張彬彬 王震 劉保衛(wèi) 趙翠敏 郭金英 王春霞 鄭素月

摘要：為了給靈芝的生產(chǎn)、馴化及遺傳育種提供種質(zhì)資源，采用酯酶同工酶技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)（ISSR），結(jié)合出菇形態(tài)學(xué)分析了30個(gè)野生靈芝菌株的遺傳多樣性及農(nóng)藝性狀，構(gòu)建了聚類樹狀圖。酯酶同工酶分析結(jié)果表明，當(dāng)相似系數(shù)在0.709時(shí)，可以將30個(gè)野生靈芝菌株分為7類;ISSR分析結(jié)果表明，當(dāng)相似系數(shù)在0.728時(shí)，可以將30個(gè)菌株分為6類。出菇試驗(yàn)結(jié)果表明，30個(gè)菌株中有25個(gè)菌株能出菇，按形態(tài)特征，在歐氏距離為3.92時(shí)可將25個(gè)靈芝菌株分為五大類群，3種方法存在一致性。通過馴化栽培及農(nóng)藝性狀比較分析篩選出5個(gè)產(chǎn)量較高、品相較好的菌株。30個(gè)野生靈芝菌株具有較為豐富的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞：野生靈芝;酯酶同工酶;ISSR;農(nóng)藝性狀;多樣性

中圖分類號：S567.3+10.2 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0108-06

收稿日期：2021-05-06

基金項(xiàng)目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)（編號：HBCT2018050202）。

作者簡介：張彬彬（1988—），女，河北保定人，碩士研究生，主要從事食用菌種質(zhì)資源研究。E-mail：921940953@qq.com。

通信作者：鄭素月，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事食用菌種質(zhì)資源研究。E-mail：zhengsuyue@hebeu.edu.cn。

靈芝是我國傳統(tǒng)的中藥材，深受消費(fèi)者喜愛[1]?，F(xiàn)代研究表明，靈芝含有多種活性成分，如靈芝多糖、三萜、麥角甾醇、生物堿等[2]，在抗癌、防癌、抗糖尿病、提高免疫力和抗氧化等方面有極高的藥用價(jià)值[3-7]。靈芝屬于中高溫栽培種類，野生資源廣泛分布于東亞的暖溫帶和亞熱帶地區(qū)，在我國自然分布于河北、山東、河南、安徽、江蘇、浙江、江西、湖北、湖南、四川和云南等地[8]。長期以來，可供人工栽培和加工利用的靈芝品種比較單一，不能滿足多樣化的市場需求。因此，野生靈芝種質(zhì)資源的開發(fā)利用及其人工馴化研究具有重要意義。酯酶同工酶技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)（ISSR）檢測手段簡單、高效，廣泛應(yīng)用于食用菌的菌種選育、分類鑒定和種質(zhì)資源評價(jià)等研究[9-10]。靈芝屬的多數(shù)種類生長在闊葉樹的腐木上，河南省南召縣森林覆蓋率達(dá)66.49%，為靈芝提供了良好的生存環(huán)境。目前，筆者未見國內(nèi)外文獻(xiàn)對南召縣靈芝資源的開發(fā)利用和系統(tǒng)深入地研究。因此，本試驗(yàn)對河南省南召縣的野生靈芝進(jìn)行調(diào)查收集，通過生化、分子標(biāo)記技術(shù)和形態(tài)學(xué)鑒定3種方法對其親緣關(guān)系進(jìn)行初步的研究，通過人工馴化篩選優(yōu)良品種，以期為靈芝生產(chǎn)栽培和遺傳育種提供種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試野生靈芝菌株30個(gè)，均于2018年8月從河南省南召縣采集，由河北工程大學(xué)食用菌實(shí)驗(yàn)室分離和保藏，菌株編號見表1。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

（2）木屑培養(yǎng)基：木屑（煮汁） 200 g、豆粕（煮汁）30 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蛋白胨4 g、硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀3 g。

