王 杰， 孫明會， 隆 琦， 范元嬋， 吳 鷹， 郭意龍， 張凱遙， 石彩云， 陳大福,2， 郭 睿,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所, 福州 350002)

1 引 言

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是ncRNA世界的重要成員之一，一般長度大于200 nt且包含2個以上外顯子，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成[1]. 類似于mRNA，lncRNA具有5′端帽子和3′ployA尾巴,但多數(shù)lncRNA的表達(dá)量較低且長度更短[2]. 在發(fā)現(xiàn)之初，lncRNA被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄過程的副產(chǎn)物，但隨著研究的不斷增多與深入，lncRNA已被證實(shí)在基因組印記、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等諸多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[3,4]. LncRNA的作用方式靈活多樣，不僅能通過順式(cis)作用對其相鄰蛋白編碼基因的的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，還可以通過反式作用(trans)調(diào)控距離較遠(yuǎn)基因的表達(dá)[1]；此外，lncRNA還能作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)與其他含相同miRNA反應(yīng)元件(miRNA response element, MRE)的RNA分子競爭性結(jié)合miRNA，從而間接調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)水平[5]. CeRNA機(jī)制已在人類、其他哺乳動物和植物中被廣泛證實(shí). Xue等[6]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的Loc339803可通過競爭結(jié)合miR-30a-5p進(jìn)而調(diào)控靶基因SNAIL1，最終促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移；Wang等[7]研究表明IMFlnc1可以通過競爭結(jié)合miR-199a-5p并影響caveolin-1的表達(dá)進(jìn)而影響豬中肌內(nèi)脂肪含量. Yuan等[8]建立了植物中ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫PceRBase(http://bis.zju.edu.cn/pcernadb/index.jsp)，收錄了擬南芥在內(nèi)26種植物中潛在的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò). 但目前l(fā)ncRNA在意蜂工蜂中腸發(fā)育中的調(diào)控作用尚不清楚. 通過解析高表達(dá)lncRNA在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的表達(dá)譜及潛在調(diào)控作用，可為明確HlncRNA的分子功能提供理論依據(jù)，并為闡明中腸發(fā)育機(jī)理打下基礎(chǔ).

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，人們在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、家蠶(Bombyxmori)、小菜蛾(Plutellaxylostella)[9-11]等昆蟲中鑒定到大量lncRNA. 研究表明lncRNA可參與昆蟲的生殖、發(fā)育、行為和免疫等過程. 但蜜蜂lncRNA的研究較為滯后，迄今僅有少量的研究報道. 例如，郭昱等[12]通過比較意蜂蜂王與工蜂4、5和6日齡幼蟲中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在幼蟲的發(fā)育進(jìn)程中差異lncRNA的數(shù)量逐漸增多，功能注釋顯示差異lncRNA在組織發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮潛在的調(diào)控作用. Chen等[13]通過對意大利蜜蜂的處女王、產(chǎn)卵蜂王、抑制產(chǎn)卵的蜂王以及產(chǎn)卵恢復(fù)的蜂王進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出位于控制卵巢大小數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)的14條lncRNA，并進(jìn)一步篩選出卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵相關(guān)的2條lncRNA XLOC_073978和XLOC_081294.

意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica，簡稱意蜂)是西方蜜蜂(Apismellifera)的亞種之一，因具有性情溫順、采集能力優(yōu)越及分泌蜂王漿能力和造脾能力較強(qiáng)的顯著優(yōu)勢而在世界各養(yǎng)蜂國家中廣泛飼養(yǎng). 中腸是昆蟲的重要組織，除了直接發(fā)揮食物消化和營養(yǎng)吸收的功能外，還能分泌抗菌肽和活性氧進(jìn)而參與昆蟲的免疫及解毒過程[14]. 前人對于蜜蜂腸道的研究主要涉及腸道微生物方面[15]，而腸道發(fā)育機(jī)理的相關(guān)研究很少. 此前，筆者團(tuán)隊(duì)全基因組鑒定、分析和驗(yàn)證了意蜂工蜂中腸的lncRNA和環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)[16，17]，并對中腸發(fā)育過程的lncRNA差異表達(dá)譜、circRNA差異表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了系統(tǒng)解析[18，19].

