萬(wàn)麗麗，王轉(zhuǎn)茸，湯 謐，張學(xué)軍，曾紅霞，任 儉，張 娜，孫玉宏，熊建順，朱志坤

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢 430065；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南三亞農(nóng)作物育種試驗(yàn)中心，海南 三亞 572014；4.武漢市蔡甸區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，武漢 430199）

蔬菜作物富含纖維、維生素、微量元素、抗氧化劑及礦物質(zhì)等重要營(yíng)養(yǎng)，是人類合理膳食中不可或缺的重要來(lái)源。然而氣候環(huán)境的變化帶來(lái)的病蟲害、缺素以及干旱、鹽堿、漬害等對(duì)蔬菜生產(chǎn)及供應(yīng)造成潛在的風(fēng)險(xiǎn)［1，2］，迫切需要育種者從高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)以及生物和非生物脅迫抗性等方面選育新品種以適應(yīng)生產(chǎn)及市場(chǎng)需求。農(nóng)作物品種的選育經(jīng)歷了馴化育種和雜交育種等常規(guī)育種階段并選育得到具有適應(yīng)性的優(yōu)良品種。隨著長(zhǎng)期的人工選擇，常規(guī)育種的缺點(diǎn)不斷凸顯，主要表現(xiàn)在過(guò)于依賴自然等位基因的變異使得可利用的遺傳種質(zhì)資源狹窄；改良目標(biāo)性狀的同時(shí)由于連鎖累贅效應(yīng)帶來(lái)眾多不利性狀，嚴(yán)重降低育種效率［3］。新興農(nóng)作物生物技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用為高效率精準(zhǔn)的品種選育提供了技術(shù)支撐。序列特異性核酸酶（SSNs）如鋅指核酸酶（ZFNs），轉(zhuǎn)錄激活類效應(yīng)核酸酶（TALENs）和CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)能夠在特定DNA位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）。在真核生物中，DSBs的修復(fù)機(jī)制主要有2種：①非同源末端連接（Non homologous end joining，NHEJ），在沒有同源修復(fù)模板時(shí)，NHEJ修復(fù)能夠使斷裂染色體發(fā)生不準(zhǔn)確的連接，斷裂的位置一般會(huì)通過(guò)修復(fù)而出現(xiàn)少量堿基的缺失或插入，實(shí)現(xiàn)基因敲除；②同源重組修復(fù)（Homology directed repair，HDR），在存在同源序列情況下，HDR能夠以其為修復(fù)模板，使同源序列能夠精確定點(diǎn)地替換或者插入相應(yīng)的剪切位點(diǎn)［4］。雖然ZFNs和TALEN技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用并獲得了農(nóng)作物基因編輯的產(chǎn)品，但是構(gòu)建過(guò)程繁瑣且花費(fèi)昂貴，限制了技術(shù)的廣泛應(yīng)用［5，6］。CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的，以其操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確高效的優(yōu)勢(shì)成功地應(yīng)用到農(nóng)作物的遺傳改良中。

根據(jù)Cas編碼基因的核心序列差異，CRISPRCas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3種不同類型，其中Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體才具有完整的剪切活性［7］。Ⅱ型系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單，除crRNA和tracrRNA以外，僅需要一個(gè)Cas9蛋白就可以完成對(duì)特定外源DNA的切割，Cas9蛋白由RuvC結(jié)構(gòu)域和HNH核酸結(jié)構(gòu)域組成，分別對(duì)目標(biāo)外源DNA雙鏈中的一條行使切割功能［8］。目前常用的CRISPR-Cas9系統(tǒng)就是在Ⅱ型的基礎(chǔ)上改造獲得，該系統(tǒng)具有一條引導(dǎo)作用的sgRNA（single-guide RNA）和一個(gè)Cas9蛋白。其中sgRNA由一段與靶基因同源配對(duì)的20 bp RNA片段（crRNA）和一段60 bp的RNA片段（tracrRNA）組成。CRISPR array轉(zhuǎn)錄成為前體RNA轉(zhuǎn)錄本（precursor RNA transcript，pre-crRNA）。一個(gè)非編碼的反式激活CRISPR RNA（crRNA）與前體RNA轉(zhuǎn)錄本雜交，與Cas9蛋白相結(jié)合，加工得到成熟的crRNAs。實(shí)際操作是將sgRNA序列和Cas9編碼基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞，在sgRNA引導(dǎo)下，Cas9蛋白靶向切割目標(biāo)雙鏈DNA，形成DSBs，繼而根據(jù)DNA修復(fù)的方式得到基因失活或者基因獲得的突變表型。

