草莓種苗根腐病病原菌鑒定及對14種殺菌劑的敏感性

姜莉莉，延義琳，宗曉娟，王曉芳，田中一久，武沖

(1.山東省果樹研究所/山東省現(xiàn)代設(shè)施果樹技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 泰安 271000；2.金鄉(xiāng)縣高河街道辦事處，山東 金鄉(xiāng) 272212)

草莓(Fragaria ananassaDuch.)為薔薇科草莓屬宿根性多年生草本植物。其果實(shí)汁多味美、營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛，素有“水果皇后”的美譽(yù)。我國草莓種植面積和產(chǎn)量均位居世界首位，其中山東、河北、遼寧、江蘇和四川是我國主要草莓產(chǎn)地[1]。在我國北方，草莓以設(shè)施栽培為主，高濕和連作易導(dǎo)致多種病害發(fā)生，嚴(yán)重影響草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展。根腐病是危害草莓的重要根部病害之一，屬于典型的土傳病害，防治難度較大。草莓根腐病具有較強(qiáng)的潛伏特性，癥狀一旦發(fā)生則蔓延迅速，導(dǎo)致草莓植株大面積死亡[2]。

生產(chǎn)上草莓主要通過種苗抽生匍匐莖苗進(jìn)行無性繁殖[3]。種苗繁育是草莓生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。種苗的健壯與否直接決定了草莓生產(chǎn)苗繁育數(shù)量，以及后期草莓的生長、產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。目前，對于草莓病害的研究多集中在生產(chǎn)階段，關(guān)于種苗病害的研究報道較少。草莓種苗根腐病的發(fā)生直接影響草莓生產(chǎn)苗品質(zhì)，進(jìn)而影響定植后收益。

本研究從山東省沂源縣采集‘章姬’草莓種苗根腐病病苗，對根腐病病原菌進(jìn)行分離、純化和菌種鑒定，同時評價其對14種常用殺菌劑的敏感性，以期為草莓種苗安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試感病植株

2022年3月1日，在山東省沂源縣某草莓種苗繁育基地選取穴盤種苗30株，品種為‘章姬’。

1.2 供試藥劑

95%氟硅唑原藥、96%啶酰菌胺原藥、95%咯菌腈原藥，山東濰坊潤豐化工股份有限公司；95%丙硫菌唑原藥，山東海利爾化工有限公司；97%氟環(huán)唑原藥、98%咪鮮胺原藥、95%葉菌唑原藥，安道麥輝豐(江蘇)有限公司；98%氟醚菌酰胺原藥、94%腈菌唑原藥、96%嘧菌酯原藥、98%肟菌酯原藥、98%吡唑醚菌酯原藥、95%己唑醇原藥、97%苯醚甲環(huán)唑原藥，山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司。

氟硅唑原藥以環(huán)己酮溶解，其余13種原藥以丙酮溶解，制備濃度為10×104mg/L的母液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的分離、純化

采用病組織分離法[5]:將草莓種苗根部以無菌手術(shù)刀縱向剖開，切取病健交界組織(圖1)，75%乙醇消毒10～15 s，無菌水沖洗3次。無菌濾紙吸干水分后，接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃黑暗培養(yǎng)3 d。待菌落形成后，挑取邊緣菌絲，接種于新的PDA培養(yǎng)基平板，進(jìn)行菌株純化。

圖1 草莓種苗根腐病病部

根據(jù)柯赫氏法則[6]，將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌株連帶培養(yǎng)基一同接種至‘章姬’草莓穴盤種苗莖基部，以無菌水處理為對照。進(jìn)行常規(guī)管理，觀察植株發(fā)病癥狀。

1.4 病原菌鑒定

取培養(yǎng)7 d的根腐病菌菌絲0.1 g，采用CTAB法提取基因組DNA，以ITS引物(ITS1/ITS4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收、純化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對，并采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。

