李海濤，楊柳，方麗，倪康，石元值*

（1.中國農業(yè)科學院茶葉研究所，農業(yè)農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，杭州 310008；2.中國農業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

重金屬含量作為茶葉質量安全的一類重要指標，是茶產業(yè)生產和出口的重點關注對象之一。鎘（Cd）作為我國最嚴重且最易被植物吸收的土壤重金屬污染物，在植物及土壤中的含量一般較低，但該元素進入土壤后易被茶樹根系吸收并轉移到地上部造成累積，且會通過食物鏈進入人體，從而威脅人類健康。當鎘累積濃度超過茶樹自身防御反應的閾值時，茶樹的基本生理過程，如光合、蒸騰、代謝、抗氧化等會受到影響，從而抑制茶樹正常生長，影響茶葉的產量和品質。為保證農副產品的質量安全，我國《土壤環(huán)境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）中規(guī)定：pH≤6.5的農用地鎘污染風險篩選值為≤0.3 mg·kg，風險管制值為≤1.5 mg·kg，其中鎘為土壤總鎘含量。但現在人們普遍認識到，鎘的毒性和對植物的有效性很大程度上取決于其特定的化學形態(tài)和結合狀態(tài)。有效態(tài)鎘能更加準確地反映植物對重金屬的吸收和利用程度，是進行土壤重金屬污染評價的重要參數。研究表明，用土壤總鎘含量來判斷茶葉鎘污染狀況具有一定的局限性，且與茶葉鎘含量的相關性較差，而土壤有效態(tài)鎘含量與茶葉鎘含量的相關性極為顯著。因此，土壤有效態(tài)鎘和總鎘含量結合可以更加全面準確地評估茶園土壤鎘污染狀況。

目前，常用的有效態(tài)鎘提取劑類型主要有稀酸溶液（如HCl、HNO等）、絡合劑（如DTPA、EDTA等）、中性鹽溶液（如CaCl、NHNO等）和緩沖溶液（如NHOAc等）。茶園有效態(tài)鎘提取劑的選擇尚不統(tǒng)一，主要有CaCl、HCl、DTPA 3種。但這3種提取劑是否適用于茶園土壤有效態(tài)鎘的提取還有待驗證。此外，提取劑濃度、提取時間、土液比、振蕩頻率等因素對有效態(tài)鎘提取率的影響也尚未進行對比驗證。篩選出高效的土壤有效態(tài)鎘提取劑及提取方法，可為準確判斷茶樹鎘吸收狀況和確保茶葉產品質量安全提供技術支持。因此，本研究以不同地區(qū)茶園土壤和新梢為材料，選擇5種不同提取劑進行有效態(tài)鎘提取對比試驗，以選出適用于茶園土壤有效態(tài)鎘提取的最佳提取試劑和提取參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集與處理

為使所選樣品鎘含量具有一定的濃度差異，選擇未經鎘處理的田間土壤樣品和經過鎘處理的盆栽土壤樣品及其對應的茶葉新梢（一芽二葉）樣品。采集地點分別為云南省普洱市（=20），浙江省麗水市（=20），中國農業(yè)科學院茶葉研究所嵊州綜合試驗基地（=22，包含13個盆栽樣品，其中8個為人工添加Cd（NO）溶液至土壤鎘含量為0.5 mg·kg，3個為人工添加Cd（NO）溶液至土壤鎘含量為0.9 mg·kg，2個為空白對照）。采用土壤和新梢對應采樣的方法，在樣品點0~20 cm處選取3個采樣點進行取土并混勻，代表該樣點的土壤樣品，新梢樣品為土壤采集點對應的茶樹新梢。采集的新梢樣品用自來水和去離子水清洗3遍并晾干，用微波爐短時間殺青后置于80℃烘箱中烘干，粉碎后密封保存待測。土壤樣品風干后除去礫石、植物殘體，分別過20目篩用于土壤有效態(tài)鎘含量和土壤基本理化性質的測定，過100目篩用于土壤總鎘含量的測定。

