCt=(CtAK4 mRNA-CtGAPDH)觀察-(CtAK4 mRNA-CtGAPDH)對(duì)照。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ESCC及癌旁組織中AK4的表達(dá) 將ESCC組織和癌旁組織石蠟包埋，制作石蠟標(biāo)本。石蠟標(biāo)本進(jìn)行4μm切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)，加兔抗人AK4一抗，4℃孵育過(guò)夜，加入山羊抗兔lgG H&L二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精短暫分化后，脫水、透明、封片。

1.3.3 陽(yáng)性結(jié)果判定 顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野進(jìn)行觀察，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色為陽(yáng)性染色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞占比<5%(0分)，5%～25%(1分)，26%～50%(2分)，51%～75%(3分)，>75%(4分)。陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色(0分)，淺黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分)。陽(yáng)性細(xì)胞百分比與陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度乘積≥3分為陽(yáng)性，<3分為陰性。

1.3.4 患者隨訪 對(duì)ESCC患者出院后進(jìn)行隨訪，每6個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，直到出院后3年，記錄患者總生存時(shí)間(Overall survival，OS)，即患者死亡時(shí)間或最后1次隨訪時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織及癌旁組織中miR-199a-3p、AK4 mRNA的表達(dá) 與癌旁組織比較，ESCC組織中miR-199a-3p表達(dá)顯著降低，AK4 mRNA表達(dá)顯著升高(t=25.456、34.489，P<0.05)(t=25.456、34.489，P<0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 ESCC組織及癌旁組織中miR-199a-3p、AK4 mRNA的表達(dá)比較

2.2 ESCC組織及癌旁組織中AK4的表達(dá) AK4主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(見(jiàn)圖2)。與癌旁組織比較，ESCC組織中蛋白AK4陽(yáng)性表達(dá)率顯著增加(P<0.05，見(jiàn)表2)。

A：癌旁組織中AK4陰性表達(dá)；B：ESCC組織中的AK4陽(yáng)性表達(dá)；免疫組化法，×400。

表2 ESCC組織及癌旁組織中AK4的表達(dá)(n=72)

2.3 ESCC組織中miR-199a-3p、AK4的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 根據(jù)ESCC組織中miR-199a-3p平均數(shù)將患者分為高表達(dá)組33例，低表達(dá)組39例；根據(jù)免疫組化結(jié)果將患者分為陽(yáng)性表達(dá)47例，陰性表達(dá)25例。不同年齡、性別、病變部位、組織分化間miR-199a-3p高表達(dá)組與低表達(dá)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不同浸潤(rùn)深度ESCC組織中miR-199a-3p表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、性別、病變部位間AK4陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不同組織分化、浸潤(rùn)深度間ESCC組織AK4表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

表3 ESCC組織中miR-199a-3p、AK4的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

2.4 ESCC組織中miR-199a-3p、蛋白AK4表達(dá)的相關(guān)性分析 ESCC組織中，miR-199a-3p與AK4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.442，P<0.05，見(jiàn)表4)。

表4 ESCC組織中miR-199a-3p、AK4表達(dá)的相關(guān)性分析

2.5 蛋白AK4、miR-199a-3p表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪期間，共有4例患者失訪。miR-199a-3p高表達(dá)組平均OS為35.71個(gè)月，低表達(dá)組平均OS為34.15個(gè)月；AK4陽(yáng)性表達(dá)組平均OS為34.29個(gè)月，陰性表達(dá)組平均OS為35.96個(gè)月。miR-199a-3p高表達(dá)組、AK4陰性表達(dá)組ESCC患者3年平均OS分別高于miR-199a-3p低表達(dá)組、AK4陽(yáng)性表達(dá)組(見(jiàn)圖3)。

圖3 miR-199a-3p、AK4與ESCC患者OS的關(guān)系

2.6 COX回歸分析影響ESCC患者預(yù)后的因素 以隨訪期間ESCC患者是否死亡為因變量，年齡、性別、病變部位、組織分化、浸潤(rùn)深度、miR-199a-3p、AK4表達(dá)為自變量進(jìn)行COX回歸分析。單因素COX分析結(jié)果表明年齡、組織分化、浸潤(rùn)深度、miR-199a-3p低表達(dá)、AK4陽(yáng)性表達(dá)均與ESCC患者預(yù)后有關(guān)(P<0.05)；多因素COX分析表明，校正年齡、性別、病變部位、組織分化后，浸潤(rùn)深度、miR-199a-3p低表達(dá)、AK4陽(yáng)性表達(dá)是ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05,見(jiàn)表5)。

