降脂活性小球藻多肽的研究

◎ 楊燕紅，賓雁林，趙大洲，丘鷹昆

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 本溪 117000；2.廈門大學(xué) 藥學(xué)院，福建 廈門 361105；3.一陽(yáng)生生物科技有限公司，福建 廈門 361118）

小球藻（Chlorella cvulgaris）為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂類等。目前研究發(fā)現(xiàn)，小球藻的蛋白具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3-5]、降脂[6]等作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，小球藻蛋白粗提液對(duì)胰脂肪酶（Pancrelipase，PL）活性有抑制作用[6]，而胰脂肪酶[7]是脂肪消化吸收的關(guān)鍵酶，抑制其活性可以有效地降低人體對(duì)脂肪的消化吸收。目前臨床上普遍使用的胰脂酶抑制劑[7]藥物是奧利司他，但該成分存在一些不良反應(yīng)，如肝損傷、營(yíng)養(yǎng)不良、脂肪性大便等胃腸道反應(yīng)。因此，尋找天然產(chǎn)物中胰脂肪酶抑制劑并完善其制備方法十分重要。小球藻具有抑制胰脂肪酶活性的作用。為此，本文通過(guò)多種蛋白酶水解法獲得具有較高抑制胰脂肪酶活性的小球藻多肽。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

小球藻干粉（上海光語(yǔ)生物科技有限公司）；奧利司他（浙江海正藥業(yè)）；風(fēng)味蛋白酶、2709堿性蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；537酸性蛋白酶、氨基肽酶（滄州夏盛生物技術(shù)有限公司）；復(fù)合蛋白、1398中性蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）；超純水（廈門大學(xué)藥學(xué)院提供）；乙醇（色譜 純，F(xiàn)airfleld，CT）；Tris（Sigma公 司）；pNPB（Sigma公司）；DMSO（西隴科學(xué)股份有限公司）；Toyopearl尺寸排阻填料HW-40F（北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；硅藻土（石家莊天旭環(huán)?？萍加邢薰荆?/p>

1.2 儀器

球磨機(jī)（上海英用機(jī)械有限公司）；離心機(jī)（德國(guó)進(jìn)口）；酶標(biāo)儀（IMARK，美國(guó)伯樂(lè)進(jìn)口）；水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；電子天平（CP114METTLER TOLEDO，奧豪斯儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-5200V，昆山市超聲儀器有效公司）。

1.3 小球藻多肽制備方法

1.3.1 破壁提取

準(zhǔn)確稱取小球藻粉500 g；超純水5 L，常溫下攪拌均勻后送入球磨機(jī)均質(zhì)30 min，然后將小球藻粉懸濁液置于帶冷卻功能的超聲波提取器中，溫度設(shè)置為2～6 ℃，在580 W的超聲功率下超聲20 min，得到粗提液。

1.3.2 離心除雜

將粗提液于4 ℃，轉(zhuǎn)速為8 000 r·min-1條件下離心30 min，并過(guò)濾，之后取上清液檢測(cè)其蛋白質(zhì)濃度，后濃縮至蛋白質(zhì)含量為2%，得到小球藻水提物。

1.3.3 酶解

將上述所得的小球藻水提物按照表1各酶的水解條件進(jìn)行酶解處理，經(jīng)過(guò)85 ℃水浴15 min滅酶操作以終止水解反應(yīng)，室溫冷卻后將水解液經(jīng)硅藻土過(guò)濾，取過(guò)濾液經(jīng)減壓濃縮得到酶解產(chǎn)物，減壓濃縮的參數(shù)為真空度0.08～0.10 MPa，濃縮溫度40～60 ℃，濃縮時(shí)間2 h[6,8-10]。

