李榮蓉，付燕紅，趙紫涵，阮 新，付學(xué)軍，孫利芹

（1.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.煙臺(tái)海關(guān)技術(shù)中心，山東 煙臺(tái) 264000）

海帶（Laminaria japonica.）中含有褐藻膠、褐藻糖膠、褐藻淀粉[1]等多糖。目前，我國海帶的工業(yè)利用率僅占30%[2]，其深加工主要集中在碘、褐藻膠及甘露醇等的生產(chǎn)中[3]，造成海帶價(jià)格瓶頸，制約了海帶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，同時(shí)海帶工業(yè)殘?jiān)鳛閺U棄物，其中還有豐富的蛋白質(zhì)、褐藻糖膠及膳食纖維，造成資源浪費(fèi)。

褐藻糖膠（Fucoidan）是一種水溶性硫酸雜多糖，主要成分為硫酸化的α-L-巖藻糖，并含少量木糖、甘露糖、半乳糖和糖醛酸等[4]。近年來，大量研究已證明褐藻糖膠具有降血糖血脂、抗氧化、抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等生理活性作用，已成為海洋藥物研究的熱點(diǎn)，有很好的應(yīng)用前景[5-12]。目前，國內(nèi)外對褐藻糖膠的研究較集中于提取率的提高，在進(jìn)一步分離純化和生理活性研究上不夠深入。褐藻糖膠的初步分離純化通常采用乙醇分級(jí)沉淀法、CaCl2法和季胺鹽沉淀法等方法[13]。但其提取物中通常會(huì)含有蛋白質(zhì)、色素、褐藻膠等雜質(zhì)[14]，采用Sevag法、三氯乙酸法、鞣酸法[15-16]等方法去除蛋白會(huì)損失褐藻糖膠，同時(shí)會(huì)影響褐藻糖膠活性[17]，因此需要對褐藻糖膠分離純化方法、結(jié)構(gòu)和抗氧化活性進(jìn)行進(jìn)一步研究。

采用DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱層析及高效液相凝膠色譜（High performance liquidchromatography，HPLC）對海帶中褐藻糖膠粗品進(jìn)行分離純化工藝的研究，測定了高效液相凝膠色譜分離所得3個(gè)組分的分子量，并對DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱層析得到的3個(gè)組分清除DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基和·OH（羥自由基）能力進(jìn)行測定，分析不同分子量褐藻糖膠的抗氧化活性。研究為海帶褐藻糖膠的高效且安全的分離純化方法提供試驗(yàn)依據(jù)，有利于有效開發(fā)利用具有生物活性的海洋藻類多糖[18]，減少資源浪費(fèi)，提高海帶的附加值，更好地開發(fā)和利用海洋資源[19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干海帶，山東榮成尋山集團(tuán)有限公司提供；纖維素酶（20 000 U/g）、果膠酶（60 000 U/g）、復(fù)合蛋白酶（390 000 U/g），帝斯曼公司提供；中性蛋白酶（20 000 U/mL），無錫市酶制劑廠提供；標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖，中國計(jì)量科學(xué)研究院提供；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Agilent1100型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；CBS-A型程控全自動(dòng)部分收集器、DHL-A型電腦數(shù)顯恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 褐藻糖膠粗品制備方法

工藝流程：干海帶→粉碎、過40目篩→檸檬酸-褐藻酸鈉緩沖液浸提→復(fù)合酶解→升溫滅酶→NaOH溶液堿溶消化→過濾→濾液加HCl溶液酸凝過夜→加Na2CO3溶液中和→4倍體積乙醇醇析→減壓抽濾→沉淀→干燥→褐藻糖膠粗品。

酶解條件[20]：纖維素酶添加量1%，中性蛋白酶添加量0.5%，復(fù)合蛋白酶添加量0.5%，果膠酶添加量1%，料液比1∶40，pH值6.0，溫度60℃，時(shí)間3 h。

1.3.2 褐藻糖膠組分的分離

（1）DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱層析分離褐藻糖膠[21]。分別稱取不同質(zhì)量（0.1，0.2，0.3，0.4 g）褐藻糖膠粗品，用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液（Phosphate-Buffered Saline，PBS，pH值7.4）配成5，10，15，20 mg/mL不同質(zhì)量濃度褐藻糖膠溶液，分別上樣于DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱（1.6 cm×30 cm），用0～2.0 mol/L的NaCl溶液（pH值7.4，0.02 mol/L的PBS配制）線性梯度洗脫，洗脫流速0.5 mL/min，自動(dòng)部分收集器15 min/管收集。苯酚-硫酸法[22]測定多糖含量，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的洗脫曲線，收集各洗脫峰，超濾濃縮后冷凍干燥。

（2）高效液相凝膠色譜分離褐藻糖膠。取適量褐藻糖膠粗品，用超純水配制成200 μg/mL的樣品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，4℃下冷藏，備用。

