檸檬醛誘導(dǎo)的擬南芥抗旱性及差異表達(dá)基因分析

張明迪， 白九元， 王 鑫， 羅 梅， 趙 云， 張年輝

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065)

1 引 言

植物營(yíng)固著生長(zhǎng)，當(dāng)外界環(huán)境中出現(xiàn)不利因素時(shí)無(wú)法通過(guò)逃逸趨利避害，而各種生物和非生物脅迫都會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成傷害.其中干旱脅迫是制約植物生長(zhǎng)最嚴(yán)重的脅迫之一，對(duì)植物可造成多方面的傷害，包括種子萌發(fā)和早期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、氣孔開(kāi)度和光合作用、水分關(guān)系、種子品質(zhì)和植株產(chǎn)量等[1].受水資源短缺和氣候變化的影響，預(yù)計(jì)干旱在全球范圍內(nèi)發(fā)生的頻率和范圍還會(huì)有進(jìn)一步增加和擴(kuò)大的趨勢(shì).據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)西北地區(qū)的農(nóng)業(yè)干旱災(zāi)害面積由20世紀(jì)50年代的64.1萬(wàn)公頃增加到21世紀(jì)的330.2萬(wàn)公頃[1](1萬(wàn)公頃=100 km2)，這嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全.目前也有一些技術(shù)和方法用以預(yù)防或者緩解干旱：(1) 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上倡導(dǎo)節(jié)水農(nóng)業(yè).如采用滴灌、“赤字”灌溉等代替?zhèn)鹘y(tǒng)的漫灌以?xún)?yōu)化灌溉方式提高水資源利用效率；如通過(guò)監(jiān)測(cè)植物的表型、光合速率、蒸騰速率和水分利用效率等判斷植物體內(nèi)水分狀態(tài)為確定植物供水時(shí)間提供精準(zhǔn)有效的參考等.(2) 通過(guò)選育耐旱抗旱品種以從根本上改善植物在干旱環(huán)境中的適應(yīng)性.如利用雜種優(yōu)勢(shì)將具有目標(biāo)性狀的遺傳群體持續(xù)進(jìn)行雜交組合直至選育出目標(biāo)品種的傳統(tǒng)育種策略；或基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)將在干旱中起正調(diào)控作用的基因過(guò)表達(dá)或者敲除沉默起負(fù)調(diào)控作用的基因從而獲得耐旱抗旱新品種的現(xiàn)代育種策略[2-4].但無(wú)論是節(jié)水農(nóng)業(yè)的推進(jìn)還是新品種的選育，盡管已經(jīng)并且還將不斷取得進(jìn)展和突破，然而當(dāng)真正應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐時(shí)仍存在著投資成本過(guò)高，研究成果難以轉(zhuǎn)化為實(shí)際成果和效益等弊端，干旱脅迫依舊是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中要面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn).

化感作用是自然界中廣泛存在的一種生物化學(xué)調(diào)控機(jī)制，是一個(gè)生物體自身產(chǎn)生的化合物(化感物質(zhì))對(duì)另一生物體產(chǎn)生的積極或者消極影響[5].植物化感作用常被用于農(nóng)田雜草的防治.高粱被認(rèn)為是具有強(qiáng)烈化感作用的植物之一，其水浸提物對(duì)于抑制農(nóng)田雜草的生長(zhǎng)十分有效[6].化感作用也可應(yīng)用于防治植物病蟲(chóng)害[7].近年來(lái)，一些研究者還評(píng)估了化感作用在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物抗非生物脅迫方面的潛力[8].例如Munir[9]把5%～10%的高粱浸提物作為外源物質(zhì)施加到小麥植株上顯著改善了小麥在熱脅迫下的適應(yīng)性.基于化感物質(zhì)大多源于植物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，通常價(jià)格低廉且簡(jiǎn)單易得，相較于推進(jìn)節(jié)水農(nóng)業(yè)和選育耐旱抗旱新品種，利用化感作用提高植物的抗旱性具有投資少見(jiàn)效快的特點(diǎn)，同時(shí)相對(duì)簡(jiǎn)單的噴灑處理方式在應(yīng)用時(shí)具有更強(qiáng)的實(shí)用性和可操作性.

