匡浩銘 沈琳玲 曹閑雅 匡建軍 柳卓 毛果 蔡萍 戎寬 楊惠

〔摘要〕 目的 探討金剛丸對骨質疏松大鼠骨代謝和血清骨鈣素的影響。方法 將60只SPF級大鼠隨機分為正常對照組、模型組及高、中、低劑量組和己烯雌酚組，每組10只。高、中、低劑量金剛丸組每天分別以3.24、1.62、0.81 g/kg的劑量灌胃1次;己烯雌酚組大鼠每天給予1.0 mg/kg灌胃1次;正常對照組及模型組給予等體積的生理鹽水。給藥6周后取股骨，測量股骨最大載荷和斷裂載荷;HE染色法觀察骨小梁結構;ELISA法測定股骨組織中血清骨源性堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase， BALP）、雌二醇（estradiol E2）和血清骨鈣素（bone gla-containing protein， BGP）、骨保護蛋白（osteoprotegerin， OPG）、核因子-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB， RANK）及核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand， RANKL）的水平;采用光子骨密度（bone mineral density， BMD）測試儀測定BMD;采用Western blot法檢測瞬時受體電位陽離子通道亞族V成員6 （transient receptor potential cation channel subfamily V member 6， TRPV6）蛋白相對表達量。結果 模型組骨小梁形態(tài)模糊、廣泛斷裂，骨髓腔增寬，骨細胞排列散亂;高、中、低劑量組可見骨小梁形態(tài)較模型組改善、結構較為緊密，骨髓腔減小，骨外膜排列改善。與正常對照組相比，模型組體質量、BALP、BGP、RANK、RANKL水平明顯升高，E2、BMD、最大負荷、斷裂負荷、TRPV6、OPG水平均明顯降低（P<0.05）。與模型組相比，高、中、低劑量組體質量、BALP、BGP、RANK、RANKL水平降低，E2、BMD、最大負荷、斷裂負荷、OPG、TRPV6水平顯著升高（P<0.05）。結論 金剛丸通過提高絕經后骨質疏松大鼠雌激素水平，調節(jié)骨代謝，提高生物力學性能和BMD，起到抗骨質疏松的療效和骨保護作用，其機制可能是通過影響TRPV6表達上調OPG表達，下調RANKL表達。

〔關鍵詞〕 骨質疏松;金剛丸;血清鈣;骨代謝;瞬時受體電位陽離子通道亞族V成員6;骨保護素

〔中圖分類號〕285.5? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.010

Effects of Jingang Pill on bone metabolism and serum osteocalcin in osteoporosis rats

KUANG Haoming1， SHEN Linling1， CAO Xianya1， KUANG Jianjun2， LIU Zhuo3， MAO Guo3， CAI Ping2，

RONG Kuan2*， YANG Hui1*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 3. Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital，

Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Jingang Pill on bone metabolism and serum osteocalcin in osteoporosis rats. Methods 60 SPF rats were randomly divided into control group， model group， high， medium and low dose Jingang Pill groups and diethylstilbestrol group， with 10 rats in each group. The high， medium and low dose Jingang Pill groups were given intragastric administration of 3.24， 1.62， 0.81 g/kg per day respectively; the rats in the diethylstilbestrol group were given diethylstilbestrol 1.0 mg/kg every day; rats in the control group and model group were given equal volume of normal saline. After 6 weeks of administration， the femur was taken to detect the maximum load and fracture load; bone trabecular structure was observed by HE staining; the levels of serum bone alkaline phosphatase （BALP）， estradiol （E2） and serum bone gla-containing protein （BGP）， osteoprotegerin （OPG）， receptor activator of NF-κB （RANK） and receptor activator of NF-κB ligand （RANKL） were measured by ELISA; bone mineral density

（BMD） was measured by BMD tester; the relative expression of transient receptor potential cation channel subfamily V member 6 （TRPV6） protein was detected by Western blot. Results In the model group， bone trabecular morphology was blurred and extensively fractured， bone marrow cavity was widened， and bone cells were scattered. Compared with the model group， bone trabecular morphology and structure were improved in high， medium and low dose groups， bone marrow cavity was reduced， and bone membrane arrangement was improved. Compared with the control group， the levels of body weight， BALP， BGP， RANK and RANKL in model group were significantly increased， while the levels of E2， BMD， maximum load， breaking load， OPG and TRPV6 were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the levels of body weight， BALP， BGP， RANK and RANKL in medium and high dose groups were significantly increased， while the levels of E2， BMD， maximum load， breaking load， OPG and TRPV6 were significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Jingang Pill has the effect of anti-osteoporosis and bone protection by increasing the estrogen level， regulating bone metabolism， improving biomechanical properties and BMD in postmenopausal osteoporosis rats， and mechanism may be through affecting the expression of TRPV6， so as to up-regulate the expression of bone protective protein and down-regulate the expression of RANKL.

