余 躍，唐 駿，肖 旻

(廈門(mén)理工學(xué)院 通信工程系，福建 廈門(mén) 361024)

0 引 言

數(shù)字PCR(Polymerase Chain Reaction)是新一代核酸檢測(cè)技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性以及絕對(duì)定量的優(yōu)點(diǎn)，相較于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)不依賴(lài)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就可以進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)[1-2]。本世紀(jì)以來(lái)，基于微納制造工藝的集成微腔室陣列芯片的數(shù)字PCR實(shí)現(xiàn)平臺(tái)在病毒檢測(cè)、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)以及食品病毒學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用前景[3-4]，準(zhǔn)確地分割數(shù)字PCR熒光圖像微腔室對(duì)提升數(shù)字PCR檢測(cè)精度具有重要意義。然而，在獲取數(shù)字PCR熒光圖像過(guò)程中，通常會(huì)面臨感光不均勻的情況，使得從所采集的圖像中分割微腔室的難度增大。由數(shù)字PCR技術(shù)原理可知，從熒光圖像分割出的有效腔室越少，絕對(duì)定量準(zhǔn)確度越低[5-6]。

當(dāng)前，在數(shù)字PCR熒光圖像分割中常用的方法有全局自適應(yīng)閾值法、局部自適應(yīng)閾值法以及基于深度學(xué)習(xí)的分割算法等[7-8]。由于熒光圖像存在感光不均勻的現(xiàn)象，全局自適應(yīng)閾值法和局部自適應(yīng)閾值法分割準(zhǔn)確率較低。文獻(xiàn)[9]根據(jù)熒光圖像直方圖的分布特點(diǎn)使用Otsu算法選取雙閾值進(jìn)行分割，但不適用于感光不均勻的熒光圖像。為提高分割準(zhǔn)確率，文獻(xiàn)[10]中在去除光照分量基礎(chǔ)上再使用Otsu算法分割，但其分割結(jié)果中仍存在大量有效信息丟失。近年來(lái)，隨著深度學(xué)習(xí)在圖像領(lǐng)域應(yīng)用的日益廣泛，有學(xué)者將深度學(xué)習(xí)技術(shù)引入數(shù)字PCR熒光圖像分割：文獻(xiàn)[11]中將Mask R-CNN模型應(yīng)用于數(shù)字PCR熒光圖像分割，通過(guò)殘差運(yùn)算搭建深層次的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行實(shí)例分割；文獻(xiàn)[12]中通過(guò)先進(jìn)行微腔室精確定位再使用微腔室及其周?chē)皇覅?shù)作為隨機(jī)森林分類(lèi)器訓(xùn)練集進(jìn)行訓(xùn)練，實(shí)現(xiàn)微腔室分類(lèi)。然而這些算法主要針對(duì)感光均勻圖像中陽(yáng)性腔室的檢測(cè)，而對(duì)感光不均勻區(qū)域較大且密集度高的數(shù)字PCR熒光圖像難以準(zhǔn)確檢測(cè)出目標(biāo)腔室，會(huì)將大量感光不均勻區(qū)域的偽陽(yáng)性腔室錯(cuò)判成陽(yáng)性腔室。

基于上述問(wèn)題，本文提出了兩步分割算法，實(shí)現(xiàn)感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像的分割。該算法首先利用傳統(tǒng)Otsu算法對(duì)預(yù)處理后的圖像進(jìn)行第一步分割，再使用改進(jìn)后的Otsu算法進(jìn)行第二步分割，結(jié)合兩步分割結(jié)果形成最終分割圖像，實(shí)現(xiàn)感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像的自動(dòng)分割。

1 第一步分割算法

首先將待處理圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像，并進(jìn)行雙線(xiàn)性插值處理提升圖像細(xì)節(jié)表現(xiàn)力[13]。由于圖像部分區(qū)域偏暗或偏亮，利用自適應(yīng)直方圖均衡化可增強(qiáng)圖像清晰度和對(duì)比度。為了進(jìn)一步突出反應(yīng)腔室的特征，采用Top-hat變換和Bottom-hat變換提高圖像對(duì)比度。