檸檬醛(3,7-二甲基-2,6-辛二烯，C10H16O)是一種無(wú)環(huán)開(kāi)鏈單萜稀醛類(lèi)天然活性物質(zhì)，分子量為152.23，廣泛存在于多種植物中，尤其是具有揮發(fā)性香味的芳香植物，如檸檬草、樟樹(shù)和山蒼子等[10].檸檬醛的化感作用已經(jīng)有過(guò)一些研究：如Graa等[11]的研究發(fā)現(xiàn)檸檬醛對(duì)農(nóng)作物和雜草具有毒害效應(yīng)，并且對(duì)雜草的抑制效果遠(yuǎn)高于農(nóng)作物；檸檬醛可以改變擬南芥根和芽中生長(zhǎng)素與乙烯的含量以抑制根的生長(zhǎng)[12]；檸檬醛會(huì)對(duì)擬南芥開(kāi)花和種子形成產(chǎn)生一定的傷害[13].另外，Chaimovitsh等[14]發(fā)現(xiàn)檸檬醛處理可導(dǎo)致小麥根細(xì)胞中新形成的細(xì)胞壁畸形，同時(shí)也影響細(xì)胞分裂時(shí)期微管的正常形態(tài).但這些研究考察的基本都是較高濃度的檸檬醛(通?！?000 μmol/L)對(duì)受體植物的抑制作用，還沒(méi)有涉及到檸檬醛對(duì)植物生長(zhǎng)及代謝的促進(jìn)作用.

本研究以較低濃度的檸檬醛處理擬南芥，以探討檸檬醛在誘導(dǎo)植物抗旱性方面的潛力.通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)分析檸檬醛處理后誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，并對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，分析檸檬醛誘導(dǎo)植物抗旱性增強(qiáng)的可能分子機(jī)制，從而為將檸檬醛應(yīng)用于提高植物的抗旱性打下一定的基礎(chǔ).

2 材料與方法

2.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料為哥倫比亞野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)，由本實(shí)驗(yàn)室提供.

檸檬醛(CAS：5392-40-5)購(gòu)自Sigma公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑購(gòu)自TaKaRa公司，實(shí)驗(yàn)中所用的其它試劑均為分析純.

2.2 方 法

2.2.1 檸檬醛的施加和干旱脅迫的處理 擬南芥種子經(jīng)75%乙醇、1%次氯酸鈉消毒后播種在MS培養(yǎng)基上，于4 ℃冰箱春化3 d后放入光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng).生長(zhǎng)條件為：溫度22 ℃，相對(duì)濕度55%，光照強(qiáng)度120 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h光照8 h黑暗.培養(yǎng)1 w后選取生長(zhǎng)一致的幼苗移栽到土壤中.擬南芥幼苗在土壤中生長(zhǎng)兩周后，分別將200 μmol/L，400 μmol/L，600 μmol/L和800 μmol/L檸檬醛(配制不同工作濃度檸檬醛所用溶劑為0.1%乙醇)噴灑在擬南芥葉片表面，同時(shí)以噴灑水和0.1%乙醇作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組.噴灑時(shí)間為每天上午九點(diǎn)，連續(xù)噴灑2 d，噴灑程度以擬南芥葉片上出現(xiàn)水珠且水珠不滴落為宜.噴灑過(guò)后用保鮮膜覆蓋以防止檸檬醛揮發(fā)，3 d后揭開(kāi)保鮮膜并停止?jié)菜_(kāi)始干旱脅迫處理，期間觀察各處理組擬南芥的生長(zhǎng)情況并拍照記錄.干旱2 w后進(jìn)行復(fù)水，3 d后統(tǒng)計(jì)各處理組中擬南芥的存活率.

