高粱淀粉堿法提取和酶法純化的研究

雷 晶，羅安梅，羅婷婷，路煥梁，崔 悅，高 菲，張洪微

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

高粱是一種禾本科植物，其種植面積和產(chǎn)量?jī)H次于小麥、玉米、水稻和大麥，是第五大谷物[1-2]。高粱營(yíng)養(yǎng)豐富，淀粉在高粱顆粒中占有較多成分，其含量為65.3%～81.0%[3]。極低的生產(chǎn)成本和較高的淀粉含量使高粱成為優(yōu)質(zhì)淀粉的潛在來(lái)源之一，可在食品工業(yè)中用作其他谷物淀粉的替代品[4-5]。

由于高粱籽粒中淀粉和蛋白質(zhì)的緊密結(jié)合，致使淀粉得率低，提取純度不高[6]。目前，常用的淀粉提取方法有堿法[7]、超聲波法[8]和酶法[9]等。其中，堿法技術(shù)相對(duì)成熟，是一種常見(jiàn)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方法[10]。張正茂等人[11]通過(guò)比較甘薯淀粉的不同提取方法和工藝，發(fā)現(xiàn)堿提取后的淀粉得率和白度較高。其機(jī)理是蛋白質(zhì)、纖維素和其他與淀粉結(jié)合的成分被堿水解，釋放淀粉，提高淀粉得率[12]。此外，淀粉的提取還受到與蛋白質(zhì)的靜電反應(yīng)、疏水作用、氫鍵等影響[13]。研究表明[14-15]，用堿性蛋白酶提取淀粉不會(huì)影響淀粉顆粒的大小和結(jié)構(gòu)。目前，與其他谷物淀粉相比，高粱淀粉的研究較少。因此，為了進(jìn)一步提高高粱淀粉的利用率，有必要對(duì)高粱淀粉進(jìn)行提取和純化。

作為黑龍江省的主要種植品種之一，龍米糧1號(hào)高粱粗淀粉含量為76.54%，較其他品種高，富含0.32%的賴氨酸，具有早熟、抗倒伏等優(yōu)點(diǎn)。因此，研究以龍米糧1號(hào)高粱為原料，采用堿法提取高粱淀粉，確定最佳提取條件；用堿性蛋白酶進(jìn)一步純化高粱淀粉，提高淀粉純度，為高粱淀粉的生產(chǎn)和深加工提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1材料與試劑

高粱，產(chǎn)自大慶安達(dá)市，龍米糧1號(hào)；堿性蛋白酶（活力200 U/mg，菌種為地衣芽孢桿菌），上海源葉生物科技有限公司提供；其他試劑，均為分析純。

1.1.2 主要儀器

DG-88型粉碎機(jī)，廣州市德工機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LD4-40型離心機(jī)，北京精力有限公司產(chǎn)品；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；XH-C型旋渦混合器，江蘇省金壇市金城國(guó)際試驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；CHA-2A型氣浴恒溫振蕩器，常州申光儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高粱淀粉的提取

將高粱顆粒粉碎過(guò)80目篩，于40℃下干燥，得到高粱粗粉。將粗高粱粉與NaOH溶液按一定比例混合，在氣浴振蕩器中反應(yīng)一定時(shí)間。以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，刮去上層雜質(zhì)，沉淀物多次過(guò)濾至白色，在35℃烘箱中干燥24 h進(jìn)行烘干，得粗淀粉。

1.2.2 堿法提取高粱淀粉單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，以高粱淀粉得率為指標(biāo)。

堿法單因素試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 堿法單因素試驗(yàn)

1.2.3 高粱淀粉的純化

采用上述堿法提取高粱淀粉，得到高粱粗淀粉，用堿性蛋白酶法純化高粱淀粉。

1.2.4 酶法純化高粱淀粉單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

高粱中的蛋白質(zhì)通常與淀粉分子聚合。因此，為了提高淀粉的純度，可通過(guò)分解高粱淀粉分子上的蛋白質(zhì)而實(shí)現(xiàn)。通過(guò)課題組前期試驗(yàn)，以高粱淀粉純度為指標(biāo)，得出單因素試驗(yàn)范圍。

酶法單因素試驗(yàn)范圍見(jiàn)表2。

表2 酶法單因素試驗(yàn)范圍

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)堿法提取和酶法純化的單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果獲得高粱淀粉最佳提取和純化條件。

1.3 淀粉純度的測(cè)定

淀粉的純度按GB 5009.9—2016測(cè)定[16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件和Origin 2021pro數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿法提取高粱淀粉單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)高粱淀粉得率的影響

NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)高粱淀粉得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)高粱淀粉得率的影響

由1可知，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.3%逐漸增加到0.7%的過(guò)程中，淀粉得率先增加后降低。當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)，淀粉得率最高?？赡苁荖aOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)太低或太高，無(wú)法水解與淀粉結(jié)合的蛋白質(zhì)等其他成分，從而阻礙淀粉的釋放。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)高粱淀粉得率的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)高粱淀粉得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)高粱淀粉得率的影響

由圖2可知，淀粉得率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，到2 h時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)樵谔崛〕跗?，可溶性淀粉的溶解量隨著時(shí)間的增加而增加，但隨著提取體系黏度的增加，溶解速度變慢，使得淀粉得率的變化趨于平緩。然而，高粱淀粉得率在2 h后下降，這可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)堿液侵蝕淀粉，破壞了淀粉顆粒的表面形貌，從而降低了淀粉得率。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)高粱淀粉得率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)高粱淀粉得率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在25～35℃時(shí)，淀粉得率隨著溫度的升高而增加，而后淀粉的得率逐漸降低，因?yàn)殡S著溫度的升高，可溶性淀粉更容易分散在溶劑中，得率降低[17]。因此，過(guò)高的溫度不利于淀粉的提取，甚至破壞淀粉的結(jié)構(gòu)。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)高粱淀粉得率的影響