（3）原種培養(yǎng)基：小麥95.5%、石灰2%、石膏1%、磷酸二氫鉀1%、硫酸鎂0.5%。

（4）栽培種培養(yǎng)基：棉籽殼86%、麥麩12%、石灰1%、石膏1%。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2019年11月至2020年12月在河北工程大學(xué)食用菌實(shí)驗(yàn)室完成。酯酶同工酶分析采用垂直板聚丙烯酰胺活性凝膠電泳方法[11]。ISSR分子引物從28個(gè)常用引物[均由生工生物工程（上海）有限公司合成]中篩選合適的引物，對30個(gè)靈芝菌株進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體和電泳條件參照文獻(xiàn)[12-13]所述方法。形態(tài)學(xué)鑒定將活化好的菌種定量（5 mm2）接種到PDA綜合培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察菌絲形態(tài)，記錄菌絲生長性狀。出菇形態(tài)采用熟料栽培，常規(guī)出菇試驗(yàn)，觀察子實(shí)體形態(tài)， 記錄子實(shí)體形態(tài)特征，測量菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、生物轉(zhuǎn)化率等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用NTSYSpc分析軟件構(gòu)建各菌株的親緣關(guān)系樹狀圖。按易騰飛等的方法[14]計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)（H′），利用DPS 7.05軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶同工酶結(jié)果分析

如圖1所示，菌株的酶譜遷移率（Rf）主要介于0.11～0.81之間，30個(gè)菌株共擴(kuò)增出30條不同酶帶，多態(tài)性較高。對其電泳圖譜進(jìn)行相似性聚類分析，由圖2可知，30個(gè)靈芝菌株兩兩間相似系數(shù)的分布范圍是0.65～0.93，當(dāng)相似系數(shù)在0.709時(shí)，可以將30個(gè)野生靈芝菌株分為7類：第1類包括20個(gè)菌株，分別為YL-15、YL-8、YL-42、YL-12、YL-72、NZ-33、YL-53、YL-79、NZ-27-1、YL-37、YL-82、YL-77、YL-68、YL-83、YL-49、YL-51、YL-40、YL-31、YL-61;第2類為 YL-18;第三類為YL-90、YL-65;第4類為YL-57和YL-93;第5類為YL-88和YL-89;第6類為 NZ-28 和YL-76;第7類為YL-81和YL-14。

2.2 30個(gè)野生靈芝菌株ISSR分子鑒定結(jié)果與分析

通過對28個(gè)常用引物進(jìn)行ISSR分析，篩選出7個(gè)對靈芝菌株DNA擴(kuò)增重復(fù)性好、條帶清晰且有明顯多態(tài)性片段的引物，引物序列見表2。

用這7個(gè)引物對30個(gè)靈芝菌株的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好且具有一定特異性的DNA指紋圖譜，部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，7個(gè)引物共擴(kuò)增出85條清晰的多態(tài)性片段，DNA片段的大小介于300～8 000 bp之間，平均每個(gè)引物對野生靈芝菌株基因組擴(kuò)增的條帶為12.1條。將30個(gè)野生靈芝菌株的ISSR圖譜轉(zhuǎn)換為數(shù)字矩陣，用NTSYS軟件進(jìn)行聚類分析，得到供試菌株的親緣關(guān)系樹狀圖（圖4），30個(gè)靈芝菌株遺傳系數(shù)在0.62～0.89之間。相似系數(shù)在0.728時(shí)，30個(gè)菌株可以分為6類：第1類包括23個(gè)菌株，分別為YL-15、YL-57、YL-93、YL-42、YL-49、YL-12、YL-68、NZ-33、YL-79、YL-37、YL-90、YL-8、YL-40、YL-88、YL-89、YL-31、NZ-28、YL-76、YL-81、YL-77、YL-14、YL-82和YL-53;第2類為YL-83、YL-51 和YL-61;第3類為YL-18;第4類為YL-72;第5類為NZ-27-1;第6類為YL-65。說明這30個(gè)野生靈芝菌株具有豐富的遺傳多樣性。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

2.3.1 菌絲形態(tài)

不同靈芝菌株的菌絲形態(tài)差異較大，可將30個(gè)菌株的形態(tài)類型分為四大類，部分代表菌株形態(tài)如圖5所示，分類結(jié)果和描述見表3。