2.2.2 取樣及樣品RNA的提取 葉面噴灑處理結(jié)束后，揭開(kāi)覆膜的同時(shí)取0.1%乙醇對(duì)照組(CK)和200 μmol/L檸檬醛處理組(Citral)中的擬南芥葉片.CK和Citral分別取3個(gè)重復(fù)，各組的3個(gè)重復(fù)混樣后參照本實(shí)驗(yàn)室先前建立的方法進(jìn)行RNA的提取[15].

2.2.3 測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序 提取的RNA經(jīng)去核糖體RNA處理后，通過(guò)六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一條鏈，dUTP代替dTTP合成cDNA第二條鏈的方法進(jìn)行cDNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建.構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)檢合格后經(jīng)Illumina平臺(tái)測(cè)序.文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序工作委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行.

2.2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控及評(píng)估 測(cè)得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)有各種雜質(zhì)和非目的序列的污染.利用FastQC 0.11.2軟件評(píng)估原始測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，同時(shí)通過(guò)Trimmomatic 0.36軟件對(duì)測(cè)序接頭、含有不確定堿基(N)的序列以及低質(zhì)量序列(堿基質(zhì)量值Q30低于95%)進(jìn)行過(guò)濾后得到有效的可用數(shù)據(jù)(clean reads).

2.2.5 DEGs的篩選 利用String Tie 1.3.3b軟件計(jì)算各樣品的轉(zhuǎn)錄本豐度，統(tǒng)計(jì)各自的表達(dá)量.利用R Package中的DEGseq 1.26.0篩選DEGs，差異條件的設(shè)定閾值為：差異顯著性檢驗(yàn)值qValue < 0.05，差異倍數(shù)|log2FoldChange| > 2.

2.2.6 DEGs的分析 利用R Package中的topGO 2.24.0進(jìn)行GO分析，了解差異表達(dá)基因可能具有的生物學(xué)功能；利用R Package中的Cluster Profiler 3.0.5進(jìn)行KEGG富集，分析差異表達(dá)基因涉及的代謝通路和調(diào)控途徑.

2.2.7 DEGs的RT-qPCR驗(yàn)證 從檸檬醛處理后表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)的DEGs中篩選4個(gè)與熱激蛋白家族基因(heat shock proteins，HSPs)相關(guān)的基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，即：AT1G07400，AT2G26150，AT4G25200，AT4G12400.根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列委托上海生工生物工程有限公司合成(見(jiàn)表1).利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，以擬南芥中的β-Actin基因作為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR.反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL TB GreenPremixExTaqⅡ，1 μL引物-F，1 μL引物-R，2 μL cDNA模板，8.5 μL 無(wú)菌水.反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，30 s預(yù)變性，95 ℃，10 s變性，58.5 ℃，30 s退火，72 ℃，10 s延伸，循環(huán)39次.采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算差異基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)基因包含3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù).通過(guò)t檢驗(yàn)分析差異顯著性，利用GraphPad Prism 8.0繪制結(jié)果展示圖.

表1 RT-qPCR引物序列信息Tab.1 The information about primer sequence of RT-qPCR

3 結(jié)果與分析

3.1 檸檬醛對(duì)擬南芥抗旱性的誘導(dǎo)

