李潔瓊，李小萬(wàn)

（新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 昌吉 831100）

昆蟲(chóng)產(chǎn)生大量的抗菌肽作為防御細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)的第一道防線［1，2］。在鞘翅目昆蟲(chóng)中，攻擊素（Attacin）、天蠶素（Cecropin）、防御素（Defensin）以及鞘翅殺菌肽（Coleoptericin）等共同構(gòu)成昆蟲(chóng)先天免疫防御體系［3］。Attacin家族廣泛分布于昆蟲(chóng)不同種類(lèi)，最初從天蠶中分離獲得［4］，在柞蠶［5］中Attacin可作為菌株鑒定的靶向蛋白，在橘小實(shí)蠅［6］成蟲(chóng)脂肪體中Attacin對(duì)細(xì)菌攻擊的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)已得到證實(shí)，蟲(chóng)草蝠蛾的高通量RNA-Seq分析顯示，Attacin與Cecropin，Gloverin和Defensin一起被鑒定為顯著表達(dá)的抗菌肽［7］。

Attacin是一類(lèi)富含甘氨酸的抗菌肽，按其等電點(diǎn)的不同劃分為兩大類(lèi)：堿性攻擊素（Attacin A，Attacin B、Attacin C、Attacin D）和酸性攻擊素（Attacin E、Attacin F），大小范圍為20～23 ku［4，8］。一般由5部分組成，包括信號(hào)肽、前肽、P域（富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域）、N-末端Attacin域以及2個(gè)富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域（G1域和G2域）［8］。Attacin溶解時(shí)呈無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)，由于水溶液中的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定且對(duì)蛋白酶敏感，Attacin的抗菌活性取決于其螺旋構(gòu)象［9，10］。大部分Attacin可抵御大腸桿菌和一些特定的 革 蘭 氏 陰 性 細(xì) 菌［4，8］，其 通 過(guò) 直 接 靶 向 細(xì) 菌 外膜［11］，或者通過(guò)與脂多糖結(jié)合而不穿過(guò)內(nèi)膜或細(xì)胞質(zhì)，阻止細(xì)菌外膜蛋白的合成，從而增加外膜的滲透性，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)［12］。

新疆荒漠昆蟲(chóng)小胸鱉甲（Microderapunctipennis）是古爾班通古特沙漠的一種鞘翅目擬步甲科特有種［13］。它以成蟲(chóng)過(guò)冬，在早春季節(jié)冰雪尚未完全融化時(shí)就可交配產(chǎn)卵，具有很高的耐寒性以適應(yīng)惡劣的沙漠環(huán)境［14］，其潛在的分子基礎(chǔ)仍然是未知的。在對(duì)小胸鱉甲經(jīng)過(guò)4℃處理3 h所建立的低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中［14］，一些免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄物上調(diào)表達(dá)，其中MpAtt1和MpAtt2基因（GenBank登錄號(hào)：KF825556和KF825557）顯著上調(diào)表達(dá)［15］。果蠅中也發(fā)現(xiàn)Attacin基因響應(yīng)低溫上調(diào)表達(dá)［16-18］。這些免疫基因的差異表達(dá)是在無(wú)病原體誘導(dǎo)的情況下由冷脅迫引起的，這表明低溫脅迫可能激活了昆蟲(chóng)體內(nèi)的免疫防御體系，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。MpAtt1的推導(dǎo)氨基酸序列與MpAtt2有28.14%的同一性［15］，本研究利用生物信息學(xué)方法，從理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、信號(hào)肽、跨膜區(qū)域、亞細(xì)胞定位、三級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域等多個(gè)方面對(duì)Mpattacin進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，并與其他同源Attacin蛋白比對(duì)分析，為進(jìn)一步研究小胸鱉甲Mpattacin基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MpAtt1和MpAtt2核酸序列來(lái)自NCBI的Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)DNAman軟件翻譯成氨基酸序列進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

1.2 Mpattacin基因生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)相關(guān)分析利用在線分析軟件完成（表1）。

表1 生物信息學(xué)在線分析軟件

2 結(jié)果與分析

2.1 Mpattacin基因理化性質(zhì)分析

通過(guò)ExPASy-ProtParam預(yù)測(cè)Mpattacin基因編碼的氨基酸的理化性質(zhì)（表2），MpAtt1編碼151個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為16.611 65 ku。MpAtt2編碼166個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為18.162 06 ku。由預(yù)測(cè)結(jié)果可看出，Mpattacin為穩(wěn)定的堿性蛋白。