〔Keywords〕 osteoporosis; Jingang Pill; serum calcium; bone metabolism; transient receptor potential cation channel subfamily V member 6; osteoprotegerin

骨質疏松癥（osteoporosis， OP）是一種代謝失衡導致的骨量減少、骨組織結構破壞、易發(fā)骨折骨的代謝性疾病[1]。絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis， PMOP）是導致老年婦女骨折的重要原因，增加了患者病殘率和死亡率[2-4]。PMOP發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響婦女的心理和生活質量[5]。因此，各種途徑尋找行之有效的OP防治方法是目前相關學科研究者關注的焦點。研究表明，絕經后婦女雌激素缺乏導致骨吸收異常是OP發(fā)生的主要原因之一，雌激素水平降低影響成骨細胞和破骨細胞的分化，抑制了骨代謝，使得OP的發(fā)生[6]。臨床上常用雌激素和孕酮治療，但是長期用于治療OP會導致顯著的不良反應。和西藥相比，中醫(yī)藥防治OP具有很多優(yōu)勢，多靶向且對人體不良反應相對較少，適合臨床長期應用。通過辨證施治，中藥可作用于多個病理環(huán)節(jié)，能夠改善患者多種伴隨的癥狀，從而提高患者生存質量，減少患者經濟負擔。金剛丸最早記載于《素問·病機氣宜保命集》，是金朝著名醫(yī)家劉完素治療腎虛型骨萎的經典名方，在古代醫(yī)案中治療骨萎多有良效。而課題組對金剛丸前期的研究表明，其治療OP臨床療效確切，金剛丸能夠通過調節(jié)整合素β1、αVβ3表達水平，降低骨代謝指標，維持骨丟失與骨形成之間的代謝平衡，從而具有一定的抗OP的作用[7-8]。本研究應用去卵巢大鼠模型以及成熟的指標探索瞬時受體電位陽離子通道亞族V成員6（transient receptor potential cation channel subfamily V member 6， TRPV6）、骨保護蛋白（osteoprotegerin， OPG）、核因子-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB， RANK）及核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand， RANKL）與OP的關系，并初步研究金剛丸抗OP代謝的作用機制。

1 材料與方法

1.1? 動物及分組

由湖南省中醫(yī)藥研究院動物實驗中心代為采購的60只SPF級、10月齡、雌性大鼠，體質量（220±40） g，動物許可證號：43602500000352。動物均喂養(yǎng)在SPF級動物房中，保證通風和光線充足，相對濕度50%左右，并在室溫下適應1周，使用標準飼料和飲用水。適應性喂養(yǎng)，將60只SPF級大鼠按照數(shù)字表法隨機分為正常對照組、模型組、己烯雌酚組及高、中、低劑量組，每組10只。

1.2? 實驗藥物

金剛丸制作：肉蓯蓉（酒浸）、菟絲子（酒浸）、杜仲（鹽炒）、萆薢，各120 g等分為細末，與酒煮豬腰子蜜制成丸。金剛丸（陜西天洋制藥有限公司，規(guī)格：3.5 g/丸，國藥準字：Z61020726，批號：202004）。己烯雌酚片（天津利盛制藥有限公司，規(guī)格：0.5 mg/片，國藥準字：H12020154，批號：219A ）。

1.3? 主要試劑

上樣緩沖液6X（批號：CW0610）、mRNA逆轉錄試劑盒（批號：CW2569）、miRNA逆轉錄試劑盒（批號：CW2141）均購自中國北京康為世紀有限公司;EDTA（中國大連美倫公司，批號：MB2514）;核酸染料（中國北京普利萊公司，批號：PB11141）;OPG、RANK、RANKL、TRPV6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：ml133271、ml601105、ml003065、

ml347206）;TRPV6抗體（批號：ab740201）、OPG抗體（批號：ab73400）、RANKL抗體（批號：ab45039）均購自英國abcam公司;青霉素（華北制藥股份有限公司，批號：L201008）。