使用Top-hat變換和Bottom-hat變換分別提取圖像灰度峰值和灰度谷值部分：

That(f)=f-(f°b)，

(1)

Bhat(f)=(f·b)-f。

(2)

式(1)和式(2)中：That(f)表示灰度峰值部分，f表示自適應(yīng)直方圖均衡化后的圖像，f°b表示使用結(jié)構(gòu)元素b對(duì)f進(jìn)行開(kāi)運(yùn)算；Bhat(f)表示灰度谷值部分，f·b表示使用結(jié)構(gòu)元素b對(duì)f進(jìn)行閉運(yùn)算。之后對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行組合運(yùn)算達(dá)到增強(qiáng)圖像對(duì)比度的效果：

I=That(f)+g-Bhat(f)。

(3)

式中：g表示雙線(xiàn)性插值結(jié)果，I表示對(duì)比度增強(qiáng)后圖像。

經(jīng)過(guò)上述處理，圖像仍存在噪聲，使用中值濾波和高斯濾波可大幅改善圖像質(zhì)量[14]。

Otsu算法依據(jù)灰度直方圖確定分割閾值[15-16]，基本原理如下：設(shè)圖像灰度級(jí)數(shù)為L(zhǎng)，灰度i出現(xiàn)的概率為h(i)，以閾值T將圖像分為背景S0(T)=[0,…,T]和前景S1(T)=[T+1,…,L-1]，背景與前景的概率分別為

(4)

(5)

則背景與前景的平均灰度值分別為

(6)

(7)

整幅圖像的平均灰度值為

μ=G0(T)μ0(T)+G1(T)μ1(T)。

(8)

于是，當(dāng)閾值為T(mén)時(shí)，背景與前景的類(lèi)間方差為

σ2(T)=G0(T)(μ0(T)-μ)2+G1(T)(μ1(T)-μ)2

(9)

將T遍歷灰度區(qū)間，得到σ2(T)最大時(shí)的Thre1為圖像最優(yōu)分割閾值：

(10)

使用Otsu算法進(jìn)行第一步分割結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)圖中部分區(qū)域分割不完全。

圖1 第一步分割結(jié)果

2 第二步分割算法

因感光不均勻區(qū)域干擾，導(dǎo)致第一步分割后的圖像存在許多分割不完全區(qū)域，且這些區(qū)域的面積通常比單個(gè)腔室的面積大得多。因此，可以通過(guò)連通域面積大小來(lái)確定分割不完全區(qū)域，對(duì)其進(jìn)行第二步分割，流程如圖2所示。

圖2 第二步分割流程圖

2.1 基于Otsu算法的局部閾值法

局部閾值法將圖像劃分為若干子區(qū)域，再對(duì)每個(gè)子區(qū)域分別計(jì)算最優(yōu)分割閾值，可降低非均勻感光帶來(lái)的影響。設(shè)計(jì)基于Otsu算法的局部閾值法對(duì)感光不均勻區(qū)域進(jìn)行第二步分割。

首先，統(tǒng)計(jì)圖像分割不完全區(qū)域個(gè)數(shù)為n，再逐個(gè)對(duì)分割不完全區(qū)域灰度圖進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理包括圖像增強(qiáng)和圖像濾波。然后，使用Otsu算法分割后填補(bǔ)到原位置，待所有區(qū)域分割完成后，通過(guò)邏輯運(yùn)算消除圖像灰度之間的不連貫，進(jìn)而形成最終分割圖。算法流程如圖3所示。該算法可在第一步分割基礎(chǔ)上對(duì)部分感光不均勻區(qū)域進(jìn)行分割，但算法步驟繁多、復(fù)雜度高。