1 CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)

1.1 常用的CRISPR-Cas類型

來(lái)自化膿鏈球菌的SpCas9是常用的Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的關(guān)鍵核酸酶，在sgRNAs作用下識(shí)別PAM序列，結(jié)合靶位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，切割雙鏈DNA，在PAM上游3 bp處產(chǎn)生雙鏈斷裂［9］。為了拓展Sp-Cas9識(shí)別不同PAM序列，開發(fā)出SpCas9變體如識(shí)別5′-NG、5′-GAA和5′-GAT［10］，金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Cas9）SaCas9識(shí) 別5′-NNGRRT［11］，嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus，Cas9）StCas9識(shí)別5′-NNAGAAW［12］，腦膜炎雙球菌（Neisseria meningitidis，Cas9）NmCas9識(shí) 別 5′-NNNNGATT［13］，空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，Cas9）CjCas9識(shí)別5′-NNNVRYM［14］，CasX或Cas12e識(shí) 別5′-TTCN［15］。type VI CRISPR-Cas系 統(tǒng) 中Cas13（C2c2）蛋白介導(dǎo)高效干擾靶向RNA病毒應(yīng)用到植物抗病毒研究中［16］。

1.2 單堿基編輯系統(tǒng)

單核苷酸突變是農(nóng)作物中許多重要農(nóng)藝性狀發(fā)生變異的遺傳基礎(chǔ)，單堿基的變異會(huì)導(dǎo)致氨基酸替換或者蛋白質(zhì)翻譯終止，使得基因功能發(fā)生改變，從而獲得優(yōu)良的等位基因與優(yōu)異性狀。CRISPR技術(shù)衍生的單堿基編輯工具能夠高效實(shí)現(xiàn)基因組中靶序列編輯活性窗口內(nèi)C＞T或A＞G的轉(zhuǎn)變。單堿基編輯系統(tǒng)能夠在不產(chǎn)生雙鏈斷裂的前提下，將nCas9和胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）、尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構(gòu)成的胞嘧啶單堿基編輯器（CBEs）、nCas9切口酶和腺嘌呤脫氨酶融合的堿基編輯器（ABEs）以及雙堿基編輯器（Dual base editing technology），由起導(dǎo)航作用的gRNA引導(dǎo)至靶位點(diǎn)發(fā)揮堿基替換作用，分別能夠?qū)δ繕?biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)高效胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）到鳥嘌呤（G）以及實(shí)現(xiàn)C-G到T-A和A-T到G-C的同時(shí)突變［17，18］。

1.3 引導(dǎo)編輯（Prime editing，PE）

引導(dǎo)編輯系統(tǒng)是由向?qū)NA（prime editing guide RNA，pegRNA）Cas9核酸切口酶（Cas9 nickase，H840A）和逆轉(zhuǎn)錄酶組成。原理是Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA指引下，切割DNA單鏈，形成3′末端（3′flaps）和5′末端（5′flaps）兩段序列，而5′末端會(huì)被具有5′核酸外切酶活性FEN1和具有5′核酸外切酶活性的EXO1蛋白切割。而3′末端通過(guò)反轉(zhuǎn)錄pegRNA 3′-端的PBS（引物結(jié)合序列Primer binding site，PBS）可以與切割斷點(diǎn)前的互補(bǔ)序列識(shí)別配對(duì)，逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）以pegRNA上PBS序列后的人工設(shè)計(jì)序列為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將目標(biāo)序列直接聚合到切口的DNA鏈上［19］（圖1）。目前PE系統(tǒng)在植物里處于起步階段，能夠在不引入雙鏈斷裂DSB和供體DNA模板的前提下實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)位點(diǎn)的插入、缺失和所有12種類型點(diǎn)突變［20］。為了提高PE系統(tǒng)的適用性，研發(fā)人員認(rèn)為可以優(yōu)化pegRNA參數(shù)包括PBS和RT模板的長(zhǎng)度，以促進(jìn)非編輯鏈切口形成；優(yōu)化植物載體的元件如啟動(dòng)子、核定位信號(hào)等以利于PE系統(tǒng)的高效轉(zhuǎn)化利用；將現(xiàn)在常用的雙啟動(dòng)子系統(tǒng)簡(jiǎn)化為緊湊的單轉(zhuǎn)錄單元（Single transcript unit，STU），利用一個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)用于精確編輯的多基因如nCas-M-MLV-RT融合蛋白、pegRNA和切割非編輯鏈的sgRNA表達(dá)框；利用直接轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的核糖核蛋白復(fù)合體（Ribonucleoprotein complex，RNP）提高PE高效基因編輯；利用多樣化的Cas切口酶（SpCas9-NG、ScCas9、SaCas9等）擴(kuò)展PAM區(qū)類型，增加PE在植物中應(yīng)用的可塑性［21，22］。