2.3.2 子實(shí)體農(nóng)藝性狀

對30個(gè)野生靈芝進(jìn)行馴化栽培，成功得到25個(gè)靈芝菌株的子實(shí)體，部分子實(shí)體形態(tài)見圖6。對其4個(gè)數(shù)量性狀和2個(gè)質(zhì)量性狀進(jìn)行記錄，結(jié)果見表4。多樣性分析結(jié)果（表5）表明，數(shù)量性狀遺傳多樣性指數(shù)以生物轉(zhuǎn)化率（A4）最高，為2.110 6，其次依次為菌蓋直徑（A1，1.981 5）、菌柄長度（A3，1.978 7）、菌蓋厚度（A2，1.779 5）;質(zhì)量性狀中顏色的遺傳多樣性指數(shù)（1.242 5）高于形狀的遺傳多樣性指數(shù)（0.833 4）。

如表5所示，不同菌株間變異系數(shù)存在很大差異，菌蓋厚度的變異系數(shù)最大，為40%，變幅為 0.50～2.17 cm;變異系數(shù)最小的是菌蓋直徑，為14.9%，變幅為3.53～6.45 cm。

2.3.3 農(nóng)藝性狀的聚類分析

本研究采用最長距離法對不同靈芝菌株的歐氏距離進(jìn)行聚類分析，繪制聚類樹狀圖。如圖7所示，在歐氏距離為3.92時(shí)可將25個(gè)靈芝菌株分為五大類群：第1類包括11個(gè)菌株，這一類多為紫褐色腎形或扇形靈芝，產(chǎn)量較低，生物轉(zhuǎn)化率僅為2.22%～5.03%;第2類有4個(gè)菌株，這一類多為黃褐色扇形靈芝;第3類有6個(gè)菌株，包括紅褐色扇形靈芝，產(chǎn)量最高高，生物轉(zhuǎn)化率最高可到7.35%;第4類包括YL-42、YL-40 和YL-81等3個(gè)菌株，為黃褐色靈芝，產(chǎn)量較高;第5類為1株黑褐色的鹿角靈芝。

3 結(jié)果與討論

本研究以南召縣30個(gè)野生靈芝菌株為供試材料，從生化、ISSR分子標(biāo)記和形態(tài)學(xué)3個(gè)方面研究了其親緣關(guān)系。菌株的酯酶同工酶譜Rf值主要介于0.11～0.81之間，30個(gè)靈芝菌株兩兩間相似系數(shù)的分布范圍是0.65～0.93，當(dāng)相似系數(shù)在0.709時(shí)，可以將30個(gè)野生靈芝菌株分為7類。ISSR篩選出的7個(gè)引物共擴(kuò)增出85條清晰的多態(tài)性片段，DNA片段的大小介于300～8 000 bp之間，30個(gè)靈芝菌株遺傳相似性在0.62～0.89之間，相似系數(shù)在0.728時(shí)，30個(gè)菌株可以分為6類。通過6個(gè)主要農(nóng)藝性狀對25個(gè)馴化成功的靈芝菌株進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示，當(dāng)歐氏距離為3.92時(shí)，可將25個(gè)靈芝菌株分為五大類群。本研究中，酯酶聚類（圖2）、ISSR聚類（圖4）和實(shí)體形態(tài)分類（圖7）等3種方法都把YL-15、YL-8、YL-12、YL-68、YL-49、YL-53和YL-77這7個(gè)菌株聚為一類，同時(shí)也把鹿角靈芝YL-18分為一類。為增加結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以聯(lián)合使用3種分類方法對野生靈芝菌株親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定。通過馴化栽培及農(nóng)藝性狀比較分析，篩選出5個(gè)產(chǎn)量較高、品相較好的菌株NZ-28、YL-31、YL-89、YL-51和YL-18。

本研究有5個(gè)菌株未馴化成功，其中NZ-33有原基產(chǎn)生，但是后期未分化成子實(shí)體;其余4個(gè)菌株YL-65、YL-90、NZ-27-1和YL-79未出現(xiàn)原基。除NZ-27-1外，其余4個(gè)菌株菌絲生長性狀良好，未出菇原因有待進(jìn)一步研究。本研究為河南省南召縣野生靈芝資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為建立野生靈芝種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫奠定了基礎(chǔ)。

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