為了探討不同濃度檸檬醛處理對(duì)擬南芥抗旱性能的影響，擬南芥幼苗經(jīng)葉面噴施不同濃度檸檬醛后進(jìn)行兩周干旱處理，隨后再?gòu)?fù)水3 d.圖1表型觀察顯示出，干旱脅迫處理過(guò)程中，噴灑水和0.1%乙醇的對(duì)照組中擬南芥葉片萎蔫、植株皺縮和死亡較快.噴灑檸檬醛的處理組則出現(xiàn)兩種截然不同的趨勢(shì)：400 μmol/L以下低濃度檸檬醛處理后的擬南芥在干旱中的生長(zhǎng)狀況更好，與其他組相比葉片仍能保持嫩綠和堅(jiān)挺，植株也沒(méi)有呈現(xiàn)出即死表型；而600 μmol/L和800 μmol/L高濃度檸檬醛處理后，隨著干旱脅迫的進(jìn)行，植株過(guò)早地出現(xiàn)了干枯和死亡.干旱結(jié)束復(fù)水后統(tǒng)計(jì)不同處理組中擬南芥的存活率，發(fā)現(xiàn)各組之間具有顯著差異.如圖2所示，兩個(gè)對(duì)照組的存活率大約為40%，低濃度檸檬醛處理后顯著提高了擬南芥在干旱脅迫條件下的存活率，尤其在200 μmol/L處理下，存活率接近80%.但是高濃度檸檬醛處理后的擬南芥在干旱條件下的存活率極低，600 μmol/L下的存活率僅有10%～20%，800 μmol/L處理中的擬南芥在面臨干旱時(shí)幾乎無(wú)一存活.由此可見(jiàn)，200 μmol/L的檸檬醛可以誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生抗旱性.

圖1 不同處理后擬南芥在不同時(shí)期的生長(zhǎng)狀態(tài)情況(a)各階段總體表型； (b)干旱14 d單個(gè)典型植株的表型Fig.1 The status of Arabidopsis thaliana in different stages induced by different treatments(a) The overall phenotype at each stage； (b) the representative phenotype of a signal plant after drought 14 d

3.2 用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的RNA質(zhì)量分析

為了揭示檸檬醛處理增強(qiáng)擬南芥幼苗抗旱性的分子機(jī)制，我們通過(guò)RNA-seq分析了經(jīng)200 μmol/L檸檬醛處理與未經(jīng)處理擬南芥幼苗之間的DEGs，以及受到影響的生理過(guò)程與代謝通路.為了構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組分析的測(cè)序文庫(kù)，我們提取了0.1%乙醇對(duì)照組和200 μmol/L檸檬醛處理組中擬南芥葉片總RNA，并利用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)了RNA質(zhì)量.所得結(jié)果表明(圖3)，CK組和Citral組的RNA在5S、18S和25S處有明顯單一的吸收峰，峰值較高并且沒(méi)有雜峰，25S條帶的亮度大約是18S的兩倍，提取的RNA具有很好的完整性.表2數(shù)據(jù)顯示提取的RNA濃度均在1000 ng/μL以上，rRNA量的比值25S/18S都大于2，RNA完整性檢驗(yàn)值RIN全部在8.5以上，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量良好，滿(mǎn)足后續(xù)建庫(kù)要求.

表2 葉面噴施0.1%乙醇(CK)和噴施200 μmol/L檸檬醛(Citral)的擬南芥葉片RNA質(zhì)量信息Tab.2 RNA information of Arabidopsis thaliana leaves sprayed by 0.1% ethanol (CK) and 200 μmol/L citral (Citral)

圖3 葉面噴施0.1%乙醇(a)和噴施200 μmol/L檸檬醛(b)的擬南芥葉片RNA提取檢測(cè)結(jié)果Fig.3 RNA test results of Arabidopsis thaliana leaves sprayed by 0.1% ethanol (a) and 200 μmol/L citral (b)

Different letters represent the significant difference ofArabidopsisthalianasurvival rate in different treatments (P<0.05)

3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控評(píng)估

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)的評(píng)估和質(zhì)控統(tǒng)計(jì)匯總結(jié)果見(jiàn)表3.CK和Citral的數(shù)據(jù)總量相對(duì)比較均衡，數(shù)據(jù)過(guò)濾比相差無(wú)幾，測(cè)序數(shù)據(jù)可信度較高.Q30可以作為評(píng)估堿基測(cè)序質(zhì)量的優(yōu)秀線，結(jié)果顯示所有樣本的Q30值均在95%以上，測(cè)序質(zhì)量良好.同時(shí)測(cè)序數(shù)據(jù)與擬南芥參考基因組的比對(duì)率在95%以上，數(shù)據(jù)符合模式物種的比對(duì)率(一般在90%左右，不低于80%).從數(shù)據(jù)的質(zhì)控結(jié)果和評(píng)估分析可以判斷出所測(cè)數(shù)據(jù)真實(shí)有效、可信可用，完全可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析.