筆者團(tuán)隊(duì)前期已利用鏈特異性cDNA建庫的RNA-seq技術(shù)意蜂工蜂中腸進(jìn)行深度測序，本研究擬基于已獲得的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選意蜂工蜂中腸的高表達(dá)lncRNA(highly expressed lncRNA, HlncRNA)，通過分子生物學(xué)手段驗(yàn)證HlncRNA的真實(shí)表達(dá)并檢測其在工蜂中腸發(fā)育過程的表達(dá)譜，進(jìn)而利用生物信息學(xué)方法分析和探討HlncRNA的順式作用、反式作用和ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期深入揭示HlncRNA在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的潛在作用，并為探明背后的分子機(jī)理提供理論依據(jù)和基礎(chǔ).

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源 之前筆者所在團(tuán)隊(duì)已利用鏈特異性cDNA建庫的RNA-seq技術(shù)對意蜂7日齡(Am7)和10日齡(Am10)工蜂中腸進(jìn)行測序，得到的平均raw reads數(shù)分別為134 802 058和147 051 470 條，經(jīng)嚴(yán)格過濾得到的平均clean reads數(shù)分別為134 166 157和146 293 288條，平均Q20和Q30分別達(dá)到97.34%和93.86%[18]，質(zhì)控結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可滿足本研究的需要.

2.1.2 意蜂工蜂 取自本院教學(xué)蜂場.

2.2 方 法

2.2.1 HlncRNA篩選 參照Chen等[2]的報道，利用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)法對每一條lncRNA的表達(dá)量進(jìn)行歸一化. 將Am7組和Am10組包含的所有l(wèi)ncRNA按照FPKM值從高往低排序，表達(dá)量最高的前9條lncRNA相同，均為XR_001706220.1、XR_001702285.1、XR_001703498.1、XR_411315.2、TCONS_00004791、TCONS_00004790、TCONS_00034036、TCONS_00007249和TCONS_00006094. 因此，本研究選擇上述9條HlncRNA進(jìn)行驗(yàn)證、檢測和分析.

2.2.2 意蜂工蜂的人工飼養(yǎng)及中腸樣品的制備 按照筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期已建立的技術(shù)流程[16]進(jìn)行意蜂工蜂的人工飼養(yǎng)及中腸樣品制備：從群勢較強(qiáng)的蜂群中提出封蓋子脾，置于34±0.5 ℃的培養(yǎng)箱中待工蜂出房，將剛出房的工蜂記為1日齡，然后在34±0.5 ℃的條件下連續(xù)飼養(yǎng)至21日齡，每日檢查工蜂的存活狀態(tài)，并及時清理死亡蜜蜂. 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù). 每日隨機(jī)選取3只工蜂拉取中腸，放入RNA-free的離心管，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存.

2.2.3 意蜂工蜂中腸中HlncRNA的RT-PCR驗(yàn)證 根據(jù)上述9條HlncRNA的核酸序列，采用DNAMAN軟件(Lynnon Biosoft公司，美國)設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，委托上海生工生物有限公司合成. 利用AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit(TaKaRa公司，日本)分別提取上述21個日齡中工蜂中腸樣品的總RNA，作為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，再作為模板進(jìn)行PCR. PCR反應(yīng)體系包含：cDNA模板1 μL，上游及下游引物各1 μL，PCR mix 10 μL，無菌水7 μL. PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 34 個循環(huán)；72 ℃再延伸 10 min. PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用凝膠成像儀(上海培清，中國)觀察和拍照.

2.2.4 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中HlncRNA表達(dá)譜的qPCR檢測 利用1.3中制備的cDNA作為模板進(jìn)行qPCR. qPCR反應(yīng)按照SYBR Green Dye試劑盒(Vazyme公司，中國)的操作說明書進(jìn)行. RT-qPCR反應(yīng)在QuantStudio 3(ABI公司，美國)上進(jìn)行. 反應(yīng)體系(20 μL)包括：SYBR Green Dye 10 μL，濃度為1 μmol/L的上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，無菌水7 μL. 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 1 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃延伸 30 s，共40個循環(huán). 每個反應(yīng)進(jìn)行3次平行重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù). 以actin基因作為內(nèi)參. 以意蜂1日齡工蜂中腸作為對照組，采用2-ΔΔCt法[20]計(jì)算上述9條HlncRNA在2～21日齡工蜂中腸中的相對表達(dá)量.