表5 COX回歸分析影響ESCC患者預(yù)后的因素

3 討論

ESCC是指食管鱗狀上皮異型增生導(dǎo)致的食管惡性腫瘤，臨床癥狀主要表現(xiàn)為吞咽困難、疼痛、消瘦等，手術(shù)治療是ESCC的主要治療手段，對(duì)于早期ESCC患者，具有較高的術(shù)后3年生存率。然而由于ESCC早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期，預(yù)后較差[13]。目前有關(guān)ESCC的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，飲食、生活方式、遺傳、感染等均是導(dǎo)致ESCC發(fā)生的因素。研究與早期ESCC發(fā)生和預(yù)后有關(guān)的分子機(jī)制，探尋有效生物標(biāo)志物可能有助于ESCC的早期診斷及改善預(yù)后。

miRNA是腫瘤發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子。miR-199a-3p屬于miR-199家族，Ecke等[14]研究表明肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織樣本中miR-199a-3p的表達(dá)顯著低于非惡性組織樣本，且miR-199a-3p與患者腫瘤浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是影響患者進(jìn)行根治性膀胱切除術(shù)后OS的主要因素。Hou等[15]研究表明miR-199a-3p在ESCC細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，且miR-199a-3p過(guò)表達(dá)顯著抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞周期延遲和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與ESCC的發(fā)生有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)早期ESCC患者組織中miR-199a-3p表達(dá)顯著低于癌旁組織，提示miR-199a-3p的異常表達(dá)可能與ESCC的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p低表達(dá)ESCC患者粘膜下層癌患者要多于高表達(dá)患者，提示miR-199a-3p與ESCC患者癌癥進(jìn)展有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。生存分析結(jié)果表明，miR-199a-3p高表達(dá)ESCC患者平均OS要高于低表達(dá)組，且miR-199a-3p低表達(dá)是ESCC患者術(shù)后3年內(nèi)死亡的影響因素，提示miR-199a-3p可作為判斷ESCC預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

AK4是腺苷酸激酶家族成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞遷移和侵襲、線粒體活性和腫瘤發(fā)展方面具有重要作用[16]。田華等[17]研究表明AK4在肺腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常肺組織，且與肺腺癌患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Huang等[18]生物信息學(xué)分析結(jié)果表明AK4在人漿液性卵巢癌中的表達(dá)顯著高于正常卵巢組織，抑制AK4的表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞CAOV3和OVCAR3的增殖、侵襲和遷移和裸鼠異種移植模型腫瘤的形成，可能是卵巢癌的潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，ESSC組織中AK4 mRNA表達(dá)和蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與患者組織分化、浸潤(rùn)程度有關(guān)，提示AK4的異常表達(dá)可能與ESCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。對(duì)患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，結(jié)果表明AK4陽(yáng)性表達(dá)組平均OS低于陰性表達(dá)組ESCC患者，且COX回歸分析結(jié)果表明AK4陽(yáng)性表達(dá)是ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，提示AK4表達(dá)可能是ESCC患者預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中miR-199a-3p與AK4呈負(fù)相關(guān)，Zang等[19]研究表明miR-199a-3p通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控AK4表達(dá)，降低食管癌細(xì)胞Kyse30、Kyse150的耐藥性。猜測(cè)，miR-199a-3p可能通過(guò)靶向調(diào)控AK4共同參與ESCC的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后。

綜上所述，ESCC組織中miR-199a-3p表達(dá)顯著下調(diào)，AK4表達(dá)顯著上調(diào)，二者呈負(fù)相關(guān)，且與ESCC患者浸潤(rùn)程度及三年OS有關(guān)，可能是ESCC預(yù)后預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物。然而本研究?jī)H分析了miR-199a-3p、AK4在ESCC中的臨床意義，下一步需結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討二者在ESCC發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制，為ESCC的靶向治療提供理論依據(jù)。