圖1 Prime editing引導(dǎo)編輯系統(tǒng)構(gòu)成與作用機(jī)理

2 CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)在植物中的遞送

CRISPR基因編輯技術(shù)在植物應(yīng)用中面臨的技術(shù)瓶頸是如何順利地將編輯元件導(dǎo)入植物細(xì)胞中。常用的遞送方法有利用基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織培養(yǎng)、PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化［23］。目前最常用的方法是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式將CRISPR-Cas等序列特異性核酸酶和選擇標(biāo)記表達(dá)框?qū)胧荏w植物細(xì)胞，在選擇性培養(yǎng)基中再生獲得穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因植株。然而以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的遞送方法會(huì)因?yàn)橹参锓N類或者基因型的愈傷組織誘導(dǎo)和再生效率極低，限制了此技術(shù)的應(yīng)用。因此發(fā)展無(wú)需轉(zhuǎn)化的CRISPR-Cas高效遞送方法，建立DNA-free植物基因編輯技術(shù)，有助于加速作物育種進(jìn)程、降低監(jiān)管成本、推動(dòng)基因編輯作物的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。利用CRISPRCas9核糖核蛋白復(fù)合物（RNPs）轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體獲得DNA-free的研究已在擬南芥、煙草、生菜、水稻、玉米和小麥等作物上成功實(shí)現(xiàn)［24-26］，但是PEG轉(zhuǎn)化細(xì)胞后再生過(guò)程長(zhǎng)且獲得完整植株難度大。基因槍法雖然能夠?qū)-DNA轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，但是轉(zhuǎn)化效率低，容易產(chǎn)生染色體斷裂繼而導(dǎo)致DNA重組的發(fā)生［27］。T-DNA表達(dá)載體也可以通過(guò)PEG介導(dǎo)或者電轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，但是轉(zhuǎn)化效率和再生效率非常低，限制了該技術(shù)的應(yīng)用。病毒載體系統(tǒng)是外源基因體內(nèi)遞送和瞬時(shí)表達(dá)的理想工具，是轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)的重要補(bǔ)充。在植物領(lǐng)域應(yīng)用中，盡管植物病毒表達(dá)系統(tǒng)廣受關(guān)注，但是CRISPR-Cas核酸酶包括轉(zhuǎn)錄順式元件達(dá)5～6 kb時(shí)，遠(yuǎn)超出已知大多數(shù)植物病毒載體1～2 kb的包容極限。因此，大多數(shù)研究者只能在Cas9超表達(dá)的植株中利用各種病毒如煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）［28，29］、煙 草 花 葉 病 毒（Tobacco mosaic virus，TMV）［30］、豌豆早褐病毒（Pea early-browning virus，PEBV）［28］、大麥條紋花葉病毒（Barely stripe mosaic virus，BSMV）［31］、狐尾草花葉病毒（Foxtail mosaic virus，F(xiàn)oMV）［32］、甜菜叢根病毒（Beet necrotic yellow vein virus，BNYVV）［33］和單鏈DNA白菜卷葉病毒（Cabbage leaf curl virus，CLCV）［34］介導(dǎo)sgRNAs的傳遞并獲得基因編輯的組織或植株。由于大多數(shù)植物不同基因型的轉(zhuǎn)化再生效率存在差異，因此一種不通過(guò)組織培養(yǎng)的新型gRNA和Cas9傳遞系統(tǒng)對(duì)農(nóng)作物基因編輯育種至關(guān)重要。2020年浙江大學(xué)李正和團(tuán)隊(duì)表達(dá)出一種工程化的植物負(fù)鏈RNA（NSR）病毒，將CRISPR-Cas9表達(dá)框插入植物細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒大麥黃條紋花葉病毒（Barely yellow striate mosaic virus，BYSMV）和苦苣菜黃網(wǎng)彈狀病毒（Sonchus yellow net rhabdovirus，SYNV）載體，并在gRNA序列兩側(cè)連接tRNAGly前體序列，在細(xì)胞內(nèi)源tRNA加工機(jī)制下對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄的gRNA末端進(jìn)行精確剪切；當(dāng)重組病毒接種本氏煙時(shí)能有效形成系統(tǒng)侵染并表達(dá)Cas9/gRNA分子，產(chǎn)生可高達(dá)90%的靶向編輯。由于該重組載體可以通過(guò)汁液摩擦傳代，維持了CRISPR-Cas9穩(wěn)定表達(dá)和高效編輯；研究中發(fā)現(xiàn)該彈狀病毒通過(guò)成比例地?cái)U(kuò)展毒粒子的長(zhǎng)度來(lái)包容病毒基因組中較大外源基因片段的插入，為Cas9在基因組的穩(wěn)定性和載體承載能力提供了一種可能［35］。