色譜條件：Agilent1100型高效液相色譜系統(tǒng)；Waters UltrahydrogelTM linear色譜柱（7.8 mm×300 mm），示差折光（RI）檢測器，流動(dòng)相：超純水，流速0.6 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量20 μL。

（3）HPLC測定褐藻糖膠組分相對分子質(zhì)量。采用1.3.2高效液相色譜條件，將HPLC分離得到的褐藻糖膠樣品組分和一系列不同相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（12.6，60.6，110，521 kD）分別流經(jīng)Agilent1100型高效液相色譜系統(tǒng)中Waters UltrahydrogelTM linear色譜柱，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為200 μg/mL，示差折光檢測器檢測。由標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的相對分子質(zhì)量對數(shù)與保留時(shí)間做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此計(jì)算樣品相對分子質(zhì)量及分布，樣品純度由峰型判斷。

1.3.3 體外抗氧化活性測定

（1）清除DPPH自由基的能力。將褐藻糖膠樣品組分（D-1，D-2，D-3）配成質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL，各取2 mL于試管中，分別加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL，混勻靜置20 min后測定波長517 nm處的光吸度（用乙醇2 mL+水2 mL作參比）。同時(shí)，以相同濃度梯度的BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）作為對照，重復(fù)上述操作，并設(shè)置平行。

DPPH自由基清除能力的計(jì)算公式：

式中：Ai——DPPH溶液2 mL+樣品溶液2 mL的吸光度；

Aj——乙醇2 mL+樣品溶液2 mL的吸光度；

Ac——乙醇2 mL+DPPH溶液2 mL的吸光度。

（2）清除·OH的能力。根據(jù)Fenton反應(yīng)原理測定褐藻糖膠清除·OH的能力。將褐藻糖膠（D-1，D-2，D-3）配制成質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mg/mL。取6 mmol/L水楊酸1 mL于試管中，加入2 mmol/L FeSO4溶液1 mL混勻，再加入6 mmol/L H2O2溶液1 mL混勻，于37℃下恒溫水浴15 min，于波長510 nm處測定其吸光度A損傷（用水作為參比）。測定后，各加入上述質(zhì)量濃度的海帶多糖溶液1 mL，混勻靜置10 min，再測定其吸光度A加樣，并用水代替H2O2的A未損傷做參照。同時(shí)，以相同質(zhì)量濃度的維C作為對照，重復(fù)上述操作，并設(shè)置平行。

·OH清除能力的計(jì)算公式：

式中：A損傷——反應(yīng)體系原來的吸光度；

A未損傷——加入提取液但不加入H2O2的吸光度；A加樣——反應(yīng)體系加入提取液后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換色譜分離褐藻糖膠

對5，10，15，20 mg/mL不同質(zhì)量濃度褐藻糖膠溶液，NaCl溶液0～2.0 mol/L梯度洗脫時(shí)的分離效果。

褐藻糖膠不同上樣量的離子交換色譜梯度洗脫曲線見圖1。

圖1 褐藻糖膠不同上樣量的離子交換色譜梯度洗脫曲線

由圖1可知，圖（a）～（d）分別是上樣質(zhì)量濃度為5，10，15，20 mg/mL的洗脫圖。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，各組分分離不徹底，且含量較少，不便于收集（見圖1（a））；由圖1（c）和圖1（d），隨著上樣量增大，鹽洗脫峰的多糖含量并沒有增加，表明圖1（c）上樣質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，此時(shí)各組分分離程度比較好，且呈現(xiàn)單一對稱峰，說明達(dá)到一定的純度。因此，選擇上樣質(zhì)量濃度15 mg/mL，既達(dá)到了良好的分離效果，又便于收集。

根據(jù)圖1（c），試驗(yàn)共分離得到3個(gè)峰，分別記為D-1，D-2和D-3。其中，D-1為流出峰，D-2和D-3為鹽洗脫峰，D-2 NaCl溶液濃度為0-0.5 mol/L，D-3 NaCl溶液濃度為1.00～1.25 mol/L。各峰型均無拖尾現(xiàn)象，分離效果較理想。

2.2 高效液相凝膠色譜分離褐藻糖膠

褐藻糖膠的HPLC色譜圖見圖2，HPLC色譜峰的保留時(shí)間和相對峰面積見表1。

表1 HPLC色譜峰的保留時(shí)間和相對峰面積

圖2 褐藻糖膠的HPLC色譜圖

褐藻糖膠樣品經(jīng)過高效液相凝膠色譜分出了3個(gè)組分H-1，H-2，H-3。其中，H-1的保留時(shí)間為8.107 min，H-2的保留時(shí)間為9.594 min，H-3的保留時(shí)間為10.397 min。