1.4? 主要儀器

臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R）;多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：MB-530）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：DHP-500）;搖床（中國江蘇其林貝爾公司，型號：TS-1）;熒光定量RCP儀（美國Thermo公司，型號：PIKOREAL96）熒光PCR板（美國Thermo公司，型號：SPL0960）。

1.5&nbsp; 模型建立

參照文獻研究[8]，將大鼠固定在無菌手術臺上使其平臥夾緊，腹腔注射（10%，0.3 mg/kg）水合氯醛麻醉。常規(guī)消毒后，其腹部經切口切開，用手術線結扎卵巢下輸卵管，切除雙側卵巢，切口部位消毒縫合。模型組、己烯雌酚組及高、中、低劑量組均摘取雙側卵巢。手術后，術后連續(xù)3 d肌注青霉素以預防感染，5萬單位/只，1次/d。

1.6? 藥物處理及取材

高、中、低劑量組每天分別給予3.24、1.62、0.81 g/kg的金剛丸水溶液灌胃;己烯雌酚組每天給予1.0 mg/kg的己烯雌酚水溶液灌胃;正常對照組和模型組均以等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥6周后，處死大鼠，檢測指標。詳細記錄各組大鼠的體力活動與體質量。處死前，取各組大鼠腹主動脈血5 mL，分離血清，置-80 ℃冰箱保存，待用。

1.7? 指標檢測

1.7.1? 體質量? 給藥6周后，各組大鼠均禁食12 h，不禁水，于次日上午稱體質量。

1.7.2? HE染色? 石蠟切片制備：大鼠右側脛骨以4%多聚甲醛固定后，用10% EDTA溶液脫鈣，每3天換液1次，室溫下連續(xù)脫鈣6周，以注射液針頭剌無阻力感為脫鈣完成標準。取脛骨上段1 cm左右長度，進行梯度乙醇脫水（70%、80%、90%、95%、100%、100%、100%，每個溶液浸泡15 min）;用二甲苯透明切片（2次，共40 min）;取冠狀面向外，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片厚度為5 μm，42 ℃水浴展片后，裱片于載玻片上，60 ℃烤片5 h備用。

染色：石蠟切片用二甲苯脫蠟（梯度酒精下行至水）;在BOUIN氏固定液中再固定1 h，流水沖洗至切片無色;HE染液浸染10 min，用蒸餾水沖洗切片，至水澄清;用1%磷鉬酸分色5～10 min，至骨小梁褪色即可;0.5%固綠染液浸染5 min，梯度乙醇脫水（70%、80%、90%、95%、100%、100%、100%，每個濃度溶液浸泡5 min）后，用二甲苯透明化處理，最后使用中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.7.3? BMD檢測? 從每個骨標本中取出右股軟組織，用雙能雙光子骨密度（bone mineral density， BMD）儀測量BMD。采用AG-IX生物力學通用試驗機測量出最大載荷和斷裂載荷。大鼠的左股骨均置于試驗機上，跨度為20 mm，加載速度保持在10 mm/min，下壓探頭至脛骨中段，直至其發(fā)生斷裂，記錄載荷變形曲線，并分析數(shù)據(jù)。

1.7.4? ELISA法? 采用ELISA法檢測血清BALP、E2、BGP、OPG、RANK、RANKL水平。取血清標本，用全自動生化儀檢測。標準品的加樣、加酶、配液、洗滌、顯色測定：以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15 min以內進行。

1.7.5? Western blot法? 蛋白提?。河帽A冷PBS洗組織，加入300 μL RIPA裂解液于生物樣品均質儀中;裂解10 min;4 ℃，12 000 r/min離心15 min（離心半徑8 cm）;將離心后的上清液進行制膠、凝膠電泳，轉膜，放入1×PBST中洗1 過夜，次日室溫放置30 min。一抗（1∶1000）二抗（1∶3000）孵育結束，1×PBST洗3次，每次10 min。ECL顯色曝光：使用ECL化學發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，在成像系統(tǒng)儀中拍照。