表2 Mpattacin的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

2.2 Mpattacin疏水性/親水性及信號(hào)肽分析

利用ProtScale分析蛋白質(zhì)的親水性/疏水性，負(fù)值越小表示親水性越強(qiáng)，正值越大表示疏水性越強(qiáng)，介于-0.5～0.5的為兩性氨基酸。從疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果（圖1a）可以看出，MpAtt1序列前有疏水性的信號(hào)肽序列，其余部分為親水性序列，與ProtParam分析結(jié)果一致（表2）。經(jīng)SignalP 4.1分析顯示（圖1b），預(yù)測(cè)的剪切位點(diǎn)位于17～18位氨基酸，表明MpAtt1蛋白的1～17位氨基酸可能為該蛋白的信號(hào)肽，屬于分泌蛋白。MpAtt2序列也存在信號(hào)肽序列（圖1c），信號(hào)肽的位置是1～17位氨基酸（圖1d），其余部分為親水性序列，與ProtParam分析結(jié)果一致（表2）。這2個(gè)Mpattacin抗菌蛋白多肽鏈親水氨基酸分布比較均勻，且數(shù)量大于疏水性氨基酸，蛋白表現(xiàn)出親水性，因此可推斷這2個(gè)蛋白屬于可溶性蛋白。

圖1 Mpattacin蛋白信號(hào)肽、親疏水性預(yù)測(cè)

2.3 Mpattacin跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用TMpred分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)（圖2），通常認(rèn)為Score值大于500是可信的，MpAtt1序列第1～21位和MpAtt2序列第5～21位存在強(qiáng)烈信號(hào)，可能存在跨膜結(jié)構(gòu)域，與信號(hào)肽分析和疏水性分析結(jié)果一致，且在蛋白序列的其他區(qū)域不存在高評(píng)分區(qū)域，表明上述2個(gè)蛋白質(zhì)不存在跨膜區(qū)。

2.4 Mpattacin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Porter分析結(jié)果顯示（圖3a），MpAtt1蛋白含有9個(gè)α-螺旋，80個(gè)延伸鏈和62個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲；SOPMA分析結(jié)果顯示，MpAtt1蛋白含有20個(gè)α-螺旋，46個(gè)延伸鏈和85個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲。MpAtt2蛋白（圖2b）經(jīng)Porter分析含有16個(gè)α-螺旋，81個(gè)延伸鏈和69個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲；SOPMA分析結(jié)果顯示，MpAtt2蛋白含有17個(gè)α-螺旋，52個(gè)延伸鏈和97個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲。這2個(gè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈（β-折疊）3種結(jié)構(gòu)元件組成，其中，無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈（β-折疊）所占比例較高，α-螺旋主要存在于信號(hào)肽處。

圖2 Mpattacin蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖3 Mpattacin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 Mpattacin蛋白亞細(xì)胞定位

同時(shí)利用YLoc、Tagert P、Cell-PLoc和ProtComp 9.0預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位（表3），結(jié)果顯示，MpAtt1和MpAtt2蛋白存在于細(xì)胞外的可能性較大，為細(xì)胞外的分泌蛋白。

表3 亞細(xì)胞定位分析

2.6 Mpattacin蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與基序、結(jié)構(gòu)域分析

1）Mpattacin蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)Swiss-Model和CPHmodels3.2預(yù)測(cè)Mpattacin三級(jí)結(jié)構(gòu)，并采用Swiss-Pdbviewer進(jìn)行模型展示。結(jié)果表明，MpAtt1（圖4a）和MpAtt2（圖4b）蛋白主要由延伸鏈（β-折疊）和無(wú)規(guī)則卷曲這2種元件構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)。

圖4 Mpattacin三級(jí)結(jié)構(gòu)模型

2）Mpattacin蛋白保守結(jié)構(gòu)域。利用SMART分析Mpattacin蛋白保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)果表明，MpAtt1氨基酸序列38～151位點(diǎn)為Pfam domain—Attacin_C（ID：PF03769），E值為3.4×10-12，且32～145位點(diǎn)為Gloverin domain（ID：PF10793），E值為2.3×10-3；同時(shí)，MpAtt2蛋白同樣含有Attacin_C功能域（43～166位點(diǎn)）以及葛佬素功能域（38～165位點(diǎn)）。利用NCBI的Conserved domain database數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，MpAtt1和MpAtt2氨基酸序列46～147位點(diǎn)和51～166位點(diǎn)為Attacin、C-terminal region（ID：cl04253/pfam 03769），E值分別為5.97×10-08和3.79×10-29，這表明Mpattacin蛋白具有典型的昆蟲(chóng)抗菌肽Attacin_C保守結(jié)構(gòu)域，隸屬于Attacin_C超家族，同時(shí)又具有抗菌蛋白葛佬素Gloverin保守結(jié)構(gòu)域。

