馮慧琳，付兵，任天寶*，杜君，徐辰生，曾強(qiáng)，徐茜*，劉國(guó)順

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/河南省生物炭研究工程技術(shù)中心，鄭州 450002；2.生物炭技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.福建省煙草公司南平市公司，福建 南平 353000；4.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，鄭州 450002）

近年來(lái)土壤健康問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視，不健康的土壤會(huì)導(dǎo)致土傳病害的發(fā)生，對(duì)植物造成危害。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)土壤健康依賴于土壤微生物的功能多樣性[1-2]，土壤微生物能夠調(diào)控土壤微生態(tài)平衡，有助于維持土壤健康[3-4]。植物根系與土壤微生物接觸的部分存在一個(gè)微域[5]，在這個(gè)微域環(huán)境中，土壤微生物能夠利用植物的殘?bào)w分解物及根系分泌物產(chǎn)生碳、氮以保證自身正常的生命活動(dòng)[6-7]，同時(shí)也能夠分解土壤中的有機(jī)物質(zhì)釋放出養(yǎng)分來(lái)供給植物，保證植物的健康生長(zhǎng)。微生物與植物互惠共存的關(guān)系有利于土壤微生態(tài)系統(tǒng)的平衡，從而促進(jìn)土壤健康[8-9]。

微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能及其與宿主相關(guān)依賴和相互制約形成的復(fù)雜系統(tǒng)稱為微生態(tài)系統(tǒng)，微生態(tài)平衡是一個(gè)生命體健康的基本前提[10]。丁偉等[11]指出植物病害的發(fā)生可以理解為植物的微生態(tài)失去了平衡。因此煙草患上青枯病即病原菌突破了各種屏障，進(jìn)入煙株的根際部位，在煙株中大量繁殖，打破了煙株根際的微生態(tài)平衡，危害煙株的生長(zhǎng)發(fā)育，這給煙農(nóng)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)煙草來(lái)說(shuō)是一種毀滅性的病害[12-13]。BONILLA 等[14]的研究表明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與植物抗病性有關(guān)，微生物群落結(jié)構(gòu)好，抗病性強(qiáng)。施河麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)與健康煙株根際土壤相比，青枯病煙株的土壤養(yǎng)分含量較低，土壤pH值較高，土壤微生物多樣性、有益菌的豐度也相對(duì)較低。張明宇等[16]的研究表明有機(jī)肥能夠緩解青枯病的病害程度，其主要通過(guò)提升土壤微生物多樣性、改善土壤微生態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)。林書震[17]的研究發(fā)現(xiàn)煙草病害的發(fā)生會(huì)帶來(lái)微生物多樣性的下降和豐富度的減少。蔡燕飛等[18]的研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥的施用有利于土壤有益菌的繁殖，減少植物病害。韋中等[19]的研究發(fā)現(xiàn)菌株RC-14 能通過(guò)菜粕有機(jī)肥中的某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生大量拮抗物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠抑制番茄根際青枯菌的生長(zhǎng)，降低青枯病發(fā)病率。

近年來(lái)，大量的研究表明通過(guò)改變施肥方法、調(diào)控土壤微生態(tài)平衡可抑制病原菌的繁殖，控制土傳病害的發(fā)生[20-21]。研究表明生物炭能夠調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境[22-24]?；诖耍狙芯勘容^了不同施肥條件下青枯病煙株與健康煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，明確生物炭對(duì)根際土壤微生態(tài)的調(diào)控機(jī)制，為利用生物炭調(diào)控根際土壤微生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)土壤健康、防控?zé)煵萸嗫莶〉於ɑA(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019 年2 月—10 月在福建省邵武市沿山鎮(zhèn)進(jìn)行，供試的煙草品種為K326，供試土壤類型為水稻土，其基本理化性質(zhì)：有機(jī)質(zhì)含量為18.63 g·kg-1，速效鉀含量為122.55 mg·kg-1，有效磷含量為21.24 mg·kg-1，全氮含量為0.18 g·kg-1，pH 值為6.29。本試驗(yàn)所使用的生物炭由河南省生物炭工程技術(shù)研究中心提供，該生物炭以花生殼為原料，經(jīng)380～400 ℃低氧條件下連續(xù)炭化制成，生物炭的基本理化性質(zhì)如表1所示。

表1 供試生物炭理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical property of the biochar