1.1.2 供試提取劑的配制

0.1 mol·LCaCl溶液：稱取CaCl11.1 g，溶解后加水稀釋至1 L，備用。

0.1 mol·LHCl溶液：吸取HCl（優(yōu)級純）8.3 mL，加水稀釋至1 L，備用。

1 mol·LNHOAc溶液：稱取NHOAc 77.08 g，溶解后加水稀釋至1 L，備用。

1 mol·LMgCl溶液：稱取MgCl·6HO 203.3 g，溶解后加水稀釋至1 L，備用。

0.005 mol·LDTPA溶液：稱取1.967 g DTPA溶于13.3 mL TEA（三乙醇胺）和少量水中，再稱取1.11 g CaCl溶于水中，一并轉入1 L容量瓶，加水至約950 mL后用6 mol·LHCl溶液調節(jié)pH至7.30（6 mol·LHCl用量約為8.5 mL），最后加水定容至1 L，備用。

1.1.3 主要儀器

微波消解儀（MARS6，美國CEM公司），石墨趕酸儀，高分辨電感耦合等離子體質譜儀（HR-ICP-MS，ELEMENTⅡ，美國熱電），搖床，微量超細球磨機。

1.2 試驗方法

1.2.1 有效態(tài)鎘和總鎘含量測定

土壤有效態(tài)鎘含量測定：稱取過20目篩的土壤樣品5 g于100 mL塑料瓶中，分別加入1.1.2中的5種提取劑各25.0 mL。后置于搖床，搖床參數設定為：溫度25℃，振蕩頻率180 r·min，提取時間2 h。提取完成后先用雙層濾紙過濾，再取少量濾液用親水PTFE針式濾器（孔徑0.22μm）過濾，吸取0.5 mL二次過濾的濾液于15 mL刻度試管中，用超純水稀釋至10 mL，上ICP-MS進行測定。

植物樣品總鎘含量測定：稱取0.2 g植物樣品于聚四氟乙烯消解管中，加4 mL HNO、4 mL HF，加蓋后置于微波消解儀中消解（程序設定為25 min升溫至180℃，并在該溫度下保持20 min），待消解管冷卻后置于趕酸儀（溫度150℃，時間80 min）趕至消解管中僅剩約1 mL液體，用3%HNO定容至50 mL容量瓶中，上ICP-MS進行測定。

土壤樣品總鎘含量測定：稱取0.1 g土壤樣品于聚四氟乙烯消解管中，加6 mL HNO、1 mL HF、2 mL HCl，加蓋后置于微波消解儀中消解（程序設定為30 min升溫至190℃，并在該溫度下保持30 min），待消解管冷卻后置于趕酸儀（溫度設定150℃，時間80 min）趕至消解管中僅剩約1 mL液體，用3%HNO定容至50 mL容量瓶中，上ICP-MS進行測定。

1.2.2 提取條件優(yōu)化

根據1.2.1測定的土壤有效態(tài)鎘含量與茶葉新梢鎘含量的相關系數選出最佳提取劑后進行提取條件優(yōu)化試驗。本試驗依次對提取劑濃度（0.5、1、2、4、6、7 mol·L），土液比（1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶15），提取時間（30、60、120、180、240 min）、振蕩頻率（140、180、220、260、300、340 r·min）4個因素進行條件優(yōu)化。采用單一變量法，每次僅改變一個提取條件，其他提取條件不變，以單一試驗選擇出的最佳提取條件作為下一個提取條件優(yōu)化試驗的參數依據，每個試驗3次重復。

1.3 數據處理與分析

數據處理和圖表制作采用Microsoft Excel 2016和Prism。使用IBM SPSSStatistics 25進行相關性分析，確定不同提取劑測定的有效態(tài)鎘與新梢鎘的相關性，確定Pearson相關系數。

2 結果與討論

2.1 土壤和新梢鎘含量評價

土壤樣品的理化性質如表1所示，土壤的pH值介于3.90~5.62，均為酸性土壤。按照有機質含量的高低選擇6個土壤樣品進行后續(xù)的提取方法優(yōu)化試驗，6個土壤樣品的理化性質見表2。

