楊滿英，陳雪珍，朱蓉，謝婷，胡金輝

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

乳腺癌是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一。研究表明，中醫(yī)藥制劑在改善乳腺癌患者癥狀、調控精神心理狀態(tài)等方面具有明顯的療效。康艾注射液（以下簡稱“康艾”）作為臨床應用廣泛的中藥抗腫瘤制劑[1]，藥物安全性及有效性明確，取得了較好的臨床效果?？蛋怯扇藚?、黃芪、苦參中有效組分制成的中藥制劑，其中最關鍵的成分是苦參素[1-3]?？鄥⑺赜址Q氧化苦參堿，有研究顯示，其能夠有效調節(jié)乳腺癌腫瘤細胞周期、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的侵襲轉移、逆轉乳腺癌的多藥耐藥、調控腫瘤細胞的代謝水平等[4-5]，進而達到抗腫瘤的效果。Lin 等[6]研究用氧化苦參堿介導人乳腺癌MCF-7 細胞Bax 和Bcl-2 的表達，可誘導乳腺癌細胞凋亡。臨床亦有報道康艾可有效治療乳腺癌[7-9]。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法探討康艾治療乳腺癌的潛在作用機制，為臨床應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 康艾注射液活性成分收集與篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（ TCMSP ， http://www.tcmsp.com/tcmsp.php ） 和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstarget prediction.ch/）檢索人參、黃芪、苦參的活性成分，獲取分子信息，包括活性成分的分子名稱、口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）等。以OB≥30%和DL≥0.18 為條件篩選主要活性成分。

1.2 康艾注射液活性成分相關靶蛋白獲取

根據(jù)篩選得到的活性成分，在TCMSP 中點擊“ Related Targets ” ， 獲取成分的“ Targets Information”，得到該成分作用的靶蛋白名。在UniProt（http://www.uniprot.org/）中，使用UniProt KB 檢索功能，在檢索框中輸入靶蛋白名，檢索條件為“organism: homo sapiens”和“reviewed: yes”，獲取基因名稱和UniProt ID。

1.3 康艾注射液治療乳腺癌靶點收集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（ http://www.genecards.org/ ） 和 OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omin.org/），以“breast cancer”為關鍵詞檢索乳腺癌相關基因和蛋白靶點信息，根據(jù)Relevance score≥9.67 篩選核心基因。借助R 語言，獲得康艾活性成分靶蛋白與乳腺癌靶蛋白的交集靶點。

1.4 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

使用Cytoscape3.6.1 軟件構建康艾治療乳腺癌的“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡，圖中以“節(jié)點”（node）表示活性成分和靶點基因，用“邊”（edge）表示兩者之間的關系，并進行網(wǎng)絡特征分析，以篩選其中較為重要的活性成分。

1.5 交集基因蛋白相互作用網(wǎng)絡構建與核心靶點篩選

通過STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），點擊“Multiple Proteins”，限定物種為人，獲取交集基因的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡。對數(shù)據(jù)進行預讀后設置置信度為0.9，隱藏孤立蛋白，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.6.1 軟件繪制交集靶點網(wǎng)絡圖，進行網(wǎng)絡拓撲結構分析，以節(jié)點degree 值反映基因作用大小，依據(jù)degree≥19 和介度中心性≥0.022，獲得核心靶點。

1.6 GO 功能與KEGG 通路富集分析

將交集靶點導入Metascape平臺（http://metascape.org/）進行分析，設置物種為“Homo Sapiens”，進行GO 功能和KEGG 通路富集分析。

1.7 分子對接

為進一步驗證活性成分與蛋白靶點之間的結合活性，選取“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡中degree值排前3 位的活性成分，與PPI 網(wǎng)絡篩選出的核心靶點進行分子對接。 在 PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中下載靶點的3D 結構，保存為“.pdb”格式文件，在TCMSP 中下載化合物的“.mol2”格式文件。在AutoDock1.5.6 軟件中導入靶點和化合物的結構文件，經(jīng)過去水、加氫、分配電荷等處理，運用Grid 模塊設置蛋白原配體為對接盒子中心，將準備好的蛋白文件、配體文件、化合物文件及腳本放入相應文件夾，利用AutodockVina1.1.2 分子模擬軟件進行分子對接，并使用Discovery Studio（2016 版）繪制最佳匹配結果圖。