1.8? 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計分析使用SPSS 21.0數(shù)據(jù)包，實驗中所有結果以“x±s”表示，數(shù)據(jù)進行正態(tài)性、方差齊性檢測，符合正態(tài)分布與方差齊性則用采用單因素方差分析，不符合則用Dunnett-t檢驗，均以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 各組大鼠體質量比較

與正常對照組比較，模型組體質量明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，高、中、低劑量組和己烯雌酚組體質量明顯降低（P<0.05）;與己烯雌酚組比較，高、中、低劑量組體質量均降低（P<0.05）;且高、中、低劑量組體質量降低呈劑量依賴性（P<0.05）。見表1。

2.2? HE染色結果顯示

正常對照組骨小梁形態(tài)完整、無明顯斷裂，骨髓腔正常，骨細胞排列均勻;模型組骨小梁形態(tài)模糊、廣泛斷裂，骨髓腔增寬，骨細胞排列散亂;己烯雌酚組及高、中、低劑量組可見骨小梁形態(tài)較模型組改善、結構較為緊密，骨髓腔減小，骨外膜排列接近正常對照組。見圖1。

2.3? 各組大鼠BMD水平比較

與正常對照組比較，模型組體BMD水平明顯下降（P<0.05）;與模型組比較，高、中、低劑量組和己烯雌酚組BMD水平升高（P<0.05）;與己烯雌酚組比較，高劑量組BMD水平升高，中、低劑量組BMD水平降低（P<0.05）;高、中、低劑量組BMD水平降低呈劑量依賴性（P<0.05）。見表2。

2.4? 各組大鼠最大負荷和斷裂負荷比較

與正常對照組比較，模型組最大負荷及斷裂負荷降低（P<0.05）;與模型組比較，高、中、低劑量組和己烯雌酚組最大負荷及斷裂負荷升高（P<0.05）;與己烯雌酚組比較，高、中、低劑量組最大負荷及斷裂負荷降低（P<0.05）;高、中、低劑量組最大負荷和斷裂負荷降低呈劑量依賴性（P<0.05）。見表3。

2.5? 各組大鼠BALP、E2和BGP水平比較

與正常對照組比較，模型組BALP和BGP水平升高，E2水平明顯降低（P<0.05）;與模型組相比，高、中、低劑量組和己烯雌酚組BALP和BGP水平降低，E2水平升高（P<0.05）;與己烯雌酚組相比較，高劑量組BALP、BGP降低，E2水平升高;中、低劑量組BALP、BGP升高，E2水平降低（P<0.05）;高、中、低劑量組BALP、E2和BGP水平表達呈劑量依賴性（P<0.05）。見表4。

2.6? 各組大鼠血清OPG、RANK、RANKL相對表達水平比較

與正常對照組比較，模型組OPG降低，RANK、RANKL含量升高（P<0.05）;與模型組比較，高、中、低劑量組和己烯雌酚組OPG升高，RANK、RANKL降低（P<0.05）;與己烯雌酚組比較，高劑量組OPG升高，RANK、RANKL降低，中、低劑量組OPG、RANK、RANKL升高（P<0.05）;高、中、低劑量組OPG、RANK、RANKL水平升高呈劑量依賴性（P<0.05）。見表5。

2.7? 各組大鼠TRPV6相對表達水平比較

與正常對照組比較，模型組TRPV6明顯下降（P<0.05）;與模型組比較，高、中、低劑量組和己烯雌酚組TRPV6升高（P<0.05）;與己烯雌酚組比較，高劑量組TRPV6升高，中、低劑量組降低（P<0.05）;高、中、低劑量組TRPV6相對表達水平降低呈劑量依賴性（P<0.05）。見表6、圖2。

3 討論

隨著我國進入老年化社會，OP發(fā)病率逐年上升，且以絕經后婦女最為多見，是我國老年女性最為常見的全身骨代謝性疾病[9]。女性絕經后由于雌激素水平降低、成骨細胞與破骨細胞偶聯(lián)失衡而出現(xiàn)的以腰背痛、短縮畸形、脊柱關節(jié)退變甚至脆性骨折為主要表現(xiàn)的一種骨代謝紊亂的疾病，對我國中老年婦女的身體健康及生活質量產生了極大的威脅，因此，充分認識PMOP并了解其發(fā)病機制，在此基礎上進行對癥治療，研究并發(fā)現(xiàn)抗OP效驗方具有重要的社會及科研價值。