2.2.5 HlncRNA的順式作用和反式作用分析 參照熊翠玲等的方法[16]，將HlncRNA上下游10 kb內(nèi)的蛋白編碼基因預(yù)測為HlncRNA順式調(diào)控的靶基因. 通過計(jì)算lncRNA與mRNA的共表達(dá)關(guān)系，選擇其中Pearson相關(guān)系數(shù)大于0.95的mRNA作為HlncRNA反式調(diào)控的靶mRNA. 然后利用Omicshare平臺(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)對高表達(dá)lncRNA的上下游基因以及反式作用的靶mRNA進(jìn)行GO(Gene Ontology)分類和KEGG通路富集分析.

2.2.6 HlncRNA的靶向預(yù)測及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 參照郭睿等[19]的方法，聯(lián)用Miranda、RNAhybrid和TargetScan三個軟件預(yù)測lncRNA的靶miRNA以及miRNA的靶mRNA. 依據(jù)靶向關(guān)系構(gòu)建HlncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò). 通過Cytoscape軟件對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化. 再利用基迪奧云平臺的相關(guān)軟件對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶mRNA進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org/)和KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)注釋，均采用默認(rèn)參數(shù).

3 結(jié)果與分析

3.1 HlncRNA的篩選及表達(dá)驗(yàn)證

Am7組和Am10組中表達(dá)量最高的前9條lncRNA相同，均為XR_001706220.1、XR_001702285.1、XR_001703498.1、XR_411315.2、TCONS_00004791、TCONS_00004790、TCONS_00034036、TCONS_00007249、TCONS_00006094 利用RT-PCR對上述9條HlncRNA進(jìn)行驗(yàn)證，電泳結(jié)果顯示它們在意蜂1～21日齡工蜂中腸中均真實(shí)表達(dá)；其中XR_001706220.1的驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示.

表1 9條高表達(dá)lncRNA在Am7組和Am10組中的FPKM值Tab.1 FPKM values of nine HlncRNAs in Am7 group and Am10 group

3.2 HlncRNA在意蜂工蜂發(fā)育過程中的表達(dá)譜檢測

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，上述9條HlncRNA在意蜂工蜂中腸發(fā)育1～21日齡總體上均表現(xiàn)出不同的表達(dá)規(guī)律；XR_411315.2的表達(dá)量在5日齡時最高，TCONS_00006094的表達(dá)量在9日齡時最高，其余7條HlncRNA的表達(dá)水平均在6日齡時達(dá)到峰值；XR_001706220.1的表達(dá)量在2～4日齡持續(xù)上調(diào)，其余8條HlncRNA在2～4日齡均表現(xiàn)為先下調(diào)再上調(diào)；XR_001703498.1、TCONS_00004791、TCONS_00004790和TCONS_00007249的表達(dá)量在15日齡前不斷變化，但在17～21日齡表達(dá)量趨于穩(wěn)定.

圖2 9條高表達(dá)lncRNA在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的表達(dá)譜Fig.2 Expression profile of nine HlncRNAs during the developmental process of the A. m. ligustica worker’s midgut

3.3 意蜂工蜂中腸HlncRNA的順式作用和反式作用分析

順式作用分析結(jié)果顯示， 9條HlncRNA潛在調(diào)控32個上下游基因. 反式作用分析結(jié)果顯示，9條HlncRNA與共表達(dá)的18條mRNA具有正(或負(fù))相關(guān)關(guān)系. 對HlncRNA順式和反式調(diào)控的上下游基因和mRNA進(jìn)行GO分類，結(jié)果顯示這些靶標(biāo)涉及單一組織進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程和定位等9個生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，細(xì)胞膜、細(xì)胞膜組分和細(xì)胞等7個細(xì)胞組分相關(guān)條目及結(jié)合和催化活性等4個分子功能相關(guān)條目(圖3a). KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，上述靶標(biāo)可富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、膽汁分泌及糖類消化與吸收等18條通路(圖3b).

