劉肖蓮，李春艷，白曉慧，郝 爽，劉國(guó)山，劉克明，馬 林，姜巨峰

( 天津市水產(chǎn)研究所，天津市觀賞魚技術(shù)工程中心，天津 300221 )

草金魚(Carassiusauratus)，又名紅鯽或金鯽，是金魚中最古老的一種，體形和尾鰭與普通鯽魚相似，體色有紅色、五花等。該品種抗病力和適應(yīng)性強(qiáng)，耐低溶解氧，養(yǎng)殖難度低，投入成本小，回報(bào)率高，是發(fā)展都市農(nóng)業(yè)、開發(fā)休閑漁業(yè)、保證漁民增收的理想養(yǎng)殖品種之一。草金魚中有一類為透明草金魚，因鳥糞素缺失，其頭部、鱗片和身體均為透明，內(nèi)臟和骨骼清晰可見。研究發(fā)現(xiàn)，鳥糞素并非真正的有色物質(zhì)，而是與水結(jié)合成晶體形式的嘌呤，能將光線從表面反射出來，當(dāng)鳥糞素缺失時(shí)，光線就能透過魚體顯示出內(nèi)部的器官[1]。由于其身體透明，與普通草金魚相比，透明草金魚具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。而目前關(guān)于草金魚的研究主要集中在飼料添加劑對(duì)體色的影響[2]以及病害致病機(jī)理研究[3-4]等方面。在體色方面，Xu等[5]對(duì)透明鯽魚和紅草金魚進(jìn)行雜交和自交，通過觀察不同組合子代的體色，發(fā)現(xiàn)透明性狀對(duì)于不透明性狀來說為顯性，且透明性狀為數(shù)量性狀，推論金魚體色的遺傳機(jī)制是復(fù)雜的，需要進(jìn)一步研究。

轉(zhuǎn)錄組是指在某一發(fā)育時(shí)期或特定條件下機(jī)體某組織所轉(zhuǎn)錄的全部RNA，包括信使RNA和非編碼RNA。在沒有基因組信息的情況下，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可作為對(duì)物種進(jìn)行基因發(fā)掘、查找控制特異性狀的關(guān)鍵基因和了解性狀形成的分子機(jī)制的有效手段。史東杰等[6]通過對(duì)白色皮膚和紅色皮膚的錦鯉(Cyprinuscarpiovar.koi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)基因富集在包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)/黏著斑通路在內(nèi)的132個(gè)代謝途徑。郝世鑫[7]采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究新西蘭黑金鮑(Haliotisiris)軟體獨(dú)特的黑色性狀，篩選出4個(gè)與黑色素合成代謝相關(guān)的基因。筆者對(duì)透明草金魚與不透明草金魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從轉(zhuǎn)錄組水平上研究透明草金魚的分子形成機(jī)制，為進(jìn)一步篩選草金魚透明性狀的目的基因及創(chuàng)制透明草金魚新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用草金魚采自天津市馬永紅水產(chǎn)養(yǎng)殖合作社，于相同的飼養(yǎng)環(huán)境中隨機(jī)選取透明草金魚3尾、不透明草金魚3尾，體長(zhǎng)為(45.00±5.42) mm。將試驗(yàn)魚麻醉，刮去魚鱗后取皮膚組織，經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

皮膚組織總RNA采用Trizol reagent試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行提取，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA是否降解，Nanodrop超微量紫外光分光光度計(jì)檢測(cè)D(260 nm)/D(280 nm)，Qubit檢測(cè)RNA質(zhì)量濃度，Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)RNA分子完整數(shù)(RIN值)。按照TruSeq DNA Library Prep Kit (Illumina)說明書，通過cDNA合成，末端修復(fù)，連接接頭和擴(kuò)增純化，得到草金魚皮膚組織cDNA文庫(kù)。建好的文庫(kù)在Illumina HiSeq4000測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序(天津諾禾致源生物信息科技有限公司)。

1.3 序列拼接及功能注釋

將測(cè)序所得的原始序列中的帶接頭的和低質(zhì)量的序列去除，得到的序列稱為過濾序列。由于已發(fā)表基因組缺乏完整的基因注釋文件，故對(duì)得到的轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行無參分析。采用Trinity軟件對(duì)過濾序列進(jìn)行拼接，選擇最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為unigene。將所得的unigene與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr)、美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Nt)、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)(Pfam)、同源蛋白簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(KOG/COG)、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss-prot)、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)、基因本體論(GO)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以獲得unigene的注釋信息。