表3 擬南芥葉面噴施0.1%乙醇對(duì)照組(CK)和200 μmol/L檸檬醛處理組(Citral)的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控信息Tab.3 Quality control information about sequencing data of the CK and Citral with Arabidopsis thaliana leaves sprayed by 0.1% ethanol and 200 μmol/L citral, respectively

3.4 檸檬醛處理后的DEGs分析

通過(guò)計(jì)算不同處理樣本的基因表達(dá)水平和設(shè)定差異條件進(jìn)行篩選后，得到了檸檬醛處理組和對(duì)照組之間的DEGs，結(jié)果見(jiàn)圖4可視化散點(diǎn)圖.圖中黑點(diǎn)代表基因表達(dá)水平在兩組中沒(méi)有差異，紅點(diǎn)表示檸檬醛處理組相較于對(duì)照組表達(dá)水平上調(diào)的基因，綠點(diǎn)代表檸檬醛處理組中下調(diào)表達(dá)的基因.圖4直觀地反映出與在擬南芥葉片上噴灑0.1%乙醇的對(duì)照組相比，處理組中噴灑200 μmol/L檸檬醛后共出現(xiàn)230個(gè)DEGs，其中129個(gè)上調(diào)表達(dá)，101個(gè)下調(diào)表達(dá).

圖4 擬南芥葉面噴施0.1%乙醇對(duì)照組(CK)和200 μmol/L檸檬醛處理組(Citral)間的差異表達(dá)基因Fig.4 Differentially expressed genes between the CK and Citral with Arabidopsis thaliana leaves sprayed by 0.1% ethanol and 200 μmol/L citral, respectively

3.5 DEGs的GO和KEGG分析

GO功能注釋主要提供有關(guān)于生物進(jìn)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)以及分子功能(molecular function)三方面的信息.圖5對(duì)DEGs的GO分類(lèi)結(jié)果顯示，DEGs在生物進(jìn)程中主要富集到的條目是：應(yīng)激反應(yīng)、多組織進(jìn)程、生物調(diào)控、免疫系統(tǒng)進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程等.在細(xì)胞組分中富集到的主要為：細(xì)胞及細(xì)胞組件、其它組織及其組件、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、核苷等.主要富集的分子功能有：結(jié)合、蛋白標(biāo)簽、抗氧化活性、催化活性、酶調(diào)節(jié)活性等.

同時(shí)，KEGG分析有助于全面了解DEGs所涉及的代謝途徑，對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因顯著富集在52條代謝通路上.按富集因子及顯著性排序，前10條依次為：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、抗原處理和遞呈、雌激素信號(hào)通路、多物種長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)途徑、植物與病原體互作、MAPK信號(hào)通路、NOD-like受體信號(hào)通路、胞吞作用、精氨酸和脯氨酸代謝、氮代謝.

3.6 DEGs的RT-qPCR驗(yàn)證

檸檬醛處理后表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)的基因許多都與HSPs相關(guān)，從中篩選出差異表達(dá)倍數(shù)較高的4個(gè)基因，即AT1G07400，AT2G26150，AT4G25200，AT4G12400，進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證.圖7結(jié)果表明，4個(gè)基因在RT-qPCR中的表達(dá)水平變化趨勢(shì)和轉(zhuǎn)錄組中分析出的變化情況一致.因此本研究中的測(cè)序和差異基因表達(dá)分析結(jié)果具有良好的可信度和可靠性.