2.1.4 料液比對(duì)高粱淀粉得率的影響

料液比對(duì)高粱淀粉得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)高粱淀粉得率的影響

由圖4可知，料液比對(duì)高粱淀粉得率的影響顯著。隨料液比的增加，得率也增加。當(dāng)料液比在1∶15時(shí)，達(dá)到最高，提高比率可以使物料與溶液反應(yīng)更充分，促進(jìn)高粱蛋白質(zhì)和淀粉的分離；料液比高于1∶15后，物料可能與溶液反應(yīng)不充分，因此有下降趨勢(shì)。

2.2 堿法提取正交試驗(yàn)結(jié)果

從上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組重復(fù)3次。

堿法正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3，堿法正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 堿法正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

由表4可知，堿法提取高粱淀粉試驗(yàn)中，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和料液比均對(duì)高粱淀粉的得率有影響。由于D＞B＞C＞A，最佳工藝條件為A2B3C3D3，即NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，料液比1∶20。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得出，高粱粗淀粉得率為82.54%，淀粉為白色粉末。

表4 堿法正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 堿性蛋白酶法純化高粱淀粉單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 酶添加量對(duì)高粱淀粉純度的影響

酶添加量對(duì)高粱淀粉純度的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，在適宜的條件下，高粱淀粉的純度隨著蛋白酶的加入而逐漸升高，可能是隨著蛋白酶添加量的增加，蛋白質(zhì)和蛋白酶之間的接觸面積隨著酶添加量的增加而增大，導(dǎo)致淀粉純度逐漸上升[18]。由圖5可知，當(dāng)酶添加量達(dá)到0.8%時(shí)，淀粉的純度開(kāi)始下降，可能是在試驗(yàn)過(guò)程中，當(dāng)?shù)矸塾昧抗潭?，酶添加量達(dá)到一定值時(shí)，高粱淀粉的純度逐漸趨于穩(wěn)定。

圖5 酶添加量對(duì)高粱淀粉純度的影響

2.3.2 酶解溫度對(duì)高粱淀粉純度的影響

酶解溫度對(duì)高粱淀粉純度的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶解溫度對(duì)高粱淀粉純度的影響

由圖6可知，當(dāng)酶解溫度達(dá)到35℃時(shí)，淀粉純度上升到最高，隨后逐漸降低?？赡苁且?yàn)橛绊懨富盍Φ囊粋€(gè)重要指標(biāo)是溫度，當(dāng)酶解溫度低于此溫度時(shí)，蛋白酶活性與溫度呈正比；而酶解溫度高于此值時(shí)，蛋白酶活性與溫度呈負(fù)相關(guān)，最終蛋白酶失去活性[19]。而且由于淀粉在高溫條件下容易糊化，淀粉會(huì)變質(zhì)。因此，酶解溫度不宜過(guò)高。

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)高粱淀粉純度的影響

酶解時(shí)間對(duì)高粱淀粉純度的影響見(jiàn)圖7。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)高粱淀粉純度的影響

由圖7可知，酶解時(shí)間延長(zhǎng)后，淀粉純度逐漸增加，而后緩慢下降，最后基本穩(wěn)定。原因可能是當(dāng)酶解時(shí)間在1～2 h內(nèi)，淀粉與酶充分反應(yīng)，淀粉顆粒不斷脫落，提高了淀粉的純度；2 h后，淀粉顆粒中的蛋白質(zhì)可被酶水解至飽和，因此淀粉的純度趨于穩(wěn)定。

2.3.4 料液比對(duì)高粱淀粉純度的影響

料液比對(duì)高粱淀粉純度的影響見(jiàn)圖8。

圖8 料液比對(duì)高粱淀粉純度的影響

由圖8可知，料液比為1∶10時(shí)，淀粉的純度達(dá)到最高，然后逐漸降低。可能是隨著溶劑用量的增加，高粱中釋放出更多的淀粉，淀粉的純度逐漸提高；過(guò)量的溶劑會(huì)使溶液變稀，更多的非淀粉水溶性物質(zhì)溶解，從而降低可溶性淀粉的溶解度[20]，導(dǎo)致最終淀粉純度下降。

2.4 酶法純化正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，每組進(jìn)行3次平行。

酶法正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表5，酶法正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 酶法正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

由表6可知，4種因素均影響高粱淀粉的純度。主次順序?yàn)锳'＞D'＞C'＞B'，最佳提取條件為A'2B'1C'2D'1，即堿性蛋白酶添加量0.6%，料液比1∶10，酶解溫度35℃，酶解時(shí)間120 min。

表6 酶法正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)最佳為條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果/%

3 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)堿法提取和酶法純化龍米糧1號(hào)高粱淀粉工藝參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，考查了NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和料液比對(duì)高粱淀粉得率的影響以及酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度和料液比對(duì)高粱淀粉純度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，料液比1∶20時(shí)，高粱淀粉得率最佳；當(dāng)堿性蛋白酶添加量0.6%，料液比1∶10，酶解溫度35℃，酶解時(shí)間120 min時(shí)，高粱淀粉純度最優(yōu)。