2 結果

2.1 康艾注射液活性成分及治療乳腺癌靶點篩選

通過TCMSP 和SwissTargetPrediction 及相關文獻補充檢索，以OB≥30%、DL≥0.18 為條件篩選得到黃芪、人參、苦參活性成分共43 個，其中黃芪20 個、人參22 個，苦參1 個，見表1。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫選取活性成分對應的靶點，其中共有22 個活性成分未能查到對應靶點基因，刪除重復項目后獲得靶點295 個。通過GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫收集到乳腺癌相關靶點并篩選核心基因共3670個，將康艾和乳腺癌相關靶點進行映射并取交集得到204 個交集靶點，即康艾治療乳腺癌的潛在作用靶點，見圖1。

圖1 康艾-乳腺癌基因靶點韋恩圖

表1 康艾注射液活性成分基本信息

續(xù)表1

2.2 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡

使用Cytoscape3.6.1 軟件繪制康艾治療乳腺癌的中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡，見圖2。該網(wǎng)絡圖可直觀反映康艾通過多成分、多靶點治療乳腺癌的作用機制。運用CytoNCA 插件對網(wǎng)絡進行分析，根據(jù)degree 排序，主要活性成分有氧化苦參堿、槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、常春藤皂苷元、佳羅醇等。

圖2 康艾注射液治療乳腺癌中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡

將交集基因上傳至STRING，設置信度為高置信度（0.9），得到 PPI 網(wǎng)絡圖，將結果導入Cytoscape3.6.1 進行網(wǎng)絡可視化，見圖3。網(wǎng)絡圖中包含 174 個節(jié)點、853 條邊，使用“network analyzer”功能計算degree 值，用CytoNCA 對網(wǎng)絡進行拓撲分析，根據(jù)degree 值大小排序，顏色越深，節(jié)點越大，說明該靶點在治療中的作用越大。排名前5 位的靶點分別為MAPK1、AKT1、JUN、TP53（即P53）、 ESR1。

圖3 康艾注射液治療乳腺癌作用靶點PPI 網(wǎng)絡

2.4 GO 功能富集分析

將204 個交集靶點導入Metascape 平臺進行生物過程（Biological Process，BP）、細胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）富集分析。GO 功能富集分別得到BP、CC、MF 各10 項（見圖4），BP 主要涉及對毒性物質的應答（response to toxic substance）、細胞脂質反應（cellular response to lipid）、脂多糖反應（response to lipopolysaccharide）等，CC 有膜筏（membrane raft）、細胞外基質（extracellular matrix）、轉錄因子復合體（transcription factor complex）等，MF 有轉錄因子結合（transcription factor binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、蛋白結構特異性結合（protein domain specific binding）等。

圖4 康艾注射液治療乳腺癌靶點GO 功能富集分析

2.5 KEGG 通路富集分析

將上述204 個交集靶點在Metascape 平臺進行KEGG 通路富集分析，獲得康艾治療乳腺癌的20 條信號通路，其中關鍵通路有TNF 信號通路、MAPK信號通路、鉑類藥物耐藥信號通路、腫瘤糖代謝、細胞衰老、JAK-STAT 信號通路、FOXO 信號通路、雌激素信號通路等。見圖5。

圖5 康艾注射液治療乳腺癌靶點KEGG 通路富集分析

2.6 分子對接

根據(jù)度值、介度中心性從PPI 網(wǎng)絡中篩選得到排名前 5 位核心靶點 MAPK1、AKT1、JUN、TP53、ESR1 作為治療乳腺癌的潛在靶點，與中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡中度值排名前3 位的活性成分氧化苦參堿（oxymatrine）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）進行分子對接，評分見圖6；分子對接結合能＜-5 時，認為藥物和靶點蛋白結合穩(wěn)定，可起到治療作用。靶點蛋白和化合物的結合能均小于-5，表明受體和配體結合能力高。Vina Score 評分顯示山柰酚、氧化苦參堿和JUN 靶點結合能最低，說明山柰酚、氧化苦參堿和JUN 的結合活性最強；槲皮素的最佳結合靶點是MAPK1，見圖7～圖9。