圖7 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證(a)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的差異表達(dá)基因相對(duì)表達(dá)量(以未經(jīng)檸檬醛處理的對(duì)照組CK中基因表達(dá)量為1); (b)熒光定量PCR驗(yàn)證的檸檬醛處理組Citral和對(duì)照組CK中差異表達(dá)基因相對(duì)表達(dá)量(以β-Actin的表達(dá)量為1)*代表相較于對(duì)照組CK的差異顯著水平(*P<0.05，**P<0.01)Fig.7 RT-qPCR verification of DEGs in RNA-seq(a) The relative expression of DEGs analyzed by RNA-seq (take the gene expression level of CK as 1); (b) the relative expression of DEGs in Citral and CK verified by RT-qPCR (take the expression level of β-Actin as 1)The asterisk represents the significant level of difference compared to the CK (*P<0.05, **P<0.01)

4 討 論

Graňa等[13]證明檸檬醛會(huì)破壞擬南芥的水分狀態(tài)，檸檬醛處理的擬南芥生長(zhǎng)緩慢，適應(yīng)性變差，種子存活數(shù)量減少，生殖和繁殖也受到了嚴(yán)重的抑制，對(duì)擬南芥來(lái)說(shuō)是一種有害的刺激物.但需要指出的是Graňa等使用的檸檬醛工作濃度一般都比較高(≥1000 μmol/L)，并且通常采用每天對(duì)植物進(jìn)行葉面噴灑或者每?jī)商爝M(jìn)行一次根部澆灌的連續(xù)處理方式[11-13].本研究通過(guò)改變檸檬醛的工作濃度和作用方式以考察檸檬醛是否可以作為誘導(dǎo)物增強(qiáng)擬南芥的抗旱性，并借助轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)深入探討檸檬醛誘導(dǎo)抗旱性的分子機(jī)理.

為避免檸檬醛的持續(xù)作用給植物帶來(lái)的強(qiáng)烈傷害，本研究處理材料的方式為：將檸檬醛噴灑在擬南芥葉片表面且3 d的處理過(guò)程只噴灑兩次.同時(shí)，我們還降低了檸檬醛的工作濃度.我們通過(guò)設(shè)置200 μmol/L，400 μmol/L，600 μmol/L，800 μmol/L四個(gè)濃度梯度的檸檬醛工作濃度處理擬南芥幼苗，以尋找檸檬醛誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生抗旱性的適宜濃度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組和較高濃度檸檬醛處理組相比，200 μmol/L低濃度檸檬醛可以誘導(dǎo)擬南芥抗旱性的產(chǎn)生，其處理后明顯改善了擬南芥在干旱環(huán)境中的適應(yīng)性，最后的存活率高達(dá)80%，而未經(jīng)檸檬醛處理的對(duì)照組只有40%左右的存活率(圖2).

大量的研究表明，當(dāng)植物被病原菌感染，或者根部定植有益微生物，或者經(jīng)一些天然或人工化合物誘導(dǎo)后，會(huì)表現(xiàn)出對(duì)隨后的病菌感染、昆蟲(chóng)咬食、非生物脅迫等更快更強(qiáng)的適應(yīng)性和抵抗力，這一過(guò)程稱(chēng)為引發(fā)效應(yīng)(priming)[16].本研究用200 μmol/L檸檬醛處理擬南芥后，使得擬南芥對(duì)后續(xù)干旱脅迫的耐受性增強(qiáng)(圖1).因此，從現(xiàn)象上分析，檸檬醛也可以作為一種引發(fā)效應(yīng)的誘導(dǎo)物，其處理后誘導(dǎo)了擬南芥的引發(fā)效應(yīng)，從而使擬南芥在后續(xù)的干旱脅迫中表現(xiàn)出了更強(qiáng)的適應(yīng)性和更好的抵抗能力.