表1 供試土壤基本性質和新梢鎘含量Table 1 Basic properties of tested soil and Cd content in new shoots

表2 優(yōu)化試驗土壤樣品的基礎性狀Table 2 Basic properties of optimized soil samples

土壤總鎘含量介于0.15~0.94 mg·kg，平均含量為0.26 mg·kg，其中有11個樣品（0.49~0.94 mg·kg）超過《土壤環(huán)境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）中的土壤污染風險篩選值（0.3 mg·kg）。新梢中鎘含量介于0.02~0.35 mg·kg，平均值為0.05 mg·kg，所有樣品均遠低于《茶葉中鉻、鎘、汞、砷及氟化物限量》（NY 659—2003）中的限量標準（1 mg·kg）。如圖1所示，新梢鎘含量隨土壤總鎘含量的增加而增加，呈現出顯著的正相關關系（=0.808 9），該趨勢表明茶園土壤鎘具有一定的生物有效性。

圖1 土壤總鎘與新梢鎘的相關關系Figure 1 The correlation between total Cd in soil and Cd in new shoots

2.2 提取劑的選擇

2.2.1 不同提取劑的提取能力差異對比

土壤樣品相同情況下，提取劑類型不同，土壤有效態(tài)鎘的提取率也不同。本研究所用的5種提取劑類型分別為稀酸溶液（0.1 mol·LHCl）、絡合劑（0.005 mol·LDTPA）、中性鹽溶液（0.1 mol·LCaCl、1 mol·LMgCl）和緩沖溶液（1 mol·LNHOAc）。不同提取劑的提取率采用土壤有效態(tài)鎘含量占土壤總鎘含量的百分比來表征。由表3可知，HCl的提取率最大，NHOAc的提取率最小，HCl的平均提取率約為NHOAc的3倍。提取率從高到低依次為0.1 mol·LHCl>1 mol·LMgCl>0.005 mol·LDTPA>0.1 mol·LCaCl>1 mol·LNHOAc。稀HCl由于自身pH較低、Cl含量高、溶解能力強，易將土壤中碳酸鹽結合態(tài)等非有效態(tài)鎘提取出來，且HCl增加了酸性土壤中的H含量，使其對金屬陽離子的置換能力增強，因此提取率高，在某些文獻中甚至存在提取率超過土壤總鎘含量的情況。本研究中，0.1 mol·LHCl的有效態(tài)鎘提取率明顯高于其他4種提取劑。中性鹽溶液和緩沖溶液提取的土壤鎘形態(tài)一般為可交換態(tài)和水溶態(tài)兩種有效態(tài)，提取的鎘含量較少，提取率相較其他類型提取液較低。因此本研究中中性鹽溶液和緩沖溶液的提取率最低。此外，Ca作為土壤溶液中的主要陽離子，離子強度與典型的土壤溶液相似，從土壤基質中解吸重金屬的競爭能力強于一價陽離子NH。這解釋了本研究中中性鹽提取劑CaCl的提取率高于緩沖溶液NHOAc的原因。

表3 不同提取劑對土壤有效態(tài)鎘的提取效果對比Table 3 Comparison of extraction effects of different extractants on soil available cadmium

2.2.2 土壤有效態(tài)鎘和新梢鎘的相關性

圖1和圖2表明，土壤中總鎘和有效態(tài)鎘含量的增加均會引起新梢鎘含量的增加。如圖2所示，5種單一提取劑的土壤有效態(tài)鎘與新梢鎘含量的相關關系均達到極顯著相關，相關系數大小依次為1 mol·LNHOAc>0.1 mol·LCaCl>0.1 mol·LHCl>1 mol·LMgCl>0.005 mol·LDTPA，有效態(tài)鎘含量與新梢鎘含量的相關系數均大于土壤總鎘含量與新梢鎘含量的相關系數，且緩沖溶液和中性鹽溶液的相關系數優(yōu)于稀酸溶液和絡合劑。

圖2 土壤有效態(tài)鎘與新梢鎘含量的相關性分析Figure 2 Correlation analysis of available Cd in soil with Cd content in new shoots