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置2 個(gè)處理：CK（常規(guī)施肥）和T1（施用1.2 t·hm-2生物炭+常規(guī)施肥），當(dāng)烤煙進(jìn)入成熟期后，煙田逐漸出現(xiàn)青枯病，因此開(kāi)始進(jìn)行青枯病煙株根際土壤微生物多樣性研究。青枯病煙株根際土壤微生物多樣性研究設(shè)4 個(gè)處理：ZCTR（常規(guī)施肥健康煙株的根際土壤）、QKTR（常規(guī)施肥青枯病煙株的根際土壤）、ZCSW（施加1.2 t·hm-2生物炭的健康煙株的根際土壤）、QKSW（施加1.2 t·hm-2生物炭的青枯病煙株的根際土壤），ZCTR、QKTR 兩個(gè)處理于CK 小區(qū)取樣，ZCSW、QKSW兩個(gè)處理于T1小區(qū)取樣。

CK、T1 處理均常規(guī)施肥：煙草專用肥用量為525 kg·hm-2（N 12.5%、P2O58%、K2O 22.5%），芝麻餅肥用量為675 kg·hm-2（N 5.8%、K2O 1.3%），硫酸鉀用量為301 kg·hm-2，氫氧化鎂用量為185.5 kg·hm-2，鈣鎂磷肥用量為457 kg·hm-2，硝酸鉀用量為347 kg·hm-2，氮磷鉀比例為1∶0.78∶2.87。

1.3 土壤微生物取樣及檢測(cè)

在煙草移栽75 d 時(shí)，用鏟子將煙株周圍10 cm 的土壤挖至30 cm 的深度，切割土壤中煙株的任何側(cè)根，挖出煙株整個(gè)根部。將根球放入盆中，搖動(dòng)根部，用鏟子從根部去除土壤，將采集盆中無(wú)碎塊的土壤5～10 g 除去雜質(zhì)，混勻過(guò)2 mm 篩，保存在10 mL 無(wú)菌離心管中，放入干冰中送至上海歐易生物科技有限公司進(jìn)行土壤微生物多樣性檢測(cè)。檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[25]，土壤DNA 提取和PCR 擴(kuò)增均采用試劑盒，細(xì)菌16S rRNA用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對(duì)V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min（PCR儀：ABI GeneAmp?9700 型）。擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，0.8 μL 引物（5 μmol·L-1），0.4 μLFastPfu聚合酶；10 ng DNA 模板。利用歐易生物科技有限公司平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的Coverage指數(shù)均大于0.94，表明試驗(yàn)樣本的測(cè)序覆蓋度均在94%以上，樣品的測(cè)序深度能夠滿足后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.4 煙株生長(zhǎng)發(fā)育及病害情況

在煙草移栽75 d時(shí)，記錄各個(gè)小區(qū)的煙株農(nóng)藝性狀。從青枯病發(fā)生的時(shí)間開(kāi)始調(diào)查并記錄實(shí)驗(yàn)小區(qū)發(fā)病的株數(shù)以及發(fā)病煙株的病情程度（煙草青枯病的發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%）[19]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，用R 軟件的Vegan包繪制熱圖，主成分分析采用SPSS 11.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本的測(cè)序結(jié)果

本試驗(yàn)樣品檢測(cè)到的OTUs總數(shù)為11 011。如圖1 所示，所有樣本共有的OUTs 總數(shù)為706，常規(guī)施肥下健康煙株的根際土壤與青枯病煙株的根際土壤2個(gè)處理共有的OTUs 總數(shù)為1 087，施加1.2 t·hm-2生物炭后健康煙株的根際土壤與青枯病煙株的根際土壤2 個(gè)處理共有的OTUs 總數(shù)為1 198，各個(gè)處理本身特有的OUTs總數(shù)分別為2268（ZCTR）、2 508（ZCSW）、2 320（QKTR）、2 336（QKSW）?？偟膩?lái)看，施加生物炭后健康煙株的根際土壤與青枯病煙株的根際土壤所共有的OTUs總數(shù)比常規(guī)施肥多。

圖1 各個(gè)處理細(xì)菌群落OTUs數(shù)Figure 1 The number of OTUs in bacterial community of each treatment

2.2 土壤細(xì)菌群落的α多樣性

由表2 可知，4 個(gè)處理的Shannon 指數(shù)和Chao1指數(shù)大小均表現(xiàn)為QKTR＜ZCTR＜QKSW＜ZCSW，Simpson指數(shù)反之，說(shuō)明無(wú)論煙株是否染病，生物炭施用均能提升根際土壤細(xì)菌α多樣性和群落豐富度；從細(xì)菌α多樣性來(lái)看，雖然各個(gè)處理無(wú)顯著差異，但是在數(shù)值上還是出現(xiàn)了差距，在施肥相同的條件下青枯病煙株的根際土壤細(xì)菌α多樣性均小于正常煙株根際土壤。從細(xì)菌群落的豐富度來(lái)看，ZCSW 處理的Chao1 指數(shù)顯著大于其他處理，說(shuō)明施加生物炭的健康煙株根際土壤細(xì)菌群落豐富度最大。同等施肥條件下，健康煙株的根際土壤Chao1 指數(shù)均顯著大于青枯病煙株的根際土壤Chao1指數(shù)。