圖3 9條高表達(dá)lncRNA順式和反式調(diào)控靶標(biāo)的GO分類(a)和KEGG通路富集分析(b)Fig.3 GO classification (a) and KEGG pathway enrichment analysis (b) of cis- and trans-regulating targets of nine HlncRNAs

3.4 意蜂工蜂中腸HlncRNA的靶向預(yù)測及調(diào)控網(wǎng)路分析

靶向預(yù)測結(jié)果顯示，9條HlncRNA共靶向55個miRNA，進(jìn)而結(jié)合131條mRNA. 靶向miRNA數(shù)量最多的HlncRNA是TCONS_00006094和XR_001703498.1，分別靶向33和6個miRNA. 結(jié)合mRNA數(shù)量最多的miRNA是ame-miR-3477和mir-283-x，分別結(jié)合16和11條mRNA(圖4). 進(jìn)一步的數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶mRNA可注釋到細(xì)胞進(jìn)程、代謝進(jìn)程、結(jié)合、催化活性和應(yīng)激反應(yīng)等30個功能條目，以及內(nèi)吞作用、細(xì)胞周期、Wnt信號通路、Hippo信號通路、和Notch信號通路等70條通路.

圖4 意蜂工蜂中腸的9條高表達(dá)lncRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.4 CeRNA network of nine HlncRNAs in the midgut of A. m. ligustica worker

4 討 論

昆蟲中腸不僅是消化吸收的主要場所，也是重要的免疫器官[14]. LncRNA能在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮靈活多樣的調(diào)控功能[1,3]. 有研究表明表達(dá)量較高的lncRNA在癌癥發(fā)生、免疫應(yīng)答等方面具有重要的調(diào)控功能. 例如，Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CCND2-AS1在惡性膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)量較高，可通過增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤中的Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖；Valanne等[22]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)果蠅感染革蘭氏陽性細(xì)菌M.luteus后，lincRNA-IBIN維持高表達(dá)且可通過影響Toll通路進(jìn)而參與宿主免疫應(yīng)答. 基于筆者團(tuán)隊(duì)已獲得的高質(zhì)量lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)9條HlncRNA在意蜂7和10日齡工蜂中腸中均為高表達(dá)(FPKM值分別介于75.62～7353.5和93.47～2904.95)，暗示這些HlncRNA在中腸發(fā)育過程的潛在重要性. 本研究中，RT-PCR結(jié)果顯示上述9條HlncRNA在意蜂1～21日齡工蜂中腸中均真實(shí)表達(dá)；此外，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示它們在1～21日齡工蜂中腸中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)規(guī)律，XR_411315.2的表達(dá)量在5日齡時最高，TCONS_00006094的表達(dá)量在9日齡時最高，其余7條HlncRNA的表達(dá)水平均在6日齡時達(dá)到峰值；XR_001706220.1的表達(dá)量在2～4日齡持續(xù)上調(diào)，其余8條HlncRNA在2-4日齡均表現(xiàn)為先下調(diào)再上調(diào)；XR_001703498.1、TCONS_00004791、TCONS_00004790和TCONS_00007249的表達(dá)量在15日齡前不斷變化，但在17～21日齡表達(dá)量趨于穩(wěn)定. 意蜂工蜂中腸發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，期間伴隨著不同分子事件的次第發(fā)生，HlncRNA的表達(dá)譜檢測結(jié)果可為進(jìn)一步的功能研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