雖然部分文獻中使用DTPA溶液對茶園土壤有效態(tài)鎘進行提取，且國家標準GB/T 23739—2009中規(guī)定了以DTPA作為土壤有效態(tài)鎘的測定試劑。但DTPA溶液提取有效態(tài)鎘的適用范圍是中性和堿性土壤，當應用于酸性土壤時可能會超過土壤溶液自身的緩沖能力，導致鐵錳氧化物和碳酸鹽吸附的重金屬被釋放，而該部分重金屬為非有效態(tài)，因此不能很好地反映酸性土壤中有效態(tài)鎘的含量狀況。HCl溶液屬于強代換劑且pH較低，在進行提取時易將有機結合態(tài)和碳酸鹽結合態(tài)兩種非有效態(tài)鎘提取出來，從而導致其提取的有效態(tài)鎘含量偏高，準確性差。MgCl溶液中的Mg和Cl分別具有較強的離子交換能力和較弱的絡合能力，用于有效態(tài)鎘提取時會造成

土壤pH的降低，從而使碳酸鹽和氧化錳部分溶解，導致可交換態(tài)鎘含量被高估。CaCl溶液對于土壤pH和土壤結構的影響較小，接近土壤自然狀態(tài)下對于重金屬的溶解能力，適用范圍廣。主要是由于中性鹽提取劑對土壤pH、氫氧化物和硅酸鹽的影響較小，并且對土壤顆粒吸附的金屬離子置換能力較強，可提取出土壤中真實的有效態(tài)鎘含量而非潛在的有效態(tài)鎘含量。NHOAc中的NH可以促進交換位離子的置換，形成的金屬絡合物穩(wěn)定性優(yōu)于Cl形成的金屬絡合物，有利于交換并減少已絡合金屬的再吸附和沉淀，且緩沖溶液相較于中性鹽溶液對pH的敏感性更低。因此NHOAc提取劑適用于茶園酸性土壤重金屬有效態(tài)鎘含量的提取研究。

根據5種提取劑的提取能力差異以及土壤有效態(tài)鎘含量與新梢鎘含量的相關系數，選擇NHOAc作為茶園土壤有效態(tài)鎘含量的最佳提取劑，并進行后續(xù)的提取條件優(yōu)化試驗。NHOAc作為酸性土壤有效態(tài)鎘的提取劑目前已有相關文獻報道。如賀靜等發(fā)現6種不同提取劑中NHOAc最適合作為酸性水稻田土壤中有效態(tài)鎘的提取劑，其提取量的相對標準偏差穩(wěn)定性強，有效態(tài)鎘含量與土壤總鎘含量和水稻籽粒中鎘含量呈極顯著相關。MENZIES等的研究表明，NHOAc可以較好地反映土壤鎘的生物有效性。尹君等的研究表明，以NHOAc溶液作為提取劑，土液比為1∶5、浸提60 min可以較好地表征土壤有效態(tài)鎘含量。因此，我們認為NHOAc提取有效態(tài)鎘適用于測定茶園土壤中鎘的生物有效性。

2.3 提取方法的優(yōu)化

2.3.1 提取劑濃度的選擇

提取劑濃度是影響有效態(tài)鎘提取率的重要因素之一。如圖3所示，隨著提取劑濃度的增加，有效態(tài)鎘提取率呈現明顯增長趨勢，但增長幅度隨濃度增加逐漸減小。提取濃度從0.5 mol·L增加到4 mol·L時，有效態(tài)鎘提取率增長幅度較大，平均相對偏差分別為94.81%、64.77%和29.36%（表4）。由此可知，當提取劑濃度低于4 mol·L時，提取率較低，平均相對偏差變動較大。當提取劑濃度在4~6 mol·L之間時，提取率增長幅度較0.5~4 mol·L之間有所降低，平均相對偏差僅為6.13%。6~7 mol·L時提取率出現輕微下降，說明此時有效態(tài)鎘的提取率幾乎不再發(fā)生變化，增加提取劑濃度對提取率影響較小反而還會增加提取成本。因此，選擇6 mol·L作為最佳提取濃度并進行后續(xù)試驗。

