理沖湯干預(yù)卵巢癌腫瘤微環(huán)境的機制研究

王冬梅，龐 瑞

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，烏魯木齊 830011）

卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在婦科惡性腫瘤中居首位[1]。雖然新的輔助化療已在臨床得到應(yīng)用，但并沒有扭轉(zhuǎn)臨床結(jié)局。隨著研究的不斷深入，腫瘤免疫治療在惡性腫瘤的治療中具有良好的應(yīng)用前景。然而，只有少數(shù)抑制劑對卵巢癌有效，其中一個主要原因是卵巢癌本身誘導(dǎo)的免疫抑制微環(huán)境[2]。近年來，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)的密切關(guān)系已被越來越多的學(xué)者所認識和證實。腫瘤血管生成與微環(huán)境中的血管內(nèi)皮生長因子密切相關(guān)。實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程伴隨細胞外基質(zhì)的過量沉積，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)則與細胞外基質(zhì)相關(guān)。MMPs降解胞外基質(zhì)同時釋放或活化大量與胞外基質(zhì)結(jié)合的細胞因子和趨化因子，在另一個層面影響了炎癥細胞向腫瘤的浸潤[3]。在卵巢癌腫瘤微環(huán)境復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)中，調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）是關(guān)鍵的免疫抑制因子。

給予晚期卵巢癌患者理沖湯加減聯(lián)合化療治療可改善其臨床癥狀，其中血流變指標和高凝狀態(tài)改善最為明顯，改善免疫功能，并且可以延長患者的生存期[4]。扶正培本方藥在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境免疫系統(tǒng)及促血管正?；挠酗@著作用[5]。

因此,本研究探討理沖湯含藥血清對小鼠卵巢上皮癌ID8細胞抑制增殖和促進凋亡的作用,并觀察理沖湯含藥血清對于臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)血管成形過程的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗動物小鼠卵巢上皮癌細胞株（ID-8）和臍靜脈內(nèi)皮細胞株（HUVECs）均購自上海中橋新舟生物科技有限公司。40只2月齡SPF級BALB/C小鼠20只，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新疆）2014-0004SYXK］

1.2 藥品理沖湯（黃芪30 g、黨參15 g、白術(shù)12 g、山藥30 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪術(shù)9 g、雞內(nèi)金10 g）均由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中藥房提供，中藥經(jīng)本院陳新萍主任藥師鑒定符合2015年版《中國藥典》規(guī)定。每味中藥均來自同一批次。由我院中藥房一次性按常規(guī)方法煎煮，根據(jù)等效劑量系數(shù)折算法得出小鼠的灌胃劑量[6]，將中藥水煎劑用水浴濃縮為含生藥5.2 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司），澳洲胎牛血清（美國Gibco公司),胰蛋白酶(美國Gibco公司），雙抗(美國Gibco公司)，matrige膠(美國BD公司)；細胞增殖試劑盒(MTT，北京Solarbio公司)；CD4+CD25+regulatory T cell isolation Kit(德國Miltenyi公司)；淋巴細胞提起試劑盒(天津灝洋生物制品科技有限公司)；抗VEGF單克隆抗體（美國Abcam公司);凋亡試劑盒（美國BD公司，批號）；免疫熒光抗體VEGF（美國Abcam公司）、MMP-2和MMP-9（美國Revolution公司）。

1.4 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO);離心機(日本SONY公司);酶標儀(美國Thermo公司);流式細胞儀DXflex（美國Beckman Coulter公司）。

1.5 方法

1.5.1 ID8細胞與HUVECs細胞株的復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代將液氮中凍存的細胞取出后于37℃水浴鍋中迅速化開，PBS洗兩遍，完全培養(yǎng)基重懸細胞，于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長匯合度為80%左右時，用胰酶將細胞消化下來，分裝于2～3個培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.5.2 理沖湯含藥血清制備和濃度篩選灌胃藥物及劑量：理沖湯等效劑量換算[6]：按照小鼠等效劑量=人臨床常用量（g/kg）×15，以70 kg成人體重計算，予7.62 mL/(kg·d)理沖湯藥液灌胃。灌胃：將20只體重為18～20 g，雌性、約2月齡的BALA/C小鼠，按照體重隨機分為兩組（每組10只），理沖湯含藥血清組按2 mL/100 g/次灌胃，每天2次；空白組灌服等量清水。取血：灌胃飼養(yǎng)3 d后，撤去鼠飼料，停止進食12 h后灌胃1次，于2 h后灌胃第2次；第2次灌胃后1 h，刺破眼眶靜脈叢進行靜脈采血，注入2 mL離心管，3 000 r/15 min離心，取血清。為了減輕小鼠的個體差異,同組動物血清合并。血清滅活及保存：用0.22 μm的濾膜過濾血清，56℃水浴滅活血清并分裝凍存于-80℃冰箱。將含藥血清以5%、10%、20%、40%、80%、100%的濃度與完全培養(yǎng)基進行配置，用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法檢測其對ID8細胞的抑制率，測算IC50后，選擇1/2的IC50即25%的含藥血清濃度作為后續(xù)實驗劑量。