此外，Lei等［36］將CRISPR-Cas9系統(tǒng)直接轉(zhuǎn)化花粉母細(xì)胞獲得再生植株。Daniel F.Voytas團(tuán)隊(duì)利用植物分生組織重要的發(fā)育調(diào)控因子（Development regulators，DRs）包 括WUSCHEL（WUS）、SHOOT MERISTEMLESS（STM）、ipt的不同組合，誘導(dǎo)分生組織產(chǎn)生莖及小葉，進(jìn)而生根培養(yǎng)，促使芽狀增殖體形成穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)基因植株；之后將Cas9轉(zhuǎn)基因煙草地上分生組織全部去除后，用含有DRs和PDS sgRNA表達(dá)單元的農(nóng)桿菌注射切口部位，最終獲得可以穩(wěn)定遺傳的基因編輯后代，并在部分基因編輯后代中已經(jīng)檢測(cè)不到外源轉(zhuǎn)基因插入［37］。上述研究成果可以為不依賴于組織培養(yǎng)的基因編輯技術(shù)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

如圖2所示，組裝的CRISPR-Cas9 RNPs通過(guò)PEG介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。包含CRISPR-Cas組件的T-DNA通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞（外植體如子葉、下胚軸；小孢子細(xì)胞以及完整植株體），最后原生質(zhì)體或者組織再生成基因編輯植株。在病毒誘導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)中，sgRNA與RNA移動(dòng)元件整合到煙草環(huán)斑病毒（TRV）RNA2，將TRV RNA1和TRV RNA2轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌注射到Cas9超表達(dá)的植株，sgRNAs表達(dá)后在組織中傳遞靶向突變目標(biāo)基因。通過(guò)denovomeristem誘導(dǎo)系統(tǒng)驗(yàn)證，去除Cas9超表達(dá)植株分生組織后，將表達(dá)形態(tài)建成調(diào)控因子（MRs）和sgRNA表達(dá)的載體注射到剪枝的位置。MRs能夠誘導(dǎo)基因編輯分生組織從頭形成，最后從發(fā)育的芽再生得到基因編輯植株。

圖2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)遞送到植物的方法

3 CRISPR-Cas9在蔬菜作物中的應(yīng)用

目前CRISPR-Cas9已經(jīng)在主要糧食作物中應(yīng)用，解決了產(chǎn)量提升、品質(zhì)改良和抗性增強(qiáng)等育種資源匱乏的難題。隨著50多種蔬菜作物全基因組測(cè)序的實(shí)現(xiàn)，一些重要表型和農(nóng)藝性狀如抗病性、果實(shí)形狀、顏色、口感、熟性、風(fēng)味以及雌雄花分化等關(guān)鍵基因的功能得以詮釋，為CRISPR-Cas9技術(shù)成功應(yīng)用于蔬菜育種提供了豐富的基因資源。