圖3 局部閾值法分割流程圖

2.2 改進(jìn)Otsu算法

圖像復(fù)雜度是用來(lái)反映圖像內(nèi)部的復(fù)雜程度，可描述圖像進(jìn)行某些處理(如圖像增強(qiáng)、圖像分割、圖像識(shí)別等)時(shí)內(nèi)在的困難程度[17]?；趶V義集合的圖像復(fù)雜度的計(jì)算公式為

(11)

式中：C表示圖像復(fù)雜度，單位為b；t表示劃分目標(biāo)區(qū)域和背景區(qū)域的分割閾值；n(k)表示灰度k的像素個(gè)數(shù)；N表示圖像像素總數(shù)。

廣義集合中元素具有互異性、無(wú)序性以及確定性的特點(diǎn)，可知影響圖像復(fù)雜度的因素是圖像灰度級(jí)數(shù)量和其出現(xiàn)的頻次，而與灰度本身大小無(wú)關(guān)。圖像復(fù)雜度是圖像的一種客觀屬性，由其性質(zhì)可知，圖像整體復(fù)雜度大于等于各部分復(fù)雜度之和[18]，故圖像灰度級(jí)數(shù)量與其出現(xiàn)頻次的變化會(huì)影響圖像復(fù)雜度大小。由傳統(tǒng)Otsu算法原理可知，當(dāng)圖像暗像素過(guò)多時(shí)會(huì)拉低分割閾值，亮像素過(guò)多時(shí)會(huì)拉高分割閾值[19]。因此，在確定分割閾值前，利用圖像復(fù)雜度的性質(zhì)確定待分割區(qū)域的大致灰度范圍，減少較低和較高灰度對(duì)分割閾值確定的影響，再基于該灰度范圍內(nèi)灰度統(tǒng)計(jì)信息計(jì)算最優(yōu)分割閾值。這樣克服了傳統(tǒng)Otsu算法需要統(tǒng)計(jì)所有灰度信息再計(jì)算分割閾值的缺點(diǎn)，閾值的選取會(huì)更加快速準(zhǔn)確，且分割效果更好。

假設(shè)待分割圖像f(x,y)總像素?cái)?shù)為N0，灰度級(jí)數(shù)為L(zhǎng)，灰度值為k的像素?cái)?shù)為n(k)，利用公式(11)計(jì)算全局圖像復(fù)雜度為

(12)

圖像最小灰度值和最大灰度值分別記做Zmin和Zmax。由于待分割圖像為第一步分割不完全區(qū)域，待分割區(qū)域灰度范圍最小值和最大值應(yīng)位于閾值Thre1兩側(cè)，故令初始閾值T0為T(mén)hre1。以迭代步長(zhǎng)為1的速度同時(shí)縮減圖像灰度區(qū)間兩端灰度值，縮減后最小灰度值和最大灰度值分別為α和β。設(shè)灰度區(qū)間(α,T0)和(T0+1,β)的像素總數(shù)分別為N1和N2，則兩區(qū)間內(nèi)圖像復(fù)雜度C1和C2分別為

(13)

(14)

灰度區(qū)間(α,T0)和(T0+1,β)內(nèi)像素總數(shù)占灰度區(qū)間(α,β)內(nèi)像素總數(shù)的比例分別為r1和r2：

(15)

(16)

則灰度區(qū)間(α,β)的平均復(fù)雜度為

(17)

假設(shè)存在任意大于0的數(shù)ε，當(dāng)最小灰度值為α、最大灰度值為β時(shí)滿(mǎn)足迭代條件

(18)

α和β的取值范圍分別為

Zmin≤α

式(18)中：ΔC表示灰度縮減前后圖像復(fù)雜度的變化量；ε用于控制灰度縮減程度，ε越大，表示待分割區(qū)域灰度范圍越小。ε的數(shù)值可根據(jù)圖像感光不均勻程度確定。經(jīng)仿真驗(yàn)證，針對(duì)數(shù)字PCR熒光圖像感光不均勻區(qū)域的分割，ε取0.5C0時(shí)計(jì)算的分割閾值更準(zhǔn)確。