LncRNA的功能與其鄰近的蛋白編碼基因密切相關(guān)，可通過影響基因的啟動子或者其他順式作用元件發(fā)揮調(diào)控作用；此外，lncRNA也可以結(jié)合距離較遠(yuǎn)的基因上的增強(qiáng)子或啟動子，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)[1]. 筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)無論在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程還是在意蜂工蜂中腸響應(yīng)東方蜜蜂微孢子蟲侵染的過程中，差異表達(dá)lncRNA均可可以通過順式和反式作用發(fā)揮潛在的調(diào)控功能[2, 18]. 本研究發(fā)現(xiàn)，9條HlncRNA的上下游基因和共表達(dá)mRNA共有50個，可注釋到膽汁分泌、胰液分泌、唾液分泌和糖類消化與吸收等消化吸收相關(guān)條目，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、半胱氨酸和蛋氨酸代謝及淀粉和蔗糖代謝等物質(zhì)代謝相關(guān)通路. 以上結(jié)果表明相應(yīng)的HlncRNA在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程潛在調(diào)節(jié)消化吸收與物質(zhì)代謝. 自噬在真核生物中廣泛存在，當(dāng)生物體遭遇營養(yǎng)缺乏、病原入侵和細(xì)胞程序性死亡時都可以激活自噬進(jìn)而起到平衡體內(nèi)環(huán)境的功能[23].本研究中，HlncRNA順式和反式調(diào)控的靶標(biāo)可注釋到細(xì)胞自噬-動物、細(xì)胞自噬-其它真菌及細(xì)胞自噬-酵母，說明相應(yīng)的HlncRNA可能通過調(diào)節(jié)自噬機(jī)制進(jìn)而參與意蜂工蜂中腸的發(fā)育過程.

CeRNA機(jī)制認(rèn)為含相同或類似miRNA反應(yīng)元件(miRNA response elements, MREs)的不同類型RNA皆能通過競爭性結(jié)合miRNA調(diào)控基因表達(dá)[5]. Feng等[24]通過對抗丁氟螨酯與丁氟螨酯敏感品系的朱砂葉螨進(jìn)轉(zhuǎn)錄組測序和比較分析，篩選出與丁氟螨酯抗性相關(guān)的lincRNA_Tc13743.2，過表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明lincRNA_Tc13743.2可通過與谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶基因TcGSTm02競爭結(jié)合miR-133-5p介導(dǎo)朱砂葉螨對丁氟螨酯的抗性. 本研究中，9條HlncRNA可靶向59個miRNA進(jìn)而結(jié)合131條mRNA. 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TCONS_00006094、XR_001703498.1、TCONS_00004790、XR_001706220.1和TCONS_00004791靶向的miRNA較多，分別為33、6、5、3和3個，這些靶miRNA又能分別靶向75、14、12、16和4條mRNA；上述5條HlncRNA形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜；而TCONS_00034036僅靶向4個miRNA，XR_001702285.1可靶向2個miRNA，進(jìn)而結(jié)合1條mRNA；類似地，TCONS_00007249可靶向2個miRNA，進(jìn)而結(jié)合1條mRNA；XR_411315.2僅能靶向1個miRNA，但能進(jìn)一步結(jié)合16條mRNA. 根據(jù)ceRNA機(jī)制的原理，處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心且連接靶標(biāo)的數(shù)量越多(即聯(lián)通性越強(qiáng))的RNA分子的重要性越大，推測TCONS_00034036、XR_001702285.1、TCONS_00007249和XR_411315.2在意蜂工蜂中腸發(fā)育的過程中作用相對其他5條HlncRNA較弱. 通過功能注釋發(fā)現(xiàn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶mRNA可注釋到消化相關(guān)通路如初級膽汁酸生物合成，這表明HlncRNA不僅可通過順式和反式作用還可以通過ceRNA機(jī)制對中腸的消化吸收進(jìn)行調(diào)控；此外，還發(fā)現(xiàn)HlncRNA間接調(diào)控的靶mRNA可注釋到Hippo和Wnt信號通路. Hippo信號通路由一系列保守激酶組成，通過調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡從而控制器官大小[25]. Wnt信號通路已被證實(shí)在昆蟲生長、發(fā)育和代謝等方面扮演重要角色[26]. 目前，利用RNAi技術(shù)對昆蟲的lncRNA進(jìn)行敲減和功能研究已見諸報道[24,27]. 下一步我們將針對9條HlncRNA分別設(shè)計(jì)合成特異性siRNA，然后通過飼喂siRNA的方法對意蜂工蜂中腸的單條HlncRNA進(jìn)行敲減或多條HlncRNA同時進(jìn)行敲減，進(jìn)一步探究HlncRNA的功能.

綜上所述，本研究證實(shí)了9條HlncRNA的真實(shí)表達(dá)并檢測了它們在意蜂工蜂中腸中的表達(dá)譜，揭示了HlncRNA可通過其順式作用、反式作用和ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)消化吸收和物質(zhì)代謝，進(jìn)而參與中腸的發(fā)育過程.