1.5 室內(nèi)毒力測定

采用生長速率法進(jìn)行14種殺菌劑對草莓種苗根腐病菌的室內(nèi)毒力測定。

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對供試藥劑母液進(jìn)行梯度稀釋?？┚娴脑囼?yàn)濃度為0.025、0.050、0.100、0.250、0.500 mg/L，咪鮮胺的試驗(yàn)濃度為0.100、0.250、0.500、1.000、2.500 mg/L，其余藥劑的試驗(yàn)濃度均為0.500、1.000、2.500、5.000、10.000 mg/L。

在超凈工作臺上，取1.0 mL各濃度藥液于49mL滅菌后冷卻至50～60℃的PDA培養(yǎng)基中，混勻后制備3個含藥平板。待平板完全凝固后，以直徑7 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，倒置接種于PDA平板中央，以無菌水處理為對照。25℃黑暗培養(yǎng)，待對照菌落長至培養(yǎng)皿1/2～2/3時，以十字交叉法測定各處理菌落直徑。按照如下公式計算各濃度藥劑處理的菌絲生長抑制率(%)。

抑制率(%)＝(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/(對照菌落直徑－菌餅直徑)×100。

采用SPSS 18.0軟件計算各藥劑的菌絲生長EC50值和95%置信限。以抑菌活性最低藥劑的EC50值為基準(zhǔn)，計算各藥劑的相對毒力指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓種苗根腐病病原菌分離

從草莓種苗病根髓心部位共分離得到12株真菌，根據(jù)菌落形態(tài)合并為5類，數(shù)量分別為7、2、1、1、1株，對其中菌落形態(tài)相同且數(shù)量占絕對優(yōu)勢的菌株(GF－1)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，純化后在PDA培養(yǎng)基平板生長的菌落形態(tài)如圖2所示。菌落呈白色棉絮狀，較厚實(shí)，有同心輪紋。菌絲生長速度中等，7 d左右菌落直徑可至9 cm。后期產(chǎn)生褐色至黑色顆粒狀分生孢子角，培養(yǎng)時間越長，分生孢子角越多。與溫浩等[8]報道的草莓新擬盤多毛孢菌菌落形態(tài)相似。

圖2 草莓種苗根腐病病原菌GF－1菌落形態(tài)

將純化后的病原菌回接至‘章姬’草莓穴盤種苗上，14 d后葉片變紅、植株長勢弱(圖3)，與原始癥狀相同。

圖3 草莓種苗根腐病菌GF－1回接癥狀

2.2 草莓種苗根腐病病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用ITS通用引物ITS1/ITS4對GF－1菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為543 bp的DNA序列。將其在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與類擬盤多毛孢菌(Neopestalotiopsis)同源性最高，采用MEGA 5.0構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，發(fā)現(xiàn)其與Neopestalotiopsis mesopotamica(類擬盤多毛孢菌)聚在一枝。該菌株最早于1969年發(fā)現(xiàn)于伊拉克境內(nèi)的土耳其松[9]，在草莓植株上為首次報道。

圖4 草莓種苗根腐病菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 14種殺菌劑對草莓種苗根腐病菌菌絲生長的抑制率

由表1可以看出，咯菌腈對草莓根腐病菌的抑制活性最高，濃度為0.025～0.500 mg/L時，抑制率為22.21%～93.49%；其次為吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑，濃度為0.500～10.000 mg/L時，抑制率分別為29.82%～96.95%和23.94%～89.00%。咪鮮胺濃度為0.100～2.500 mg/L時，抑制率為30.83%～75.18%。濃度為0.500～10.000 mg/L時，氟硅唑和氟環(huán)唑的抑制率分別為16.44%～92.01%和8.90%～89.29%；氟醚菌酰胺、葉菌唑和己唑醇的抑制率分別為17.84%～73.60%、13.56%～78.75%和11.70%～73.31%；丙硫菌唑、啶酰菌胺、肟菌酯、嘧菌酯和腈菌唑的抑制率分別為24.06%～63.63%、10.39%～70.31%、13.19%～68.41%、15.56%～65.24%和7.01%～71.58%。