3.1 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物生物脅迫抗性

利用基因編輯系統(tǒng)提高植物對(duì)病毒的抗性，主要采用2種思路：一是促使病毒基因組中編碼外殼蛋白的基因或者病毒復(fù)制子發(fā)生基因突變，二是敲除參與作物抗病毒途徑的關(guān)鍵基因。馬鈴薯Y病毒屬基因組連接蛋白（Virus genome-linked protein，VPg）與植物真核翻譯起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）的結(jié)合在Y病毒屬病毒侵染植物過(guò)程中起關(guān)鍵作用，通過(guò)突變eIF4E的關(guān)鍵位點(diǎn)能影響病毒-植物的互作，并介導(dǎo)植物對(duì)病毒的抗性［38］。在黃瓜中利用CRISPR-Cas靶向突變感病elF4E基因型的N′和C′末端，獲得非轉(zhuǎn)基因的純合植株表現(xiàn)對(duì)黃瓜脈黃化病毒（Cucumber vein yellowing virus）的免疫以及西葫蘆花葉病毒（Potyviruses Zucchini yellow mosaic virus）和木瓜環(huán)斑花葉病毒-W（Papaya ring spot mosaic virus-W）的抗性［39］。根據(jù)植物雙生病毒甜菜曲葉病毒基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列信息，設(shè)計(jì)不同組合CRISPR-sgRNA表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至煙草、擬南芥葉片，檢測(cè)轉(zhuǎn)化不同組合的葉片表面病毒積累量，得出相比對(duì)編碼區(qū)的突變，對(duì)非編碼區(qū)的突變既能降低甚至抑制病毒的復(fù)制能力，又能減少病毒變體的產(chǎn)生［40］。真菌性病害如霜霉病和白粉病是導(dǎo)致蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)下降的重要原因［23］。擬南芥的DMR6（Downy mildew resistant）基因?qū)儆谝訤e（Ⅱ）作為輔因子的2-氧代戊二酸加氧酶，參與了水楊酸穩(wěn)態(tài)，超表達(dá)能提高對(duì)霜霉病的感病性［41］。利用基因CRISPR-Cas9使番茄中的AtDMR6同源基因突變，所得的DMR6突變體對(duì)假單胞桿菌、疫霉屬菌、黃單胞菌屬具有抗病性。Mlo1（Mildew resistant locus 1）編碼膜結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，是白粉病敏感型基因。利用CRISPR-Cas9使番茄中的Mlo1基因突變，產(chǎn)生對(duì)白粉?。∣idium neolycopersici）的抗性［42］。PMR4（Powdery mildew resistance 4）編碼胼胝質(zhì)合成酶，能對(duì)白粉菌產(chǎn)生抗性。蔬菜真菌性病害尖孢鐮刀菌能夠引發(fā) 枯 萎 病［43］。利 用CRISPR-Cas9敲 除 番 茄Solyc08g075770基因提高對(duì)枯萎病的敏感性［44］。灰霉病菌屬于氣傳病害，可以隨空氣、水流以及農(nóng)事操作等方式傳播，是設(shè)施蔬菜普遍發(fā)生且難以防治的真菌性病害。番茄果實(shí)采收后尤其容易感染灰霉病，利用CRISPR-Cas9技術(shù)使MAPK3（Mitogen-activated protein kinase 3）基因突變能夠增強(qiáng)對(duì)灰霉病的抗病性［45］。丁香假單胞菌（Pseudomonassyringae）是重要的植物細(xì)菌致病菌，能夠感染50多種農(nóng)作物。在侵染過(guò)程中，先定植于植物葉片表面，再利用鞭毛裝置運(yùn)動(dòng)到葉片背部氣孔，通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TypeⅢsecretion system，T3SS）將T3SS效應(yīng)蛋白注射到宿主細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致宿主致病。在擬南芥中JAZ2（Jasmonatezim domain protein 2）基因能夠表現(xiàn)對(duì)丁香假單胞菌的抗性，研究者利用CRISPR-Cas9使番茄JAZ2基因的C′末端茉莉酸相關(guān)結(jié)構(gòu)域（JAZ2Δjas）突變，得到JAZ2抑制子植株，表現(xiàn)出對(duì)丁香假單胞菌的抗性［46，47］。

3.2 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物非生物脅迫抗性

油菜素內(nèi)酯相關(guān)的抗性基因（Brassinazole resistant 1，BZR1）調(diào)控著油菜素甾醇（Brassinosteroid，BR）反應(yīng)。利用CRISPR獲得的bzr1突變體以及BZR1超表達(dá)的突變體研究得出，BZR1基因參與調(diào)控植物的耐冷途徑［48］。SlMAPK3（Solanum lycopersicum mitogen-activated protein kinase 3）基因參與了番茄的干旱脅迫反應(yīng)，保護(hù)植物細(xì)胞膜免受過(guò)氧化損傷，利用基因編輯技術(shù)使上述基因突變，能夠獲得耐冷和耐旱的新種質(zhì)資源［49］。

3.3 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物除草劑抗性

雜草是影響蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要脅迫因素，生產(chǎn)上通常使用選擇性除草劑來(lái)防治。為了獲得抗除草劑的瓜果類蔬菜，并應(yīng)用于田間生產(chǎn)，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，使西瓜中除草劑靶標(biāo)基因乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）定向突變，獲得抗除草劑的西瓜種質(zhì)［50］。利用胞嘧啶單堿基編輯技術(shù)（Cytidine base editing，CBEs）使番茄和馬鈴薯ALS編碼區(qū)產(chǎn)生C-T的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致氨基酸的突變，在番茄中高達(dá)71%精準(zhǔn)編輯的植株表現(xiàn)為對(duì)氯磺隆除草劑的抗性，并且在番茄和馬鈴薯中分別有12%和10%的編輯植株無(wú)轉(zhuǎn)基因成分［51］。列當(dāng)屬植物是一類植物專性寄生的雜草，需要宿主根系釋放植物激素獨(dú)腳金內(nèi)酯（Strigolactones，SLs）促進(jìn)種子萌發(fā)。利用CRISPR-Cas9突變番茄中類胡蘿卜素合成途徑中類胡蘿卜素雙加氧酶8（Carotenoid Cleavage Dioxygenase 8，CCD8），所得突變體中SLs合成基因表達(dá)量降低，導(dǎo)致植株體內(nèi)SLs含量下降，進(jìn)而抑制專性寄生列當(dāng)屬雜草種子的萌發(fā)［52，53］。