表4 不同提取劑濃度之間的平均相對偏差Table 4 Average relative deviation between different extraction concentrations

圖3 不同提取劑濃度的對比試驗Figure 3 Comparative experiment of different extractant concentrations

2.3.2 土液比的選擇

土液比是影響有效態(tài)鎘提取率的因素之一。如圖4所示，當土液比從1∶2.5減小到1∶5時，提取率增加幅度較小，平均相對偏差僅為3.84%（表5）；從1∶5減小到1∶10時，提取率增長幅度較大，平均相對偏差為12.75%。從1∶10減小到1∶15時，有效態(tài)鎘提取率出現輕微下降。因此，選擇1∶10作為最佳土液比并進行后續(xù)試驗。隨著土液比減小，提取劑用量增加，土壤中固相狀態(tài)的重金屬離子解吸變成液相狀態(tài)，溶液總體對于鎘離子的交換和絡合能力增強。但當土液比過小時，重金屬的質量分數在濾液中占比較低，不利于有效態(tài)鎘含量的測定。

表5 不同土液比之間的平均相對偏差Table 5 Average relative deviation between different soil liquid ratios

圖4 不同土液比的對比試驗Figure 4 Comparative experiment of different soil liquid ratios

2.3.3 提取時間的選擇

提取時間對于有效態(tài)鎘的提取率也具有重要影響。如圖5所示，提取時間從30 min增加到120 min時，提取率明顯增加，平均相對偏差分別為14.16%和16.38%（表6）。從120 min增加到240 min時提取率出現輕微波動，對比120 min和240 min時的提取率，平均相對偏差僅為-0.66%，原因可能是當提取時間為120 min時，土壤中的有效態(tài)鎘提取率已經或接近平衡狀態(tài)，此時再增加提取時間對提取率的影響較小。因此，在既保證測定準確性又提高工作效率的原則下選擇120 min作為最佳提取時間并進行后續(xù)試驗。

表6 不同提取時間之間的平均相對偏差Table 6 Average relative deviation between different extraction times

圖5 不同提取時間的對比試驗Figure 5 Comparative experiment of different extraction times

2.3.4 振蕩頻率的選擇

振蕩頻率是影響有效態(tài)鎘含量提取的因素之一。如圖6所示，振蕩頻率對有效態(tài)鎘的提取率影響較小。隨著振蕩頻率的增加，提取率的增加幅度較小。振蕩頻率從140 r·min增加到180 r·min，以及從220 r·min增加到300 r·min時，有效態(tài)鎘提取率出現輕微上升，平均相對偏差分別為4.25%、1.28%和3.24%（表7）。通過對比180 r·min與300 r·min有效態(tài)鎘提取率發(fā)現，平均相對偏差僅為-0.12%，變化較小。在保證有效態(tài)鎘含量測定結果準確的同時，選擇較小的振蕩頻率可以減小對搖床的損耗，所以選擇180 r·min作為有效態(tài)鎘的最佳振蕩頻率。

表7 不同振蕩頻率之間的平均相對偏差Table 7 Average relative deviation between different oscillation frequency

圖6 不同振蕩頻率的對比試驗Figure 6 Comparative experiment of different oscillation frequency

3 結論

（1）稀酸溶液和絡合劑對茶園土壤的提取能力強，中性鹽溶液和緩沖溶液對茶園土壤的提取能力弱。

（2）5種提取劑有效態(tài)鎘與新梢鎘含量的相關系數均大于土壤全鎘，且緩沖溶液和中性鹽溶液的相關系數優(yōu)于稀酸溶液和絡合劑。

（3）提取劑濃度和提取時間對有效態(tài)鎘提取率的影響較大，土液比和振蕩頻率對有效態(tài)鎘提取率的影響較小。

（4）茶園土壤以NHOAc作為提取劑，提取條件設定為提取濃度6 mol·L，土液比1∶10，提取時間120 min，振蕩頻率180 r·min時的有效態(tài)鎘提取效果最佳。