陳冰婷，楊 建，白 鈺，伊麗則熱·艾拜杜拉，譚惠文，馬曉麗

（新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2第四附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，烏魯木齊 830011）

2型糖尿病(T2DM)是一種以血糖持續(xù)升高為臨床表現(xiàn)的代謝性疾病，其發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì),已經(jīng)成為全球重大健康問(wèn)題之一[1-2]。中醫(yī)將2型糖尿病列為“消渴病”范疇,對(duì)糖尿病的辨證分型主要包括陰虛熱盛型、氣陰兩虛型、陰陽(yáng)兩虛型、血瘀氣滯型,其中氣陰兩虛型最為常見[3-5]。中醫(yī)對(duì)糖尿病的辨證分型較為主觀，采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的技術(shù)手段幫助中醫(yī)病癥分型是有必要的[6]。膽汁酸（BA）可通過(guò)影響腸道激素的分泌參與調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和胰島素分泌[7]，其代謝譜的變化是糖尿病等代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的靈敏指標(biāo)。進(jìn)一步完善膽汁酸代謝譜的研究，對(duì)糖尿病的診斷及中醫(yī)證型研究具有重要的指導(dǎo)意義。本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析研究糖尿病氣陰兩虛患者和正常氣陰兩虛者血清中膽汁酸的含量差異，為氣陰兩虛型糖尿病的臨床診斷和治療提供一種新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2015年1月-2018年12月新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的30例2型糖尿病氣陰兩虛患者為糖尿病氣陰兩虛組，其中男16例，女14例，年齡40～65歲，平均年齡（49.87±10.03）歲;選擇同時(shí)期25例氣陰兩虛證患者為正常氣陰兩虛組，其中 男10例，女15例，年齡35～60歲，平 均 年齡（48.13±9.49）歲?；颊呔炇鹬橥鈺?，本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)（20140304-133）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2019年世界衛(wèi)生組織（WHO）[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）有糖尿病癥狀（典型癥狀：多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降），隨機(jī)血糖≥11.1mol/L；（2）空腹血糖≥7.0mmol/L；（3）進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）后，餐后2 h血糖≥11.1mmol/L。凡符合上述標(biāo)準(zhǔn)中的任一條者可診斷為糖尿病。

1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥治療糖尿病的臨床研究指導(dǎo)原則》[9]中的氣陰兩虛證標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行中醫(yī)辨證分型,氣陰兩虛型:倦怠乏力,自汗盜汗,氣短懶言,口渴喜飲,五心煩熱,心悸失眠,渡赤便秘,舌紅少津,舌體胖大,苔薄或花剝,脈弦細(xì)或細(xì)數(shù)。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn)參照“1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)”明確診斷為2型糖尿病氣陰兩虛患者。

1.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn)I型糖尿病患者或其他疾病引起的血糖升高；嚴(yán)重糖尿病并發(fā)癥者；有嚴(yán)重的心、肝、腎等并發(fā)癥或合并其他嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；妊娠期或哺乳期患者；精神病患者；不愿意配合者。

1.4 血清中膽汁酸含量的測(cè)定采集兩組患者早餐前空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，保存于-80℃冰箱中待測(cè)。采用超高液相串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)的代謝組學(xué)方法[10]，建立血清中29種膽汁酸的定量檢測(cè)方法，在進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)考察后，測(cè)定血清中膽汁酸的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)（四分位數(shù)），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SIMCA軟件(V15.0.2)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換加UV格式化處理，對(duì)第一主成分進(jìn)行OPLS-DA建模分析，用交叉驗(yàn)證后得到的R2Y（模型對(duì)分類變量Y的可解釋性）和Q（2模型的可預(yù)測(cè)性）對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判，通過(guò)置換檢驗(yàn)對(duì)模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。根據(jù)變量投影重要度（VIP）＞0及P＜1篩選差異代謝物，對(duì)差異代謝物的定量值計(jì)算歐式距離矩陣，以完全連鎖方法對(duì)差異代謝物進(jìn)行聚類，并以層次聚類圖進(jìn)行展示，采用ROC分析以尋找潛在的生物標(biāo)志物，ROC曲線下的面積（AUC）值越接近1，臨床診斷效能越大，可認(rèn)為該差異代謝物是潛在的生物標(biāo)志物。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料的比較兩組間患者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常氣陰兩虛組比較，2型糖尿病氣陰兩虛組患者空腹血糖升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 2型糖尿病氣陰兩虛患者和正常氣陰兩虛患者一般資料比較