圖6 分子對接Vina Scroe 熱圖

圖7 槲皮素-MAPK1 分子對接模型及受體-蛋白質2D 結合圖

圖7 山柰酚-JUN 分子對接模型及受體-蛋白質2D 結合圖

圖8 氧化苦參堿-JUN 分子對接模型及受體-蛋白質2D 結合圖

3 討論

隨著對乳腺癌發(fā)病及治療相關機制的研究不斷深入，其病理機制逐漸被揭示?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，乳腺癌的形成機制包括腫瘤雌激素受體機制、干細胞形成機制及炎性刺激相關機制等。在治療方面，較長時間的西藥治療易出現(xiàn)各類臨床不良反應且易復發(fā)。隋代醫(yī)家巢元方有云：“積聚者，由寒氣在內所生也。血氣虛弱，風邪搏于腑臟，寒多則氣澀，氣澀則生積聚也?！薄夺t(yī)宗必讀?積聚》記載“積之成者，正氣不足，而后邪氣居之”。乳腺癌在中醫(yī)又稱為“乳巖”“乳石癰”“翻花乳”等。中醫(yī)認為乳腺癌的病機以氣血虧虛為本，氣滯血瘀、痰火毒結為標，整體屬虛，局部屬實，虛實夾雜[10]。手術治療易內耗氣血，致氣血更虧；化療、放療更為攻伐之術，驅邪同時也損傷正氣，灼傷陰津。故中醫(yī)治療時多以扶正祛邪為治療大法，兼顧養(yǎng)陰?？蛋哂幸鏆怵B(yǎng)陰、扶正抗癌的作用，初始研究多用以治療肝癌、肺癌、結腸癌、婦科相關惡性腫瘤，或化療后導致的骨髓抑制、白細胞減少癥；從中醫(yī)辨證論治角度看，康艾配方基礎契合乳腺癌“益氣養(yǎng)陰、扶正抗癌”的治療原則，且近年來，臨床上把康艾擴展運用于治療手術后化療患者亦取得良好的臨床效果。

網(wǎng)絡藥理學網(wǎng)狀式地闡述藥物有效成分與疾病各個靶點的內在關系，這與中藥復方多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用原理不謀而合[11-13]。本研究分析顯示，康艾關鍵成分為氧化苦參堿、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇、人參皂苷等成分起到協(xié)同作用。槲皮素、山柰酚屬于植物來源的黃酮類化合物，是一類具有抗癌活性且毒副作用小的天然多酚類化合物[14]。槲皮素、山柰酚抗乳腺癌機制包括阻滯細胞周期[15-18]、促進細胞凋亡[19-21]、抑制侵襲轉移[22]、調節(jié)腫瘤細胞糖代謝[21,23]、化療增敏及逆轉耐藥[19,24-25]抑制乳腺癌細胞的生長與增殖。氧化苦參堿不僅具有類黃酮類化合物的抗癌活性，還能誘導癌細胞發(fā)生自噬[26]，但其對乳腺癌細胞的自噬作用目前暫未見報道。