表1 14種殺菌劑對草莓種苗根腐病菌菌絲生長的抑制率

表1(續(xù))

2.4 14種殺菌劑對類擬盤多毛孢菌的室內(nèi)毒力

由表2可以看出，在14種供試殺菌劑中，腈菌唑?qū)︻悢M盤多毛孢菌菌絲生長的室內(nèi)毒力最低，EC50值為4.549 mg/L。以其為基準(zhǔn)，計算其它藥劑的相對毒力指數(shù)，咯菌腈對草莓種苗類擬盤多毛孢菌的室內(nèi)毒力最高，EC50值僅為0.070 mg/L，較腈菌唑的相對毒力指數(shù)為64.986。吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺和氟硅唑的室內(nèi)毒力也較高，EC50值分別為1.009、1.499、1.606、1.797 mg/L，相對毒力指數(shù)分別為4.508、3.035、2.833和2.531。氟環(huán)唑、氟醚菌酰胺、葉菌唑和己唑醇的EC50值分別為2.457、2.719、2.874、3.268 mg/L，相對毒力指數(shù)分別為1.851、1.673、1.583和1.392。丙硫菌唑、啶酰菌胺、肟菌酯和嘧菌酯對類擬盤多毛孢菌的室內(nèi)毒力相對較低，EC50值分別為3.794、4.013、4.407、4.514 mg/L，相對毒力指數(shù)分別為1.199、1.134、1.032和1.008。

表2 14種殺菌劑對類擬盤多毛孢菌菌絲生長的室內(nèi)毒力

3 討論與結(jié)論

草莓種苗繁育高峰期主要集中在5—8月，高溫多雨極易引起病害蔓延。草莓根腐病是由土傳病原真菌侵染引起的重要根部病害之一[10]。本研究從‘章姬’草莓種苗根腐病病根髓心部位分離得到多株病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，該病原菌為類擬盤多毛孢菌(Neopestalotiopsis mesopotamica)。

類擬盤多毛孢菌的寄主范圍較廣，可侵染月季、牛油果、碧根果等。侵染草莓可引起紅葉病，發(fā)病初期葉片為紅色，后期整株萎蔫、死亡，對‘甜查理’等品種的危害尤其嚴(yán)重[11]。近年來，該屬病原菌危害草莓的報道逐漸增多，可引起草莓葉斑病、根腐病、莖腐病等多種病害[12，13]，但在‘章姬’種苗上為首次報道。

目前，化學(xué)殺菌劑仍是防治草莓病害的主要手段。然而，《中國農(nóng)藥信息網(wǎng)》顯示，防治草莓根腐病的產(chǎn)品僅包括熏蒸劑棉隆和生防菌劑，尚無獲得登記的化學(xué)藥劑。本研究選取14種常用化學(xué)殺菌劑，對分離得到的類擬盤多毛孢菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，發(fā)現(xiàn)咯菌腈的抑菌活性最高，EC50值僅為0.070 mg/L，較腈菌唑的相對毒力指數(shù)為64.986；吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺和氟硅唑的室內(nèi)毒力也較高，EC50值分別為1.009、1.499、1.606、1.797 mg/L。

咯菌腈屬于苯吡咯類殺菌劑，為假單胞菌代謝產(chǎn)物硝吡咯菌素的類似物，其殺菌譜較廣，但不具有內(nèi)吸性[14]。吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，通過阻礙真菌線粒體呼吸而抑制病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長[15]。苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑均為三唑類殺菌劑，具有保護(hù)、治療和內(nèi)吸活性。其中，苯醚甲環(huán)唑通過干擾病原菌細(xì)胞C14脫甲基化作用、抑制病原菌麥角甾醇的生物合成、破壞細(xì)胞膜的生理作用從而導(dǎo)致真菌死亡[16]；氟硅唑具有較強(qiáng)的滲透性[17]。生產(chǎn)上，上述藥劑均可用于草莓種苗根腐病的防治，但需合理輪用和混用，以延緩抗藥性的產(chǎn)生。