通過(guò)上述算法確定最終待分割區(qū)域的灰度范圍為(α,β)，統(tǒng)計(jì)該范圍灰度信息，尋找使該范圍的類(lèi)間方差最大的閾值Thre2，再利用Thre2對(duì)圖像進(jìn)行分割：

(19)

最后通過(guò)邏輯運(yùn)算將第一步分割結(jié)果與f*(x,y)合并，形成最終分割圖像。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

為驗(yàn)證本文算法的有效性，對(duì)感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像進(jìn)行了仿真實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)平臺(tái)是Intel(R)Core(TM)i5-8265U CPU @ 1.60 GHz，編程環(huán)境為Matlab R2020a。圖1(a)是一幅數(shù)字PCR熒光圖像局部，可以看出該圖中含有感光不均勻區(qū)域。圖4(a)描述的是熒光圖像第1 360列的第1 220～1 500行灰度在對(duì)比度增強(qiáng)前后的波動(dòng)曲線(xiàn)，分析可知，圖像對(duì)比度增強(qiáng)后波動(dòng)曲線(xiàn)的波峰與波谷之間灰度差值增加，達(dá)到了圖像對(duì)比度增強(qiáng)的效果。圖4(b)是預(yù)處理后的圖像，可以看出預(yù)處理不僅改善了圖像灰度分布的均勻性，而且使腔室特征更加明顯。提取第一步分割不完全區(qū)域使用局部閾值法進(jìn)行第二步分割結(jié)果如圖4(c)所示，該法雖然分割了該圖的微腔室，但耗時(shí)較長(zhǎng)，魯棒性不好，算法復(fù)雜度高。

圖4 預(yù)處理及局部閾值法分割結(jié)果

使用本文改進(jìn)的Otsu算法進(jìn)行第二步分割，并選擇傳統(tǒng)Otsu算法、自適應(yīng)閾值法以及分塊閾值法同時(shí)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。圖5(a)是第一步分割不完全區(qū)域灰度圖，可以看出該圖對(duì)比度低且灰度像素分布不均勻。經(jīng)預(yù)處理后使用傳統(tǒng)Otsu算法分割結(jié)果如圖5(b)所示，由于圖像低灰度像素過(guò)多，嚴(yán)重拉低了分割閾值，導(dǎo)致待分割區(qū)域中央丟失了若干目標(biāo)。圖5(c)是自適應(yīng)閾值法分割結(jié)果，待分割區(qū)域邊緣受到低灰度像素的干擾，幾乎分割不出腔室的形狀，而在其他區(qū)域也存在嚴(yán)重的噪聲干擾，腔室之間粘連嚴(yán)重。圖5(d)是分塊閾值法分割結(jié)果，由于分塊大小固定，受灰度分布不均勻的影響，分割后的圖像不連貫。圖5(e)為本文改進(jìn)的Otsu算法分割結(jié)果，該法消除了過(guò)高與過(guò)低灰度的影響，腔室被準(zhǔn)確分割出來(lái)，且邊緣也未受到低灰度像素的干擾。圖5(f)是使用改進(jìn)的Otsu算法進(jìn)行第二步分割并與第一步分割結(jié)果合并形成的最終分割圖，可見(jiàn)本文的兩步分割算法有效分割了光照不均勻熒光圖像的目標(biāo)腔室，分割后的圖像自然連貫，腔室邊緣清晰完整，反映了腔室的實(shí)際情況。