表2 土壤細(xì)菌群落的α多樣性Table 2 The α diversity of soil bacterial community

2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

如圖2所示，對(duì)于變形菌門（Proteobacteria）來(lái)說(shuō)，ZCTR 處理的相對(duì)豐度相較于QKTR、ZCSW 處理明顯提高了1.07、3.59 個(gè)百分點(diǎn)，QKSW 處理的相對(duì)豐度相較于ZCSW 處理提高了2.60 個(gè)百分點(diǎn)；酸桿菌門（Acidobacteria）的相對(duì)豐度大小表現(xiàn)為QKTR＞ZCTR＞ZCSW＞QKSW，QKTR 處理的相對(duì)豐度比ZCTR、QKSW 處理明顯提高了1.27、3.48 個(gè)百分點(diǎn)，QKSW處理的相對(duì)豐度比ZCSW處理明顯減少了0.83個(gè)百分點(diǎn)；各個(gè)處理放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度大小表現(xiàn)為ZCTR＞QKTR＞QKSW＞ZCSW，ZCTR處理的相對(duì)豐度相較于QKTR、ZCSW、QKSW 處理分別提高了0.14、2.84、2.51 個(gè)百分點(diǎn)；芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度在ZCTR 處理最低，ZCSW 處理最高，ZCSW 的相對(duì)豐度較ZCTR 處理明顯提高了5.27 個(gè)百分點(diǎn)，且QKSW 處理較QKTR 處理也提高了4.15個(gè)百分點(diǎn)。

圖2 根際土壤細(xì)菌群落在門水平上的組成Figure 2 Composition of bacterial community in rhizosphere soil at phylum level

Heatmap 分析將樣本按豐度的相似性進(jìn)行分別聚合，用顏色的變化來(lái)表示土壤細(xì)菌種群之間的關(guān)系，紅色（正值）越深代表相對(duì)豐度越高，說(shuō)明土壤細(xì)菌生長(zhǎng)受到的促進(jìn)作用越強(qiáng)，藍(lán)色（負(fù)值）越深代表相對(duì)豐度越低，說(shuō)明土壤細(xì)菌生長(zhǎng)受到的抑制作用越強(qiáng)。由圖3可以看出，QKTR3處理有利于藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）的生長(zhǎng)，不利于迷蹤菌門（Elusimicrobia）的生長(zhǎng)；ZCTR3 處理有利于厚壁菌門（Firmicutes）、WCHB1_60 的生長(zhǎng)；QKSW3處理不利于綠彎菌門（Chloroflexi）的繁殖；ZCSW2 處理不利于變形菌門（Proteobacteria）的繁殖。

圖3 門水平上最大豐度排名前15的物種熱圖Figure 3 Heatmap of the top 15 species with the highest abundance at the phylum level

2.4 根際土壤細(xì)菌群落主成分

如圖4a 所示，ZCSW、QKSW、ZCTR、QKTR 處理各樣本點(diǎn)在PC2軸上依次排開(kāi)，且距離呈現(xiàn)先增大后減少再增大的趨勢(shì)，說(shuō)明施用生物炭對(duì)土壤微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的影響。由箱形圖（圖4b）可以看出，在PC1 軸上ZCSW、QKSW 兩個(gè)生物炭處理之間的距離較近，且均與QKTR、ZCTR 兩個(gè)未施生物炭處理之間相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明生物炭施用改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；QKTR、ZCTR 箱形長(zhǎng)度較短說(shuō)明組內(nèi)生物重復(fù)性好，ZCSW、QKSW 箱形長(zhǎng)度較長(zhǎng)說(shuō)明組內(nèi)重復(fù)較差。

圖4 根際土壤細(xì)菌群落主成分分析圖Figure 4 Principal component analysis of bacterial community in rhizosphere soil

2.5 根際土壤細(xì)菌群落LEfSe分析

利用LEfSe差異分析篩選出四種土壤中具有顯著差異的微生物（LDA閾值為2）。由圖5 可知，未添加生物炭的健康煙株根際土壤（ZCTR）樣本中，Perlucidibaca、Acidibacter、厚壁菌門（Firmicutes）顯著富集；添加生物炭的健康煙株根際土壤（ZCSW）樣本中，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、Ignavibacteriales、綠彎菌門（Chloroflexi）顯著富集；未添加生物炭的青枯病煙株的根際土壤（QKTR）樣本中，放線菌門（Actinobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）顯著富集；添加生物炭的青枯病煙株的根際土壤（QKSW）樣本中，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、鞘氨醇桿菌科（Sphingobacteriaceae）顯著富集。