3.4 CRISPR-Cas9改良蔬菜作物的品質(zhì)

蔬菜的品質(zhì)育種目標(biāo)包括改良感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。感官品質(zhì)主要是果實(shí)大小、顏色、紋理和質(zhì)地。番茄子房心皮室的數(shù)目決定了50%果實(shí)大小的遺傳變異，而心皮室數(shù)目由多個(gè)QTLs所決定［54］。利用CRSIRP-Cas9對(duì)SlCLV3的啟動(dòng)子區(qū)編輯，產(chǎn)生了一系列順式調(diào)控的等位基因，不同SlCLV3轉(zhuǎn)錄水平導(dǎo)致植株果實(shí)大小、花序形態(tài)、心室數(shù)目的差異［55，56］。果實(shí)的顏色和質(zhì)地是蔬菜作物重要的感官性狀。研究者根據(jù)不同區(qū)域人群對(duì)蔬菜感官的需求，應(yīng)用CRISPR-Cas技術(shù)實(shí)現(xiàn)定向育種。利用CRISPR-Cas工具靶向突變八氫番茄紅素合成酶基因（Phytoene synthase 1，PSY1）、MYB轉(zhuǎn)錄因子（MYB12）、花青素酶基因（Anthocyanin 2，ANT2）可以獲得黃色、粉色以及紫色的番茄［57-59］。營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的改良主要涉及含糖量、維生素以及生物強(qiáng)化復(fù)合物等。碳水化合物和維生素是重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。多個(gè)基因參與了蔗糖和類胡蘿卜素（在人體中維生素前體A能夠被吸收并轉(zhuǎn)化為維生素A）的合成與代謝。比如利用CRISPR-Cas敲 除MPK20（Mitogen-activated protein kinase 20）基因，能夠阻斷蔗糖代謝途徑中多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄［60］。生物強(qiáng)化被定義為利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段提高植物對(duì)礦物質(zhì)的吸收、轉(zhuǎn)移和代謝能力，有益于人體健康的微量元素富集于食物中，長(zhǎng)期食用能有效預(yù)防心血管疾病和癌癥［61］?；ㄇ嗨兀?2］、蘋果酸酯［63］、γ-氨基丁酸GABA［64］以及番茄紅素［65］等被認(rèn)為是生物強(qiáng)化物質(zhì)，利用CRISPR-Cas9技術(shù)調(diào)控代謝途徑的關(guān)鍵基因能夠在果實(shí)中富集這類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，比如編輯GABA合成途徑中的多個(gè)基因能夠使番茄中GABA的含量增加11～12倍［66］；調(diào)控鋁酸鹽轉(zhuǎn) 運(yùn) 子（Aluminum-activated malate transporter 9，ALMT9）能夠改良番茄果實(shí)中蘋果酸鹽的含量［63］。對(duì)生菜維生素C合成限速酶基因（LsGGP1和Ls-GGP2）的上游表達(dá)調(diào)控元件（uORF）精準(zhǔn)編輯能夠提高mRNA翻譯水平，使得維生素C含量顯著提高［67］。利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除7-脫氫膽固醇還原酶的特定亞型SL7-DR2，能夠?qū)е鲁墒旆压麑?shí)中7-DHC含量大量增加，通過(guò)紫外線處理編輯番茄果實(shí)能夠促使7-DHC轉(zhuǎn)化為維生素D3，1個(gè)番茄中含量相當(dāng)于2個(gè)中等大小雞蛋或28 g金槍魚，由于該維生素D合成途徑也存在于茄子、馬鈴薯、辣椒等其他茄科植物中，因此，可以采用類似方法提高維生素D含量［68］。除了上述提高蔬菜作物有益人體健康的營(yíng)養(yǎng)成分外，同時(shí)還可以通過(guò)降低對(duì)人類食用有風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的含量來(lái)提高品質(zhì)。在馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿（SGAs）如α-茄堿和α-卡茄堿含量過(guò)高會(huì)嚴(yán)重影響口感，并導(dǎo)致食用風(fēng)險(xiǎn)，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除馬鈴薯SGA生物合成途徑中類固醇16α-羥化酶（St16DOX）基因，獲得無(wú)SGA的優(yōu)良種質(zhì)資源［69］。茄子多酚氧化酶（Polyphenol oxidase genes，PPOs）是引起果實(shí)酶促褐變的主要原因，對(duì)茄子與果實(shí)氧化相關(guān)的3個(gè)多酚氧化酶基因（SmelPPO4、SmelPPO5、SmelPPO6）同時(shí)突變能夠顯著降低茄子果實(shí)的褐化［70］。