1.4 差異基因表達(dá)分析

采用軟件Bowtie將每個(gè)樣品的過濾序列比對(duì)到組裝出來的轉(zhuǎn)錄本上，使用軟件RSEM統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)基因上的read count數(shù)目，根據(jù)每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的fragments數(shù)目(FPKM)估算基因的表達(dá)水平。采用DESeq軟件篩選差異表達(dá)基因，差異基因的篩選條件為：padj<0.05且log2|Fold Change|>1。通過Goseq行差異表達(dá)基因的GO富集分析，通過KOBAS進(jìn)行KEGG通路顯著性富集分析，找出差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.5 微衛(wèi)星分析

采用MISA軟件對(duì)獲得的unigene進(jìn)行微衛(wèi)星序列的查找，其篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為：?jiǎn)巍⒍?、三、四、五、六堿基重復(fù)的最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝

采用Illumina HiSeq4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)透明草金魚和不透明草金魚(各3尾個(gè)體)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估情況見表1。6個(gè)樣品分別得到52 630 100、54 113 970、41 297 798、42 691 754、59 027 442、59 603 014條過濾序列，各樣品的GC含量為45.80%～47.59%，Q30堿基百分比在93.16%以上，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)組裝分析。對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接，共獲得72 083個(gè)unigene，總核苷酸數(shù)為95 213 926，平均長(zhǎng)度為1321 bp，N50為2264 nt。

表1 樣品測(cè)序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估Tab.1 Quality assessment of sequencing data output

2.2 功能注釋

將所得的unigene序列與Nr、Nt、Pfam等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有38 516個(gè)基因注釋到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)，占總數(shù)的53.43%(表2)；69 547條序列注釋到Nt數(shù)據(jù)庫(kù)，占總數(shù)的96.48%；8545條序列在7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均得到注釋，占總數(shù)的11.85%；70 032條序列至少在1個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，占總數(shù)的97.15%。

表2 unigene注釋成功率統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistical result of unigene annotation

2.3 差異表達(dá)分析

對(duì)透明草金魚和不透明草金魚2組樣品進(jìn)行差異表達(dá)分析，當(dāng)基因在2組樣品之間的表達(dá)量差異為2倍以上時(shí)，則認(rèn)為該基因在樣品間存在顯著的表達(dá)差異，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果繪制基因表達(dá)差異火山圖(圖1)。由圖1可見，透明草金魚與不透明草金魚共存在181條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因66條，下調(diào)基因115條。

圖1 樣品組間基因差異表達(dá)分析火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes between the two groups藍(lán)色圓點(diǎn)表示無顯著性差異的基因，紅色圓點(diǎn)表示有顯著性差異的上調(diào)基因，綠色圓點(diǎn)表示有顯著性差異的下調(diào)基因.Blue dots represent non-differentially expressed genes, red dots represent significantly up-regulated genes, and green dots represent significantly down-regulated genes.

2.4 差異表達(dá)基因的富集

對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能注釋(圖2)。在生物學(xué)過程中，基因多富集在單有機(jī)體過程、刺激反應(yīng)、生物過程調(diào)節(jié)等方面，也有基因富集在黑素體定位、色素沉著、色素顆粒運(yùn)輸?shù)菺O類別上；在細(xì)胞組成中，基因多富集在膜、色素顆粒、黑素體、肌動(dòng)蛋白復(fù)合物等；在分子功能中，基因多富集在催化活性、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、水解酶活性等。

圖2 樣品組間差異表達(dá)基因GO功能注釋Fig.2 Gene ontology annotation of differentially expressed genes between the two groups

將透明草金魚和不透明草金魚的差異表達(dá)基因比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行代謝通路富集分析。選取富集最顯著的20個(gè)通路條目繪制KEGG富集散點(diǎn)圖(圖3)。由圖3可見，差異表達(dá)基因主要富集在MAPK信號(hào)通路、嘌呤代謝、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞緊密連接、甘油磷脂代謝等通路中。

圖3 差異表達(dá)基因KEGG富集分析散點(diǎn)圖Fig.3 KEGG pathway enrichment of differentially expressed genes

2.5 微衛(wèi)星分析

從72 083個(gè)unigene中找到38 775個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，占unigene總數(shù)的53.79%，微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均間距為2456 bp。其中復(fù)合型微衛(wèi)星4565個(gè)，單堿基重復(fù)20 918個(gè)，二堿基重復(fù)9481個(gè)，三堿基重復(fù)3236個(gè)，四堿基重復(fù)491個(gè)，五堿基重復(fù)65個(gè)，六堿基重復(fù)19個(gè)。在單核苷酸重復(fù)類型中，數(shù)量最多的重復(fù)基元是A/T(23 720個(gè))，二堿基重復(fù)中出現(xiàn)次數(shù)最多的是AC/GT(7715個(gè))，三堿基重復(fù)中則以AAT/ATT出現(xiàn)次數(shù)最多(662個(gè))。