骨生物力學反應的是骨質微結構的變化以及骨量的綜合反應，是多種微量元素代謝的正常與紊亂的表現(xiàn)，骨組織處在吸收和形成平衡狀態(tài)，平衡被打破時骨生物力學就會發(fā)生改變。骨代謝異常導致骨量丟失，正常結構布局的合理性遭到了破壞，骨干強度降低，更加容易發(fā)生骨折，測量的載荷值反映了骨強度，在一定程度上反映了骨代謝的變化。BMD是骨質量的一個重要標志，與骨骼強度和內環(huán)境穩(wěn)定密切相關，是反映OP程度，預測骨折危險性的重要依據(jù)[10]。BALP與成骨細胞代謝活性有關，在骨組織重建過程時，BALP的活性會相應增高[11]。有報道稱，血漿骨特異性堿性磷酸酶可作為成骨細胞活性指標，并認為骨特異性堿性磷酸酶作為骨代謝指標比堿性磷酸酶更靈敏[12]。TRPV6是瞬時性受體電位通道超家族主要成員，高選擇性鈣離子通道主要存在于人體中具有鈣離子跨膜轉運功能的器官組織[13]，而E2是雌激素之一，也是卵巢分泌的主要性激素之一，E2、BALP、BGP等多種因素對鈣離子代謝產生影響有可能是通過TRPV6通路影響到骨代謝過程中的骨細胞分化-形成-吸收-破壞等環(huán)節(jié)，然后通過鈣離子通道的調控直接影響骨的代謝[14-16]。有研究表明，在人成骨細胞中存在TRPV6 mRNA，敲除鼠的TRPV6會導致股骨BMD下降，發(fā)生OP[17-18]。因此，通過調節(jié)TRPV6鈣離子通道的狀態(tài)，進而改變成骨細胞、破骨細胞的增殖分化行為，最終改善機體骨代謝狀況，可能是臨床治療OP等骨代謝疾病的新探索[19]。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在骨代謝過程中起著至關重要的作用，其可以促進破骨細胞的分化及骨吸收活性[20]。成骨細胞及骨髓基質細胞分泌表達OPG可與RANKL競爭性結合，從而阻斷RANKL與RANK之間的相互作用[21]。OPG作為一種可溶性的分泌型糖蛋白起到抑制骨吸收的作用，而RANK作為一種跨膜蛋白，誘導破骨細胞分化增殖，與RANKL結合后成為一種強促破骨細胞分化成熟劑，推動體內骨吸收[22-23]。

在本次研究中，與正常對照組相比，模型大鼠的BALP、BGP、RANK、RANKL水平明顯升高，E2、BMD、OPG、TRPV6均明顯降低。與模型組相比，高、中、低劑量組BALP、BGP、RANK、RANKL、最大負荷、斷裂負荷水平降低，E2、BMD、OPG、TRPV6、最大負荷、斷裂負荷水平顯著升高。高、中、低劑量組和己烯雌酚組大鼠體質量增加明顯，模型組骨小梁形態(tài)模糊、廣泛斷裂，骨髓腔增寬，骨細胞排列散亂;高、中、低劑量組和己烯雌酚組均可見骨小梁形態(tài)較模型組改善、結構較為緊密，骨髓腔減小，骨外膜排列改善。

綜上，本研究通過對成熟可靠的指標研究確認金剛丸對OP骨代謝的作用。結果表明，金剛丸可能通過提高PMOP模型大鼠雌激素水平，調節(jié)骨代謝，提高生物力學性能和BMD，達到抗OP的療效和骨保護作用，其機制可能是通過影響TRPV6表達上調OPG表達，下調RANKL表達。但具體的分子機制還未完全探索清楚，特別是TRPV6是否在骨代謝中起到關鍵作用，需要進一步的深入研究。

參考文獻

[1] 中華中醫(yī)藥學會.絕經后骨質疏松癥（骨痿）中醫(yī)藥診療指南（2019年版）[J].中醫(yī)正骨，2020，32（2）：1-13.

[2] 張昌攀，陳? 凱，陳海鵬.中西醫(yī)藥物治療原發(fā)性骨質疏松癥研究進展[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2018，30（1）：171-175.