（1）由表中極差值的大小可以看出，激勵信號頻率的極差最大而熱處理的極差最?。挥纱丝芍钚盘栴l率對檢測的影響程度最大，油樣的初始制冷溫度對檢測的影響程度較小。其他兩種因素對檢測的影響程度基本相近。

1.5.3 細胞增殖抑制率的觀察實驗分組為空白組（未加任何干預(yù)）和理沖湯含藥血清組，取處于對數(shù)生長期的卵巢癌ID8細胞，制備成細胞濃度為104個細胞每孔，接種于96孔板中，每孔體積200 μL。每組6個復(fù)孔，空白組未加任何干預(yù)，之后含藥血清組加入25%理沖湯含藥血清，干預(yù)24 h、48 h、72 h、96 h后，向每個孔中分別加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，并將96孔板在于培養(yǎng)箱中孵育4 h。后吸出每個孔中液體，向每個孔中加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），低速搖動10 min。在490 nm波長處測量每個孔的吸光度值A(chǔ)。細胞抑制率=（1-A給藥孔/A空白孔）×100%。

1.5.4 細胞凋亡的觀察采用流式細胞術(shù)檢測卵巢癌ID8細胞空白血清組和含藥血清組細胞凋亡的改變。取處于對數(shù)生長期的卵巢癌細胞，接種于6孔板中，分組同1.5.3項，收集1～5×105個細胞，PBS洗滌2遍。離心后加入0.5 mL的Binding Buffer懸浮細胞。加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，混勻。室溫下，避光孵育15 min，PBS洗2遍后上流式細胞儀檢測。

1.5.5 Tregs分選及細胞共培養(yǎng)首先取新鮮正常小鼠的抗凝全血累計5 mL，利用淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，后用PBS洗2遍。將離心好的細胞用Miltenyi CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit提取Tregs。洗脫細胞，用完全培養(yǎng)基重懸后將細胞按照0.8×105個/mL分為4份 接種于24孔板中。將HUVECs和Tregs分為8組進行共培養(yǎng)：A，空白組（完全培養(yǎng)基）；B，抗VEGF組（完全培養(yǎng)基+VEGF抗體）；C，理沖湯含藥血清組（理沖湯含藥血清培養(yǎng)基）；D，抗VEGF+理沖湯含藥血清組（VEGF抗體+理沖湯含藥血清培養(yǎng)基）；E，Tregs組（完全培養(yǎng)基+Tregs）；F，Tregs+抗VEGF組（完全培養(yǎng)基+Tregs+VEGF抗體）；G，Tregs+理沖湯含藥血清組（Tregs+理沖湯含藥血清培養(yǎng)基）；H，Tregs+抗VEGF+含藥血清組（Tregs+VEGF抗體+理沖湯含藥血清培養(yǎng)基）。其中，完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和雙抗的1640培養(yǎng)基；抗VEGF組加入的VEGF抗體體積為20 μL。

1.5.6 小管形成檢測Matrigel基質(zhì)膠在4℃下過夜溶解；將槍頭盒、EP管、96孔板放入4℃冰箱預(yù)冷過夜;第二天在冰盒上鋪膠，在96孔板中加入Matrigel基質(zhì)膠，每孔50 μL,37℃孵育30 min，根據(jù)1.5.5項實驗分組，制備細胞懸液，細胞消化后調(diào)節(jié)細胞懸液濃度至1×105個細胞/mL。每孔接種1×104細胞/mL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.5.7 細胞免疫熒光按照1.5.5項分組，將HUVECs接種在放置了蓋玻片的24孔板中，待匯合度在80%左右時，從培養(yǎng)箱中取出。用預(yù)溫的PBS洗滌3次，每次10 min。4%多聚甲醛固定，室溫30 min。PBS洗滌3次，每次10 min。0.25%Triton X-100透化細胞，室溫20 min。PBS洗滌3次，每次10 min。1%BSA室溫封閉30 min。加一抗（用1%BSA稀釋，1:200）放在濕盒里，4℃過夜。PBS洗3次，每次10 min。加二抗（用1%BSA稀釋），室溫閉光60 min。PBS洗3次，每次10 min。加入DAPI染核，室溫5 min。PBS洗3次，每次10 min，熒光拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。采用獨立樣本t檢驗做組間比較分析。流式數(shù)據(jù)用kaluza流式細胞儀分析軟件分析做圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 理沖湯含藥血清培養(yǎng)后不同時間點的ID8細胞增殖改變與空白組相比，理沖湯含藥血清組對ID8細 胞 在24 h、48 h、72 h和96 h分 別 為9.310%、14.627%、22.170%和27.029%，隨著作用時間延長而抑制率逐漸增高（P＜0.05)。見表1。