3.5 CRISPR-Cas9在蔬菜作物馴化中的應(yīng)用

高產(chǎn)和適宜大規(guī)模農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的栽培作物都經(jīng)歷了長(zhǎng)期的馴化和選育。隨著作物遺傳改良，遺傳多樣性、抗病和抗環(huán)境脅迫能力逐漸降低，通過(guò)傳統(tǒng)雜交的方式將野生種的優(yōu)良性狀再次導(dǎo)入栽培種耗時(shí)費(fèi)力且常伴隨遺傳累贅。利用CRISPR技術(shù)可以修飾野生種中重要的馴化基因，快速獲得產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性俱佳的新作物，這個(gè)過(guò)程被稱為從頭馴化（Denovodomestication）。中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所許操研究組和高彩霞研究組合作，選用天然耐鹽堿和抗細(xì)菌瘡痂病的野生醋栗番茄（Solanumpimpinellifolium）作為基礎(chǔ)材料，用基因編輯技術(shù)精準(zhǔn)靶向開花的光周期敏感性、株型和果實(shí)同步成熟控制基因SP和SP5G的編碼區(qū)、果實(shí)大小控制基因SlCLV3和SlWUS的順式調(diào)控元件和維生素C合成酶基因SlGGP1的上游開放閱讀框（Upstream open reading fragment，uORF）［71］，在保證野生番茄對(duì)鹽堿和瘡痂病天然抗性的前提下，消除了開花的光周期敏感性，突破了栽種地域限制，同時(shí)將醋栗番茄開花晚、坐果稀的無(wú)限生長(zhǎng)型（Indeterminate）的株型變成了雙有限生長(zhǎng)型（Double determinate）的緊湊株型，提高了坐果率、果實(shí)成熟的同步性和收獲指數(shù)。對(duì)小肽基因SlCLV3及其信號(hào)途徑下游基因SlWUS的順式調(diào)控元件和SlGGP1上游開放閱讀框的編輯使野生番茄果實(shí)變大，維生素C含量升高［55］。美國(guó)冷泉港霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所與康奈爾大學(xué)博伊斯湯普森研究所合作，對(duì)富含維生素和抗氧化劑的番茄近緣種印加酸漿（Physalispruinosa）又名紅菇娘進(jìn)行從頭馴化。利用CRISPR基因編輯技術(shù)敲除SELF-PRUNING5G基因使植株形態(tài)發(fā)生改變，停止發(fā)芽和生長(zhǎng)葉子轉(zhuǎn)而生長(zhǎng)更多的花和果實(shí)，最后使得果實(shí)數(shù)量增加50%；突變CLV1基因后果實(shí)重量增加24%。傳統(tǒng)育種可能需要數(shù)十年才能完成改良，而基因編輯技術(shù)在不到2年內(nèi)通過(guò)兩個(gè)關(guān)鍵的馴化基因突變獲得了優(yōu)良品種［72］。巴西維索薩聯(lián)邦大學(xué)領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)將野生番茄中存在的優(yōu)良性狀與農(nóng)藝學(xué)上所需性狀相結(jié)合，選擇當(dāng)前番茄品種中決定產(chǎn)量和品質(zhì)的6個(gè)基因進(jìn)行基因編輯，成功地改變了野生番茄的形態(tài)、果實(shí)大小、數(shù)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，尤其是番茄紅素積累量相比廣泛栽培種Solanumlycopersicum提高了500%［73］。