表1 不同酶的水解條件表

1.3.4 脂肪酶抑制劑活性評(píng)價(jià)方法

采用對(duì)硝基苯酚法[11-12]測(cè)定各組分脂肪酶活抑制率。①PL工作液：準(zhǔn)確稱取25 mg PL加5 mL Tris緩沖液，振搖15 min后在18 ℃下離心10 min。②配制底物4-硝基苯丁酸酯（4-nitrophenyl butyrate，pNPB）溶液：量取17.5 μL pNPB，用乙腈定容至10 mL。③稱 取7.57 g Tris，3.65 g NaCl和19.4 mg CaCl2加適量水溶解，用鹽酸調(diào)pH至7.4，室溫冷卻，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，4 ℃保存。然后在96孔板中加入175 μL Tris緩沖液（0.25 mol·L-1Tris緩 沖 液，含0.25 mol·L-1NaCl和0.7 mmol·L-1CaCl2，pH=7.4）、20 μL PL工作液、4 μL樣品后，37 ℃中孵育5 min，然后加入1 μL pNPB溶液，2.5 min后使用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處的OD值，平行3次；奧利司他（Orlistat）代替樣品作為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO代替樣品作為不加抑制劑組；抑制率=（AE-AT）/AE×100%，其中，AT為加抑制劑組的OD值，AE為不加抑制劑組的OD值。

1.3.5 活性多肽純化

將1398中性蛋白酶酶解產(chǎn)物用Toyopearl HW-40F進(jìn)行尺寸排阻色譜分離純化，按出峰情況收集各分離組分，上樣量為500 mg。色譜條件為超純水（A）-乙醇（B）先等度洗脫，0～2 h，100%A；然后梯度洗脫，2～3 h，0～100%B；再等度洗脫，3～4 h 100%B；流速1 mL·min-1，每6 min收集一管，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。收集并合并相同色譜峰，得到11個(gè)餾分，分別命名為A1～A11，并進(jìn)行下一步活性篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶水解產(chǎn)物脂肪酶抑制率比較

將按照1.3.3酶解條件得到的酶解產(chǎn)物配制成4 mg·mL-1，并分別進(jìn)行脂肪酶抑制活性篩選，且與陽(yáng)性藥奧利司他（Orlistat）進(jìn)行對(duì)比，各酶解產(chǎn)物對(duì)脂肪酶活性的抑制率如表2所示。由表2可知，1398中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有較好的脂肪酶抑制活性，其余酶解產(chǎn)物則對(duì)脂肪酶活性無(wú)抑制作用或抑制程度較低。

2.2 中性蛋白酶解產(chǎn)物活性部位確定

A1～A11各組分色譜圖如圖1所示。該部分經(jīng)減壓濃縮后，通過(guò)MALDI-TOF MS測(cè)定各組分多肽分子量[13]，并鑒定各組分對(duì)脂肪酶的抑制活性，其中脂肪酶活抑制率測(cè)試結(jié)果如表3所示。

表2 脂肪酶抑制活性篩選表

圖1 A1～A11餾分色譜圖

表3 組分A1～A11脂肪酶活抑制率表

由表3可知，A7的抑制率最高，達(dá)24.27%，進(jìn)一步對(duì)該提取物進(jìn)行梯度活性實(shí)驗(yàn)篩選，測(cè)定其IC50值為（8.25±0.07） mg·mL-1。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

由不同酶篩選得到的小球藻多肽對(duì)于脂肪酶抑制率不同，其中采用1398中性蛋白酶所制得的小球藻多肽具有更高脂肪酶抑制活性，進(jìn)一步對(duì)該多肽進(jìn)行尺寸排阻色譜分離，發(fā)現(xiàn)不同部位活性不同，組分A7活性最高，其他組分對(duì)脂肪酶無(wú)抑制活性或抑制活性較弱。

3.2 討論

本研究通過(guò)不同酶篩選得到的小球藻多肽對(duì)脂肪酶抑制率不同。其中，中性蛋白酶水解法得到的小球藻多肽，分子量為600～700 Da的多肽對(duì)脂肪酶抑制效果良好，這可能與不同酶水解得到的多肽片段的種類、結(jié)構(gòu)以及所暴露的活性位點(diǎn)不同有關(guān)，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)研究。本文將小球藻以上述方式用1398中性蛋白酶水解，運(yùn)用尺寸排阻色譜分離，收集分子量具有較高脂肪酶抑制活性部分，以此快速獲得具有較高脂肪酶抑制活性的小球藻多肽，該方法制得的小球藻多肽具有開發(fā)降脂活性功能產(chǎn)品的前景。