表1 理沖湯含藥血清對ID8細胞增殖抑制的影響（±s）

表1 理沖湯含藥血清對ID8細胞增殖抑制的影響（±s）

注:與空白組比較,*P＜0.05。

組別空白組理沖湯含藥血清組24 h 0.581±0.022 0.526±0.098 48 h 0.793±0.082 0.617±0.017*72 h 0.857±0.066 0.667±0.036*96 h 0.973±0.126 0.710±0.019*

2.2 ID8細胞經(jīng)理沖湯含藥血清作用48 h后細胞凋亡的改變流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示理沖湯含藥血清組卵巢癌ID8細胞凋亡率為(12.52±0.23)%，而空白組ID8卵巢癌細胞的凋亡率為(4.46±0.54)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示，理沖湯含藥血清可促進ID8細胞凋亡作用。見圖1。

圖1 空白組和理沖湯含藥血清組48h時的細胞凋亡

圖2 理沖湯對HUVEC血管生成數(shù)量的影響

圖3 理沖湯對HUVEC血管生成的影響（×100）

2.4 理沖湯對HUVEC的VEGF、MMP-2和MMP-9表達的影響與未加入Tregs分組(A、B、C、D組)比較，加入Tregs各組(E、F、G、H組)HUVEC的VEGF、MMP-2和MMP-9表達明顯增高。其中，A、E組中HUVEC的VEGF、MMP-2和MMP-9表達明顯高于其它組。與抗VEGF抗體(B、F組)或理沖湯含藥血清(C、G組)共培養(yǎng)的HUVEC的VEGF、MMP-2和MMP-9表達則較低。理沖湯含藥血清+抗VEGF組(D、H組)二者聯(lián)合時，VEGF、MMP-2和MMP-9表達分別較A、E組顯著減少。見圖4。

圖4 理沖湯對HUVEC細胞MMP-2、MMP-9和VEGF表達的影響（×100）

3 討論

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)是腫瘤細胞賴以生存的局部生態(tài)環(huán)境，與腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，由基質(zhì)細胞（包括巨噬細胞、Tregs、成纖維細胞等）和細胞外基質(zhì)組成。大多數(shù)實體腫瘤形成病理生理微環(huán)境，其特點是微血管網(wǎng)和血流模式不規(guī)則，在腫瘤的惡性進展、免疫逃逸和治療抵抗中TME均發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。目前，卵巢癌的發(fā)病機制尚不完全清楚。探索改變卵巢癌免疫微環(huán)境和逆轉(zhuǎn)免疫抑制的新機制是卵巢癌免疫治療的研究策略和熱點。

Tregs作為免疫系統(tǒng)中的基本細胞,在免疫穩(wěn)態(tài)和誘導(dǎo)機體免疫耐受中扮演重要角色，且在感染、腫瘤、器官移植、預(yù)防自身免疫性疾病和維持機體免疫平衡方面發(fā)揮重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，T細胞能誘導(dǎo)和分化Tregs，其通過對自身抗原的免疫耐受來防止自身性免疫疾病的發(fā)生。然而，通過免疫抑制作用，Tregs可促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸，抑制抗腫瘤免疫，從而促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[8]。血管內(nèi)皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）在腫瘤血管生成中起重要作用，有研究表明VEGFR-2信號通路可以增加Tregs對腫瘤的浸潤。通過阻斷VEGF-VEGFR2信號減少免疫抑制細胞在TME中的積累并抑制腫瘤生長。因此，靶向激活Tregs表達的VEGFR2分子或阻斷VEGF-VEGFR2信號可抑制Treg進而促進腫瘤免疫[9]。