為深入了解檸檬醛處理后基因表達(dá)水平的變化，尤其是防御相關(guān)基因的表達(dá)變化，我們通過(guò)RNA-seq分析了經(jīng)200 μmol/L檸檬醛處理后的DEGs.結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)檸檬醛處理后共有230個(gè)DEGs，其中129個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因中有許多都是和HSPs相關(guān)的基因：如HSP20-like伴侶蛋白編碼基因AT1G07400，熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子A2(HSFA2)編碼基因AT2G26150，定位于線粒體的小熱激蛋白AT4G25200，還有和HSP90/HSP70共同作為伴侶蛋白發(fā)揮作用的AT4G12400等.隨后設(shè)計(jì)引物通過(guò)RT-qPCR也證實(shí)這些基因的確會(huì)在檸檬醛處理后出現(xiàn)顯著上調(diào)(圖7).HSPs是具有保護(hù)作用的應(yīng)激蛋白，在蛋白質(zhì)的折疊以及調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫等方面發(fā)揮著重要作用，其存在于所有的植物物種中，因與植物的脅迫有關(guān)也被稱(chēng)為脅迫防御蛋白[17].HSPs通常作為分子伴侶發(fā)揮作用以維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài).在逆境條件下一些功能蛋白變得不穩(wěn)定會(huì)出現(xiàn)部分解折疊，此時(shí)HSPs被激活后以一種不消耗能量的方式和部分解折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合以防止蛋白質(zhì)出現(xiàn)不可逆聚集，保護(hù)蛋白質(zhì)使其保持可被正確折疊的狀態(tài).而后，與HSPs結(jié)合的功能蛋白通過(guò)依賴(lài)ATP的方式重新折疊為天然活性構(gòu)象，進(jìn)而恢復(fù)其正常的生理活性[18].DEGs的GO注釋中富集到最多的功能條目是應(yīng)激反應(yīng)(圖5)，KEGG通路富集結(jié)果表明DEGs顯著富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工處理(圖6)，這和HSPs參與植物的應(yīng)激防御以及在檸檬醛處理后表達(dá)量升高是一致的[19].

圖6 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集Fig.6 KEGG pathway enrichment of differentially expressed genes

已有研究表明，HSPs在植物的干旱脅迫中發(fā)揮著重要的功能.例如Kim等[20]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AtHSP17.8(AT1G07400)可以增強(qiáng)擬南芥和生菜對(duì)脫水的抵抗力；Sun等[21]證實(shí)AtHSP17.6A(AT5G12030)的過(guò)表達(dá)能夠提高擬南芥的耐旱性；Li等[22]發(fā)現(xiàn)Hsp17.6CII(AT5G12020)可以增加過(guò)氧化氫酶的活性.過(guò)氧化氫酶是一種重要的抗氧化酶，可以清除逆境條件下植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，其活性可作為衡量抗旱能力的指標(biāo)之一，一般情況下其活性越高，抗旱性越強(qiáng)[22].檸檬醛誘導(dǎo)擬南芥抗旱過(guò)程中HSPs相關(guān)基因出現(xiàn)大量上調(diào)表達(dá)，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些具有抗旱作用的功能蛋白編碼基因如抗氧化酶系中的超氧化物歧化酶SOD(AT1G08830)、過(guò)氧化物酶POD(AT1G05240)、過(guò)氧化氫酶CAT(AT1G19570)等基因的表達(dá)量未發(fā)生明顯的變化(數(shù)據(jù)未列).表明檸檬醛的處理并未直接活化抗氧化防御基因的表達(dá)，而是在引發(fā)效應(yīng)的啟動(dòng)階段通過(guò)某種途徑激活了熱激轉(zhuǎn)錄因子(如HSFA2等)的活性，進(jìn)而活化HSPs的表達(dá)，使得植株處于對(duì)后續(xù)干旱脅迫更為敏感的狀態(tài).從而在后續(xù)的干旱脅迫下，通過(guò)HSPs的分子伴侶功能使逆境下部分解折疊的抗旱功能蛋白保持生理活性的穩(wěn)態(tài)，顯示出對(duì)干旱脅迫更好的適應(yīng)性和抵抗力[17, 18].

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)檸檬醛在誘導(dǎo)擬南芥抗旱方面的潛力，并通過(guò)差異基因分析探討了檸檬醛提高擬南芥抗旱性的可能分子機(jī)制.研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘檸檬醛在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的潛在應(yīng)用價(jià)值，尤其是開(kāi)發(fā)植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑和植物抗旱保護(hù)劑提供了參考，也為提高植物的抗旱性提供了新的思路和方向.