圖5 根際土壤細(xì)菌群落LEfSe分析Figure 5 LEfSe analysis of bacterial community in rhizosphere soil

2.6 生物炭對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育的影響

由表3 可知，在煙株成熟期時(shí)，施用生物炭有利于煙株的生長(zhǎng)發(fā)育，并減少染病煙株的數(shù)量。施用生物炭后煙株的株高、葉長(zhǎng)、葉寬、莖圍分別較CK 處理增加了11.83%、16.88%、6.70%、10.80%。T1 處理青枯病的發(fā)病率也比CK處理降低了9.1個(gè)百分點(diǎn)。

表3 生物炭對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育的影響Table 3 Effects of biochar on tobacco growth and development

3 討論

3.1 健康煙株與青枯病煙株根際土壤的微生態(tài)差異

土壤微生態(tài)系統(tǒng)的物種多樣性指數(shù)反映了微生物種群結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度。有研究表明，微生物多樣性指數(shù)越高，微生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，穩(wěn)定性越高[26]。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于常規(guī)施肥的土壤來(lái)說(shuō)，青枯病煙株的根際土壤細(xì)菌α多樣性和豐富度比健康煙株根際土壤低，與施河麗等[15]的研究結(jié)果一致。土壤微生物多樣性的降低說(shuō)明根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的平衡受到破壞，這是土傳病害發(fā)生的重要原因之一[27]。由物種組成豐度圖（圖2）可以看出，健康煙株與青枯病煙株根際土壤細(xì)菌門類組成基本一致，變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門，這與張超等[28]研究結(jié)果一致。由Heatmap 分析結(jié)果可知，藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、迷蹤菌門（Elusimicrobia）的生長(zhǎng)在QKTR 處理中受到明顯抑制，說(shuō)明生物炭能夠減少與病害根際土壤相關(guān)細(xì)菌門類的相對(duì)豐度，使土壤微生態(tài)環(huán)境向健康的方向發(fā)展。

3.2 生物炭對(duì)青枯病煙株根際土壤的微生態(tài)防治機(jī)理

大量研究表明，施用生物炭具有改良土壤、保持土壤水分及養(yǎng)分的效果，已經(jīng)成為調(diào)控土壤連作障礙和土壤健康管理的重要途徑之一[29]。本研究通過(guò)比較不同施肥條件下健康煙株與青枯病煙株根際土壤微生物群落的差異，推測(cè)生物炭對(duì)青枯病煙株的根際土壤微生態(tài)防治機(jī)制，即生物炭施入后對(duì)土壤和煙株均產(chǎn)生正向影響：對(duì)于煙株來(lái)說(shuō)，生物炭促進(jìn)煙株生長(zhǎng)發(fā)育，提升煙株自身免疫，降低了青枯病發(fā)病率[30]；對(duì)于土壤來(lái)說(shuō)，生物炭提升了根際土壤細(xì)菌多樣性，增加了細(xì)菌群落的豐富度，使土壤微生態(tài)系統(tǒng)向更加穩(wěn)定健康的方向發(fā)展，減輕土壤病害的發(fā)生[31]。生物炭的施用能夠使有益菌（如芽單胞菌門）顯著富集，定向調(diào)控?zé)熖锏母H土壤微生態(tài)，豐富土壤生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性，有利于土壤微生態(tài)系統(tǒng)的平衡，重建健康的土壤微生態(tài)系統(tǒng)，減輕或抑制煙草青枯病的發(fā)生[32]，其作用機(jī)制如圖6所示。

圖6 生物炭對(duì)青枯病煙株的根際微生態(tài)防治機(jī)制Figure 6 Soil microecological control mechanism of tobacco bacterial wilt by biochar

4 結(jié)論

（1）煙草青枯病會(huì)降低土壤細(xì)菌多樣性和豐富度，使土壤原有的有益菌數(shù)量減少，增加與青枯病相關(guān)的細(xì)菌的相對(duì)豐度，如厚壁菌門（Firmicutes）、WCHB1_60、綠彎菌門（Chloroflexi）和變形菌門（Proteobacteria）。

（2）生物炭有效改善根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，提升細(xì)菌多樣性，使根際土壤富集有利于土壤健康和植物健康的細(xì)菌，構(gòu)建健康的土壤微生態(tài)系統(tǒng)，維持土壤微生態(tài)平衡，促進(jìn)煙株健康發(fā)育的同時(shí)減少青枯病的發(fā)病率。