目前，針對Tregs的細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、程序性細胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）抑制劑[10]在臨床試驗中取得了一定療效，然而由于此類藥物無選擇性地“攻擊”Tregs，會導(dǎo)致人體免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞，進而產(chǎn)生嚴重的毒副作用，限制了此類藥物的應(yīng)用。因此，當下免疫治療的關(guān)鍵應(yīng)當是通過合理調(diào)節(jié)Tregs，將病人自身固有的、在腫瘤生長過程中被弱化的免疫反應(yīng)恢復(fù)至常態(tài)，從而恢復(fù)免疫微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡。中醫(yī)藥治療疾病的特點在于整體性、平衡性、多系統(tǒng)、多靶點，其與腫瘤微環(huán)境的基本特點相似[11]。腫瘤微環(huán)境中存在的主要“免疫抑制”機制是Tregs介導(dǎo)的惡性腫瘤細胞在腫瘤微環(huán)境中的免疫逃逸，而這種免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，也就相當于中醫(yī)的“正氣虛損”為主的環(huán)境。臨床實踐中，采用扶持正氣為主的中醫(yī)藥治療方案對于腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控和防治腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有確切的臨床意義[12]。中醫(yī)藥治療卵巢癌是多途徑、多層次及多靶點的整體綜合治療[13]。中藥對腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用包括減少血管生成細胞、降解細胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)免疫細胞（包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等）[11]。扶正固本、活血化瘀等中藥的活性成分具有抑制增殖、抑制侵襲和遷移，誘導(dǎo)細胞凋亡，阻斷血管及抑制有氧糖酵解等作用[14]。

理沖湯出自張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》治療婦科腫瘤的名方，具有益氣養(yǎng)陰和祛瘀消癥作用。方中黃芪、黨參、白術(shù)及山藥可扶正益氣；天花粉和知母可清熱養(yǎng)陰；三棱和莪術(shù)具有行氣破血，消積止痛之效；雞內(nèi)金健胃消食，并化瘀血且不傷氣分[15]。黃芪、山藥、五味子等藥物通過提高荷瘤小鼠T、B淋巴細胞比例和活化水平來抑制血管內(nèi)皮細胞的生長和腫瘤細胞的遷移，進而增強抗腫瘤作用[16]。天花粉蛋白對癌細胞有放射增敏作用，其機制可能與增加凋亡相關(guān)[17]，三棱莪術(shù)組方的輔助治療有利于減輕胃癌患者化療期間的中醫(yī)證候，降低腫瘤相關(guān)標志物水平，提高患者免疫功能[18]。

本研究結(jié)果顯示，理沖湯不僅可以抑制卵巢癌細胞的增殖，還可以促進其凋亡。同時通過細胞共培養(yǎng)及血管成形實驗還發(fā)現(xiàn)，Tregs共培養(yǎng)各組與Tregs未共培養(yǎng)各組相比，血管成網(wǎng)明顯，說明Tregs能夠促進血管生成，這與文獻[19]的研究結(jié)果一致。VEGF能促進血管生成，導(dǎo)致腫瘤血管畸形，造成TME中缺氧和低PH，從而促進局部和系統(tǒng)性免疫抑制，進而導(dǎo)致腫瘤進展[20]。Tregs共培養(yǎng)各組中添加理沖湯中藥含藥血清以及抗VEGF抗體后，呈現(xiàn)不同程度血管結(jié)構(gòu)疏松破壞，提示理沖湯含藥血清能夠發(fā)揮抑制HUVEC的血管生成，可能有與抗VEGF抗體類似的作用，理沖湯發(fā)揮抗血管療效可能是與拮抗Tregs的作用相關(guān)。MMPs降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。MMPs的表達水平與促進腫瘤細胞侵襲和遷移的炎癥程度密切相關(guān)。在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、卵巢癌中都發(fā)現(xiàn)有MMPs的高表達[21]。在卵巢癌離體標本中，MMP-2抗原與血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）數(shù)量呈正相關(guān)，MMP-2與VM的形成密切相關(guān)，且在卵巢癌細胞圍成的管狀結(jié)構(gòu)中存在大量MMP-2棕褐色顆粒[22]。理沖湯可通過抑制MMP-2、MMP-9的活性來改善腫瘤的發(fā)生發(fā)展[23-24]。本研究結(jié)果顯示，理沖湯可能通過抑制VEGF的表達和降低MMP-2、MMP-9的活性來達到抗血管生成的目的，從而達到抑制腫瘤生長的效果。

綜上所述，理沖湯可能是通過調(diào)控卵巢癌微環(huán)境中免疫抑制和新生血管來達到治療卵巢癌的療效。此外，理沖湯中含有多種活性成分，需要今后進一步研究其活性成分對機體的主要作用及其作用機制。