2.2 血清膽汁酸含量的比較與正常氣陰兩虛組比較，2型糖尿病氣陰兩虛組患者血清中甘氨氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、膽酸含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 2型糖尿病氣陰兩虛患者和正常氣陰兩虛患者的膽汁酸含量的比較/（nmol/L）

2.3 血清膽汁酸的多元統(tǒng)計(jì)分析糖尿病氣陰兩虛組和正常氣陰兩虛組的樣本區(qū)分顯著,兩組的R2=0.018 7,Q2=-0.278，Q2的回歸線與縱軸的截距小于零，表明該模型具有良好的穩(wěn)健性，適合于后續(xù)分析的優(yōu)化,見圖1、2。

圖1 OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖

圖2 OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果圖

2.4 血清膽汁酸差異代謝物的篩選與正常氣陰兩虛組（NH）相比，2型糖尿病氣陰兩虛組（DH）的膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、異石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸的含量下降，其中膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸變異重要性（VIP）＞1，在兩組間起著重要的作用，見表3。

表3 2型糖尿病氣陰兩虛組和正常氣陰兩虛組的膽汁酸差異代謝物的篩選表

2.5 血清膽汁酸表達(dá)量的層次聚類分析圖與正常氣陰兩虛組相比，2型糖尿病氣陰兩虛組中的膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、異石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸呈現(xiàn)低表達(dá)的趨勢(shì)，而石膽酸、脫氧膽酸、12-酮基石膽酸、甘氨膽酸、鵝脫氧膽酸呈現(xiàn)高表達(dá)的趨勢(shì)，見圖3。

圖3 血清膽汁酸的層次聚類分析圖

2.6 血清膽汁酸生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)能力評(píng)估甘氨熊脫氧膽酸（AUC=0.71）、?；蛆Z脫氧膽酸（AUC=0.66）、膽酸（AUC=0.67），臨床診斷效能較大,被認(rèn)為是糖尿病氣陰兩虛型患者的潛在生物標(biāo)志物，能為氣陰兩虛型糖尿病進(jìn)一步研究提供更多信息，見圖4。

圖4 血清膽汁酸的ROC曲線分析

3 討論

中醫(yī)將糖尿病稱為“消渴”，臨床癥狀表現(xiàn)為多飲、多食、多尿、消瘦及疲乏等特征[11]。2型糖尿病(消渴病)中,氣陰兩虛證是本研究中占比最大的證型且最為常見，氣陰兩虛證患者發(fā)病年齡小且病程較其他證型長(zhǎng)。在連續(xù)血糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中，氣陰兩虛證型的血糖較其他證型難監(jiān)測(cè)[12]，因此建立一個(gè)靈敏的診斷方法對(duì)及時(shí)干預(yù)對(duì)糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展和治療起著重要作用。

血清膽汁酸(BA)是脂質(zhì)吸收和膽固醇代謝的重要調(diào)控因子，越來(lái)越被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)與代謝疾病相關(guān)途徑，包括脂質(zhì)和葡萄糖代謝、能量消耗和炎癥等[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)12種膽汁酸包括甘氨熊脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、膽酸、熊去氧膽酸、12-酮基石膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、異石膽酸、石膽酸承載了氣陰兩虛糖尿病組與正常組的重要信息。

Shimak等[16]的研究證明?；切苋パ跄懰?TUDCA)在嚙齒動(dòng)物模型和T2DM患者中具有抗炎和改善胰島素敏感性的作用，Liu等人[17]的研究表明膽酸在調(diào)節(jié)BA動(dòng)態(tài)平衡方面有著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、膽酸的含量在2型糖尿病氣陰兩虛組顯著降低，且在ROC分析中甘氨熊脫氧膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸、膽酸臨床診斷的效能較大,被認(rèn)為是2型糖尿病氣陰兩虛型患者的潛在生物標(biāo)志物。有研究表明[18]，通過(guò)外源性補(bǔ)充甘氨熊脫氧膽酸能夠拮抗FXR受體進(jìn)而起到降低血糖的作用。膽酸是人類主要的膽汁酸，膽酸的缺乏可能會(huì)引起多種疾病，可作為受膽汁酸合成障礙影響的患者的治療藥物[19]。有研究[20]認(rèn)為?；撬峤Y(jié)合的膽汁酸在T2DM患者中含量較高，然而在我們的研究中TCDCA表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)。

綜上所述，甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、膽酸在2型糖尿病氣陰兩虛患者中的含量降低，能為2型糖尿病氣陰兩虛型的現(xiàn)代化診斷和治療提供新的思路。