圖5 第二步分割結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證本文算法的有效性，又對(duì)另外四幅感光不均勻熒光圖像進(jìn)行了分割，從圖6分割結(jié)果看出，傳統(tǒng)Otsu算法和自適應(yīng)閾值法分割結(jié)果粘粘嚴(yán)重，無(wú)法分割出目標(biāo)腔室；分塊閾值法分割后的圖像塊與塊之間連接不自然，甚至部分區(qū)域有效信息丟失；局部閾值法對(duì)原圖5的分割結(jié)果中部分腔室未能準(zhǔn)確分割；而本文算法對(duì)幾幅圖像都進(jìn)行了準(zhǔn)確分割，所分割的目標(biāo)腔室輪廓清晰，包含腔室質(zhì)心，為熒光信號(hào)提取提供了保障，從而也驗(yàn)證了本文算法的有效性。表1為Otsu算法改進(jìn)前后閾值對(duì)比，可以看出改進(jìn)后Otsu算法分割閾值高于傳統(tǒng)Otsu算法分割閾值。由于第二步分割對(duì)象主要是感光不均勻區(qū)域，其閾值會(huì)高于第一步分割閾值，符合待分割圖像實(shí)際情況。

圖6 分割算法實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比圖

表1 Otsu算法改進(jìn)前后閾值對(duì)比

為測(cè)試改進(jìn)的Otsu算法分割速度，使用不同算法對(duì)五幅圖像第二步分割耗時(shí)進(jìn)行比較，各算法耗時(shí)如表2所示。由表中數(shù)據(jù)可知，本文改進(jìn)的Otsu算法分割耗時(shí)低于其他算法，與局部閾值法相比，不僅提升了分割效果，降低了算法復(fù)雜度，也提高了算法的運(yùn)行速度。

表2 五種分割算法耗時(shí)對(duì)比

為對(duì)各算法分割結(jié)果進(jìn)行定量評(píng)估，本文選用人工手動(dòng)分割結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)二值掩碼(Ground truth,GT)進(jìn)行誤分類(lèi)誤差(Misclassification Error,ME)計(jì)算[20]。ME值可對(duì)各算法分割性能進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，ME值越低表示算法分割性能越好，其數(shù)值定義為

(20)

式中：B0和F0表示標(biāo)準(zhǔn)二值掩碼中的背景和前景，BT和FT表示分割結(jié)果中的背景和前景，|·|表示取集合元素總數(shù)。表3給出了幾種算法分割結(jié)果的ME值，由表中數(shù)據(jù)分析可知，自適應(yīng)閾值法分割誤差最大，本文所提兩步分割算法分割誤差最小且分割效果更好。

表3 五種分割算法ME值對(duì)比

4 結(jié)束語(yǔ)

為了解決感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像分割準(zhǔn)確率低的問(wèn)題，本文提出了一種兩步分割算法。第一步分割使用傳統(tǒng)Otsu算法，第二步分割使用改進(jìn)的Otsu算法。其中，在第二步分割中改進(jìn)了傳統(tǒng)Otsu算法需要統(tǒng)計(jì)所有灰度級(jí)信息再計(jì)算閾值的缺點(diǎn)，通過(guò)先確定待分割區(qū)域的閾值范圍，然后基于該范圍的灰度統(tǒng)計(jì)信息計(jì)算分割閾值，提升了閾值選取的準(zhǔn)確性，且分割效果更理想，實(shí)現(xiàn)了感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像的分割。本文算法與局部閾值法、自適應(yīng)閾值法以及分塊閾值法的對(duì)比結(jié)果表明，本文算法魯棒性好、復(fù)雜度低，可以實(shí)現(xiàn)不同程度感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像的分割，分割結(jié)果準(zhǔn)確反映了腔室的實(shí)際情況。這一研究可用于芯片式數(shù)字PCR芯片閱讀儀的分析軟件中，解決目前數(shù)字PCR熒光圖像處理速度慢準(zhǔn)確率低等問(wèn)題。本文算法也可拓展應(yīng)用到其他存在感光不均勻圖像的分割中，具有一定的借鑒意義。但從整體算法流程可知，本文算法需經(jīng)兩步分割完成整幅圖像的分割，接下來(lái)將繼續(xù)對(duì)圖像進(jìn)行算法研究，進(jìn)一步簡(jiǎn)化分割算法流程。