康艾治療乳腺癌主要作用蛋白為 MAPK1、AKT1、JUN、TP53、ESR1。MAPK1 屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，MAPK 在乳腺癌中被明顯激活，持續(xù)活化最終導致細胞的增殖和惡性轉化。邵建斌等[27]體外實驗研究顯示，miR-198 靶向MAPK1 能抑制人乳腺癌MCF-7 細胞的增殖并促進其凋亡。本研究分子對接中3 種核心有效成分與MAPK1 結合活性僅次于最高結合點JUN，說明康艾有效成分能穩(wěn)定結合在乳腺癌MAPK1 靶點上，起到治療作用。AKT1 又稱蛋白激酶B，是PI3K/AKT 信號通路中重要的下游靶標，參與的生物過程包括調控細胞存活、代謝、生長、增殖、轉錄及蛋白質合成。Li等[28]研究表明，大黃素干擾AKT1 介導的DNA 損傷并降低乳腺癌細胞對化療藥物的耐藥性。Capivasertib（AZD5363）是一個高選擇性的AKT1-3 亞型抑制劑，一項雙盲、隨機臨床試驗表明，Capivasertib 聯(lián)合紫杉醇治療三陰性乳腺癌，其治療效果使無進展生存期增加1 倍以上，且顯著提高客觀緩解率和總生存期[29]。JUN 屬于激活蛋白（AP-1）的蛋白家族之一，當受到細胞張力變化、DNA損傷、氧化應激、紫外線照射、細菌及病毒感染等刺激時，活化后的AP-1 作為轉錄因子參與調控細胞增殖、分化和凋亡等生物過程。Song 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，AP-1 在三陰性乳腺癌中高表達，靶向阻斷AP-1 家族蛋白成員可增加三陰性乳腺癌患者對PARP 抑制劑的敏感性。癌癥患者對化療藥物不敏感或耐藥是臨床治療重大難題之一，康艾關鍵有效成分氧化苦參堿、槲皮素、山柰酚均被證實具有化療增敏及逆轉耐藥的作用[4,15,31]。分子對接結果顯示，氧化苦參堿、山柰酚與JUN 有最佳的對接結果，說明康艾不僅有抗乳腺癌效果，聯(lián)合化療藥還起到化療增敏及減少耐藥的作用，與多項臨床觀察實驗[7,9]得出結論一致。突變后的P53 失去原有的抑癌功能，對細胞的生長失去調控作用，Rong 等[32]對958 例轉移性乳腺癌患者的血液標本進行ctDNA 檢測，發(fā)現(xiàn)突變腫瘤基因P53 約54%，P53 與較差的臨床結局相關。

GO 功能富集分析顯示，康艾干預乳腺癌細胞膜筏、細胞外基質、轉錄因子復合體。膜筏主要生物功能有信息傳導、膜組分分迭、腺癌細胞的定向遷移等[33]。腫瘤細胞的侵襲轉移是影響惡性腫瘤預后及總生存（OS）的關鍵因素，細胞外基質是阻止腫瘤轉移的重要組織屏障，一項系統(tǒng)評價分析表明，MMP2、MMP9 過度表達與不良OS 相關，細胞外基質在癌癥患者生存期發(fā)揮重要角色[34]。轉錄因子對基因的表達起抑制或增強作用，陸慧敏等[35]研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可激活AP-1，對4T1 乳腺癌模型小鼠有抑制作用。說明康艾治療乳腺癌可能和轉錄因子對相關通路靶點的調控相關。

KEGG 通路富集分析顯示，MAPK 信號通路起到主要作用。通路之間相互交叉，又相互作用，其治療特點是在乳腺癌通路網(wǎng)路上多位點阻滯或激活，相比單一靶點的藥物，或許能得到更好的療效。

綜上所述，本研究揭示了康艾治療乳腺癌的主要活性成分為氧化苦參堿、槲皮素、山柰酚，涉及的關鍵分子功能有轉錄因子結合、核受體活性、蛋白結構特異性結合，其參與的作用機制主要與MAPK 通路相關，提示康艾治療乳腺癌有效物質-關鍵靶點作用的網(wǎng)絡關系，為進一步的藥效物質研究及作用機制研究提供方向。

本研究仍存在不足之處，網(wǎng)絡藥理學所得到的有效成分及靶點均從數(shù)據(jù)庫中匹配信息得到，但目前現(xiàn)有的中藥數(shù)據(jù)庫對收集藥物的信息存在差異性，代謝分布不統(tǒng)一，中藥的生物利用度、組織分布等無法客觀量化等，因此本研究下一步將依據(jù)網(wǎng)絡藥理學預測的藥物物質基礎和通路展開實驗驗證研究。