3 討 論

3.1 透明草金魚轉(zhuǎn)錄組組裝與注釋分析

3.2 透明草金魚差異表達(dá)基因功能分析

對(duì)透明草金魚皮膚和不透明草金魚皮膚的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)181條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因66條，下調(diào)基因115條。為了解差異基因的功能與代謝通路，對(duì)差異基因進(jìn)行了GO功能分類與KEGG通路分析。差異基因主要富集在微管、微管結(jié)合、微管錨定、微管調(diào)控過程、蛋白質(zhì)綁定、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合、中間纖維、中間纖維細(xì)胞骨架、肌動(dòng)蛋白復(fù)合物等條目，與虹彩細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能相吻合。虹彩細(xì)胞的反射層由折射率不同的小板有序排列而成，反射小板的主要成分是鳥嘌呤，鳥嘌呤與水結(jié)合后形成鳥嘌呤晶體，可以折射一定長(zhǎng)度的波長(zhǎng)。而虹彩細(xì)胞中色素顆粒的定向運(yùn)動(dòng)與微管、肌動(dòng)蛋白有關(guān)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[15]的研究結(jié)果一致，其對(duì)錦鯉的紅色皮膚和白色皮膚進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因大多富集在細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、肌纖維和糖原磷酸化酶活性等方面。本試驗(yàn)中，下調(diào)的差異表達(dá)基因Cluster-22359.15170與黑素體定位、細(xì)胞色素的沉著等功能有關(guān)，可作為候選基因?qū)ζ涔δ苓M(jìn)行深入研究。KEGG通路分析結(jié)果表明，差異基因多富集在MAPK通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路、嘌呤代謝通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工通路等，這些通路上的SAR1(GTP酶)、PAK(P21活化激酶)、ACTN(肌動(dòng)蛋白)、CACN(電壓依賴性鈣通道)等基因在透明草金魚皮膚中均表現(xiàn)為下調(diào)，說明這些基因可能與虹彩細(xì)胞中鳥嘌呤合成或色素顆粒轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。

對(duì)差異表達(dá)基因中差值較大的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，透明草金魚中上調(diào)倍數(shù)較高的差異表達(dá)基因主要富集在tRNA鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性、GTP酶活性、嘌呤核苷三磷酸結(jié)合、嘌呤核苷酸結(jié)合、鳥苷酸結(jié)合、7-甲基鳥苷RNA加帽等生物學(xué)過程，這些基因參與調(diào)節(jié)了鳥嘌呤的合成，導(dǎo)致透明草金魚皮膚中虹彩細(xì)胞和鳥嘌呤的缺失，使其皮膚呈現(xiàn)透明性狀，這與Bian等[9]的研究結(jié)果一致。與不透明草金魚相比，透明草金魚中下調(diào)程度較高的差異表達(dá)基因在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性、酪氨酸代謝、微管結(jié)合、微管骨架組織、核糖核蛋白復(fù)合物的生物發(fā)生等GO條目，通常認(rèn)為，酪氨酸酶代謝是影響脊椎動(dòng)物黑色素生成的主要通路，而細(xì)胞內(nèi)色素顆粒的運(yùn)動(dòng)與微管有關(guān)，這些基因在透明草金魚中表達(dá)下調(diào)，說明它們參與了細(xì)胞內(nèi)黑色素的合成和遷移。同時(shí)，下調(diào)程度較高的基因富集到MAPK信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗原處理和呈遞等通路，MAPK信號(hào)通路也是黑色素生成的主要通路之一，而酪氨酸酶基因家族蛋白一般通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工后轉(zhuǎn)運(yùn)到黑色小體中參與黑色素的合成，這與下調(diào)基因富集在糖核蛋白復(fù)合物的生物發(fā)生的生物學(xué)過程也是相吻合的。富集在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗原處理和呈遞等免疫相關(guān)通路的基因在透明草金魚中顯著下調(diào)，可能與黑色素細(xì)胞中的黑色素可作為物理屏障吸收和屏蔽紫外線，保護(hù)DNA免受紫外輻射損傷有關(guān)[16]。以上差異表達(dá)基因可作為草金魚透明性狀的候選基因，對(duì)其在不同時(shí)期皮膚組織中的表達(dá)模式以及功能研究有待進(jìn)一步分析。

4 結(jié) 論

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)透明草金魚與不透明草金魚的皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得72 083個(gè)unigene，通過差異表達(dá)分析篩選出181個(gè)差異基因，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路分析，了解了差異基因有關(guān)的分子功能、生物學(xué)過程以及代謝通路，同時(shí)鑒定了38 775個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。試驗(yàn)結(jié)果有利于進(jìn)一步開展草金魚透明性狀的功能基因以及分子形成機(jī)制等研究。