3）Mpattacin蛋白基序分析。利用PROSITE分析Mpattacin的MOTIF，結(jié)果如表4所示，MpAtt1和MpAtt2的蛋白質(zhì)均具有相似的MOTIF：蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)和N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)。

表4 Mpattacin的基序預(yù)測(cè)分析

4）Mpattacin蛋白糖基化和磷酸化位點(diǎn)。利用在線工具NetOGlyc4.0 Server預(yù)測(cè)Mpattacin潛在糖基化位點(diǎn)，MpAtt2在氨基酸41（0.528）和42（0.543）處可能存在O-糖基化位點(diǎn)，MpAtt1不存在糖基化位點(diǎn)的概率較高。利用NetPhos 3.1 Server分析Mpattacin潛在磷酸化位點(diǎn)，磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)閾值選擇分值大于0.5，MpAtt1（圖5a）和MpAtt2（圖5b）序列可能存在較多的磷酸化修飾，特別是C端，且分別位于絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3種氨基酸上，其中，絲氨酸（Ser）上潛在的磷酸化位點(diǎn)數(shù)最多，這與功能域和MOTIF預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖5 Mpattacin磷酸化位點(diǎn)分析

2.7 Mpattacin多序列比對(duì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載已經(jīng)報(bào)道的部分物種Attacin蛋白序列，同源性分析表明，與鞘翅目光滑鱉甲抗菌肽Attacin1（登錄號(hào)：APX53001.1）一致性最高，為84.77%（表5）。

表5 與Mpattacin比對(duì)的其他同源Attacin蛋白的序列信息

3 討論

小胸鱉甲MpAtt1和MpAtt2在氨基酸水平與鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)的Attacins具有35.05%～84.77%的一致性，可知鞘翅目昆蟲(chóng)的Attacin與來(lái)自其他2個(gè)目的昆蟲(chóng)Attacin序列之間具有較大差別。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析也表明，鞘翅目昆蟲(chóng)小胸鱉甲的Mpattacin和赤擬谷盜的Attacin，與鱗翅目和雙翅目的Attacin相比分枝較早［15］，與這些昆蟲(chóng)之間的分類(lèi)進(jìn)化關(guān)系一致。Attacin溶解時(shí)呈無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)［9］，由于缺乏半胱氨酸所形成的二硫鍵，其構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)是松散和不穩(wěn)定的，這種對(duì)結(jié)構(gòu)無(wú)嚴(yán)格的限制可能會(huì)導(dǎo)致氨基酸替換的增加，這可能是導(dǎo)致遠(yuǎn)源物種的Attacin氨基酸序列相似性低的原因之一。

Mpattacin的氨基酸序列與其他昆蟲(chóng)Attacin不同，富含脯氨酸的P域幾乎丟失；N末端結(jié)構(gòu)域大大縮短；G1結(jié)構(gòu)域比其他Attacin的短；其中MpAtt1的堿性氨基酸蛋白酶（furin-like enzyme）RXXR酶切位點(diǎn)變化非常大［15］，因此難以通過(guò)序列的同源性分析Mpattacin蛋白的生物活性。而影響抗菌肽生物學(xué)特性的因素有很多，其中，肽鏈長(zhǎng)度、電荷數(shù)與分布、氨基酸空間結(jié)構(gòu)及組成、疏水性及親水性特點(diǎn)等是主要的自身決定因素［19］。MpAtt1和MpAtt2的等電點(diǎn)（pI）分別為9.57和8.71，屬于基礎(chǔ)Attacin類(lèi)［4］。大多數(shù)昆蟲(chóng)抗菌肽AMP是帶有陽(yáng)離子的蛋白質(zhì)，具有抗細(xì)菌活性的堿性殘基，因此可以通過(guò)電荷間相互作用促進(jìn)AMP與帶負(fù)電荷的微生物表面的結(jié)合［10，20］?？咕耐ǔ＠砘再|(zhì)穩(wěn)定，具有較好的耐熱性和耐酸堿性［21］。借助相關(guān)生物信息學(xué)在線軟件分析表明，Mpattacin也具有上述特性，這也意味著這些特性是Mpattacin具有活性的基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)中氨基酸的疏水性和親水性的分布情況決定了該蛋白質(zhì)如何折疊。分析預(yù)測(cè)Mpattacin蛋白質(zhì)具有高疏水值的信號(hào)肽序列區(qū)域，并出現(xiàn)在潛在的跨膜區(qū)，其余部分為親水性序列，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，表明Mpattacin在折疊的過(guò)程中形成了親水的表面以及疏水的內(nèi)核，是親水性蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果也顯示，MpAtt1和MpAtt2蛋白為細(xì)胞外的分泌蛋白，表明該蛋白符合昆蟲(chóng)抗菌肽Attacin的特性［4，8］。有報(bào)道表明，抗菌肽在插入到菌體細(xì)胞膜的過(guò)程中，其疏水特性起了關(guān)鍵作用［22］，即改善疏水性可提高抗菌肽的抗菌活性。盡管Mpattacin在總體上是親水性的，但在其序列中也包含一些疏水性的殘基位點(diǎn)，這也可以提高M(jìn)pattacin的抗菌活性。