[3] 陳? 沙，王桂云，劉平安，等.雌性大鼠手術去勢骨質疏松癥模型建立及評價[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2020，40（11）：1315-1319.

[4] MIGNOT M A， TAISNE N， LEGROUX I， et al. Bisphosphonate drug holidays in postmenopausal osteoporosis：effect on clinical fracture risk[J]. Osteoporosis International， 2017， 28（12）： 3431-3438.

[5] MIYAUCHI A， DINAVAHI R V， CRITTENDEN D B， et al.. Increased bone mineral density for 1 year of romosozumab， vs placebo， followed by 2 years of denosumab in the Japanesesubgroup of the pivotal FRAME trial andextension[J]. Arch Osteoporos， 2019， 14（1）： 59.

[6] 智? 信，陳? 曉，蘇佳燦.絕經后骨質疏松癥發(fā)病機制研究進展[J].中國骨質疏松雜志，2018，24（11）：1510-1513，1534.

[7] 匡建軍，張信誠，武? 昌，等.超微金剛治療絕經后骨質疏松癥60例[J].中醫(yī)傷科，2011，27（4）：40-42.

[8] 戎? 寬，胡余飛，蔡? 萍，等.超微金剛對去勢大鼠骨密度的影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥導報，2014，20（5）：91-93.

[9] WEAVER C M， GORDON C M， JANZ K F， et al. The National Osteoporosis Foundation's position statement on peak bone mass

development and lifestyle factors： a systematic review and implementation recommendations[J]. Osteoporos International 2016， 27（4）： 1281-1386.

[10] 張紫銘.虎潛丸對去卵巢大鼠骨質疏松模型骨密度及轉化生長因子-β2表達的影響[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2014.

[11] 岳海振，蔡? 軍，馬新強，等.葛根素對絕經后骨質疏松大鼠骨代謝、骨密度及骨生物力學的影響[J].中國骨質疏松雜志，2021，27（1）：77-78.

[12] 高衛(wèi)輝，向艷華，劉? 云，等.中藥杜仲-牛膝配伍對去卵巢大鼠骨質疏松癥的干預實驗研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2016，36（6）：43-46.

[13] HOENDEROP J G， NILIUS B， BINDELS R J. Molecular mechanism

of active Ca2+ reabsorption in the distal nephron[J]. Annual Review of Physiology， 2002， 64： 529-549.

[14] 柳辰玥.基于AGEs/RAGE/Nox4/NF-κB和TRPV6/CaBP-28k/VDR通路探討桑葉對DOP大鼠作用機制[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2018.

[15] 張國民.壯骨止痛方醇提A部位對去勢雌鼠骨質疏松癥雌激素相關因子的調節(jié)作用[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2011.

[16] 連? 娟，劉佳賢，暴雪麗，等.黃瓜籽復合物對去勢大鼠骨質疏松癥的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2021，41（4）：523-527.

[17] 馬? 駿.鈣離子通道蛋白TRPV6對小鼠骨代謝和破骨細胞形成的調控作用及其機制研究[D].上海：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學，2019.

[18] 李紹爍，趙京濤，何昌強，等.山茱萸總甙干預骨質疏松模型大鼠骨代謝：TRPV6、TRPV5通路的變化[J].中國組織工程研究，2019，23（11）：1749-1754.

[19] 王延濤，楊智華，陳? 怡，等.肉蓯蓉治療骨質疏松作用機制的網絡藥理學研究[J].中國藥房，2019，30（5）：645-651.

[20] 黃? 剛，羅海恩，蘇新平，等.止痛健骨方對原發(fā)性骨質疏松癥患者骨密度及OPG、RANKL的影響及療效觀察[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2020，40（12）：1544-1547.

[21] 向? 益，鄭? 烽，王? 顯.基于OPG/RANKL/RANK通路探討單味中藥治療骨質疏松的研究進展[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2019，27（2）：86-88.

[22] VAN DAM P A， VERHOEVEN Y， TRINH X B， et al. RANK/RANKL signaling inhibition may improve the effectiveness of checkpoint blockade in cancer treatment[J]. Critical Reviews in Oncology/Hematology， 2019， 133： 85-91.

[23] 王夢蝶，吳? 虹，王榮慧，等.RANKL介導的誘導破骨細胞分化的相關經典信號通路研究進展[J].中國藥理學通報，2020，36（7）：898-902.