3.6 優(yōu)化CRISPR-Cas載體系統(tǒng)獲得非轉(zhuǎn)基因植株的方法

自1996年首例轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用以來(lái)，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物新品種研發(fā)從抗蟲、抗除草劑等第一代產(chǎn)品向改善營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和提高產(chǎn)量的第二代產(chǎn)品轉(zhuǎn)變，并顯示良好的市場(chǎng)開發(fā)前景。但是轉(zhuǎn)基因過(guò)程引入了外源DNA片段可能會(huì)影響插入位點(diǎn)相鄰基因的表達(dá)［5］。CRISPR-Cas9能直接對(duì)目標(biāo)性狀基因進(jìn)行修飾，之后通過(guò)自交或者雜交剔除外源基因以消除轉(zhuǎn)化外源片段的安全顧慮。蔬菜作物種類繁多，有的以基因型雜合形式存在，自交以及雜交不親和，生育期長(zhǎng)，基因組復(fù)雜度高，如三倍體或多倍體等以營(yíng)養(yǎng)體繁殖。為能獲得無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的CRISPR-Cas9基因編輯的植株，研究人員開發(fā)了2種方法：①基于位點(diǎn)特異性重組酶（Site-specific recombinase flippase，F(xiàn)lp）方法［74］。Flp能夠識(shí)別34 bp長(zhǎng)的FRT序列。Flp/FRT系統(tǒng)能有效剔除轉(zhuǎn)基因蘋果以及葡萄中的T-DNA表達(dá)組件［75-77］；②依賴于Cas9蛋白的剪切機(jī)制。在CRISPR-Cas9載體的LB和RB端合成一段靶序列，命名為剪切靶位點(diǎn)（Cleavage target sites，CTS）。當(dāng)CRISPR-Cas9載體轉(zhuǎn)化到植物中時(shí)，Cas9蛋白剪切內(nèi)源基因靶位點(diǎn)的同時(shí)也能剪切CTS，最終將T-DNA區(qū)域的外源片段從基因組中釋放，從而獲得T-DNA free的植株［75］。

4 CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)在蔬菜育種中的挑戰(zhàn)及展望

得益于蔬菜作物全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的公開以及功能基因組學(xué)的迅速發(fā)展，CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)在蔬菜育種中應(yīng)用。但未來(lái)CRISPR-Cas技術(shù)的應(yīng)用面臨兩個(gè)挑戰(zhàn)：一是準(zhǔn)確選擇靶向突變的關(guān)鍵基因。通常重要的農(nóng)藝性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，編輯單個(gè)基因并不會(huì)產(chǎn)生表型的變化，因此利用CRISPR-Cas介導(dǎo)的靶位點(diǎn)特定插入以及染色體重組方法能夠聚合多個(gè)突變的等位基因［78-80］。利用基因編輯技術(shù)阻斷特定基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物適應(yīng)性降低，因此需要對(duì)基因功能進(jìn)行高效特異的精確調(diào)控。植物的順式作用元件（Cis-regulatory elements，CREs）是非編碼DNA序列，常決定了基因的轉(zhuǎn)錄，其中基因調(diào)控區(qū)單核苷酸的突變、插入、缺失、倒位以及表觀遺傳變異與作物的馴化息息相關(guān)［81］，利用CRISPR-Cas對(duì)基因調(diào)控區(qū)突變能夠產(chǎn)生數(shù)量性狀的變異，導(dǎo)致多樣化的表型。目前蔬菜作物CREs的基因編輯還處于起步研究階段，接下來(lái)需要將不同突變型的CREs所產(chǎn)生的表達(dá)量變化同相應(yīng)的表型關(guān)聯(lián)起來(lái)，通過(guò)對(duì)CREs的基因編輯獲得豐富的育種資源；二是建立適應(yīng)于不同類蔬菜的基因組編輯技術(shù)。雖然目前能通過(guò)農(nóng)桿菌或者基因槍介導(dǎo)CRISPR-Cas元件轉(zhuǎn)化外植體，PEG或者電穿孔法介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，但是開發(fā)具有普適高效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用于蔬菜作物的基因編輯仍存在較大難度，CRISPR-Cas組件遺傳轉(zhuǎn)化效率以及轉(zhuǎn)化組織再生成植株的能力成為技術(shù)應(yīng)用的限制因素。為提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化后再生能力，可利用革蘭氏陰性細(xì)菌如丁香假單胞細(xì)菌的分泌系統(tǒng)T3SS在農(nóng)桿菌中表達(dá)，將三型效應(yīng)子T3Es如AvrPto、AvrPtoB、HopAO1運(yùn)送到細(xì)胞中，通過(guò)阻斷植物PTI反應(yīng)提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率［82］。在CRISPR-Cas表達(dá)系統(tǒng)中同時(shí)超表達(dá)植物形態(tài)建成的調(diào)控基因LEAFY COTYLEDON1、LEAFYCOTYLEDON2、WUSCHEL（WUS）、BABYBOOM（BBM）、GRF4（GROWTH-REGULATINGFACTOR4）和互 作因 子GIF1（GRF-INTERACTINGFACTOR1）促使轉(zhuǎn)化后的再生［83-85］。