蛋白質(zhì)主要的生化特征及功能是由多肽鏈進(jìn)一步螺旋、折疊和卷曲而形成的高級(jí)空間結(jié)構(gòu)來(lái)決定的。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Mpattacin蛋白存在較多的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)。β-折疊位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，能夠牢固地維持該蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)。無(wú)規(guī)則卷曲則常展示在蛋白質(zhì)表面，有利于抗原抗體的相互作用［23］。有研究表明，抗菌肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)有助于透過(guò)和破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜［24］。通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域的分析可知，MpAtt1和MpAtt2都具有Attacin_C結(jié)構(gòu)域和Gloverin域，這2個(gè)結(jié)構(gòu)序列均與抗菌活性有關(guān)［3］。且Mpattacin存在較多的磷酸化潛在位點(diǎn)，特別是在C端，從而有利于該蛋白質(zhì)與昆蟲(chóng)體內(nèi)其他分子或蛋白相互作用而調(diào)控細(xì)胞的應(yīng)答功能。一般來(lái)說(shuō)多肽鏈中的氨基酸潛在的磷酸化位點(diǎn)越多，發(fā)揮更多功能的可能性就越大。已經(jīng)從許多昆蟲(chóng)中鑒定出具有抗微生物活性的Attacin［4，11，25，26］，此外果蠅的研究表明，反復(fù)冷暴露后抗菌肽Attacin（AttacinA、AttacinB和AttacinC）上調(diào)表達(dá)［16］；冷馴化的果蠅中也發(fā)現(xiàn)編碼抗微生物肽的Dro、Dipt、AttA和AttC上調(diào)［17］；低溫下果蠅中編碼抗菌肽的AttA、AttB、DptA、DptB、CecA1和CecA2轉(zhuǎn)錄上調(diào)以響應(yīng)過(guò)冷卻現(xiàn)象，AttD下調(diào)以響應(yīng)體液結(jié)冰［18］。起初是在分析小胸鱉甲低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)表達(dá)Mpattacin基因，并在4℃和-4℃低溫下檢測(cè)MpAtt1和MpAtt2的表達(dá)譜，在一段時(shí)間長(zhǎng)度（0～11 h）內(nèi)得到證實(shí)［15］。本研究通過(guò)多個(gè)方面預(yù)測(cè)結(jié)果相互驗(yàn)證，分析得出Mpattacin蛋白可能具有較好的抗菌活性，參與到昆蟲(chóng)的體液防御系統(tǒng)。在低溫下免疫通路的激活及其調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)，一定程度上增強(qiáng)了昆蟲(chóng)脅迫耐受性和免疫防御能力［18］。對(duì)于越冬期的小胸鱉甲來(lái)說(shuō)，在沒(méi)有病原體脅迫的情況下，Attacin基因的表達(dá)對(duì)寒冷產(chǎn)生響應(yīng)，表明低溫誘導(dǎo)表達(dá)Attacin蛋白可能是昆蟲(chóng)進(jìn)化出的一種低溫保護(hù)機(jī)制［27］。本研究對(duì)Mpattacin基因生物信息學(xué)分析有助于進(jìn)一步開(kāi)展克隆表達(dá)及功能分析方面提供理論參考。