2.3 純度與相對分子量測定結(jié)果

2.3.1 褐藻糖膠組分純度

由圖2可知，褐藻糖膠樣品所分出的3個(gè)組分，高效液相色譜圖均呈現(xiàn)單一窄峰，因此試驗(yàn)分離得到的3個(gè)組分可被認(rèn)為是均一組分。

2.3.2 HPLC相對分子量測定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的HPLC色譜圖見圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的HPLC色譜圖

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的HPLC色譜圖，各標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的出峰時(shí)間分別為6.824，8.852，9.576，12.573 min，與其對應(yīng)的分子量為521，110，60.6，12.6 kD。

標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

根據(jù)圖4葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和圖2褐藻糖膠樣品中各組分的出峰時(shí)間可得3個(gè)組分的分子量大小。

色譜峰的保留時(shí)間和分子量見表2。

表2 色譜峰的保留時(shí)間和分子量

2.4 褐藻糖膠清除自由基的測定結(jié)果

2.4.1 褐藻糖膠清除DPPH自由基的測定結(jié)果

褐藻糖膠各組分和BHT的DPPH自由基清除見圖5。

由圖5可知，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，褐藻糖膠3個(gè)組分D-1，D-2，D-3和BHT對DPPH自由基都有一定的清除作用，隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基的清除率也在增大，均呈一定劑量-效應(yīng)相關(guān)性，清除率大小為BHT>H-3>H-2>H-1。測定BHT和褐藻糖膠各組分的IC50值，以BHT抗氧化劑作為對照，不同分子量褐藻糖膠組分清除DPPH自由基能力均低于BHT，BHT的IC50為0.922 8 mg/mL。褐藻糖膠中D-3的IC50最小，為1.254 0 mg/mL，表示對DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)；其次是D-2，IC50為1.874 0 mg/mL；D-1對DPPH自由基的IC50最大，為2.412 2 mg/mL，對DPPH自由基的清除能力最弱。3個(gè)組分由強(qiáng)到弱排列順序?yàn)镈-3>D-2>D-1，對比分子量發(fā)現(xiàn)，褐藻糖膠的分子量越小，對DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)，體外抗氧化效果越好。

圖5 褐藻糖膠各組分和BHT的DPPH自由基清除率

2.4.2 褐藻糖膠清除羥基自由基的測定結(jié)果

褐藻糖膠各組分和維C的·OH清除率見圖6。

圖6 褐藻糖膠各組分和維C的·OH清除率

由圖6可知，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，褐藻糖膠3個(gè)組分D-1，D-2，D-3和維C對·OH都有一定的清除作用，隨著質(zhì)量濃度的增加，·OH的清除率也在增大，呈一定劑量-效應(yīng)相關(guān)性，當(dāng)升高到一定質(zhì)量濃度時(shí)，清除率基本趨于定值。測定維C和褐藻糖膠各組分的IC50值，以維C作為對照，維C的IC50為0.349 8 mg/mL，褐藻糖膠組分中D-3的IC50小于維C，D-1和D-2的IC50大于維C。褐藻糖膠D-3的IC50最小，為0.306 5 mg/mL，表示對·OH的清除能力最強(qiáng)；其次是D-2，IC50為0.549 1 mg/mL；D-1的IC50最大，為0.795 1 mg/mL，對·OH的清除能力最弱。由此可見，褐藻糖膠對·OH有較強(qiáng)的清除能力，3個(gè)組分由強(qiáng)到弱排列順序?yàn)镈-3>D-2>D-1，即褐藻糖膠的分子量越小，對·OH的清除能力越強(qiáng)，體外抗氧化活性越好。

3 討論

利用高效液相凝膠色譜對海帶褐藻糖膠粗品進(jìn)行分離純化，達(dá)到很好的分離效果，分離純化的同時(shí)可測出各組分的分子量。該分離方法相較于離子交換層析和凝膠柱層析等其他分離方法，具有樣品處理簡單、靈敏度高、制備方便快速、樣品用量少且不被破壞等優(yōu)點(diǎn)，已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道高效液相色譜在褐藻糖膠研究中用于測定組分的單糖組成[23-24]，但采用高效凝膠色譜分離褐藻糖膠組分并對各組分進(jìn)行分子量的測定相關(guān)文獻(xiàn)少見。

對高效液凝膠相色譜純化得到的褐藻糖膠3個(gè)組分進(jìn)行了分子量測定，結(jié)果為193.148，74.407，44.452 kD。與周軍明[25]用離子交換層析純化褐藻糖膠后采用Sephadex G-150型凝膠柱層析測的各組分分子量為120 226.4 D和13 182.5 D的結(jié)果有一定差異，可能因多糖種類不同導(dǎo)致。用高效液凝膠相色譜測定多糖分子量要比Sephadex G-150型凝膠柱層析更為快速、精確。試驗(yàn)還測定了DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱層析純化得到的褐藻糖膠3個(gè)組分清除DPPH自由基和·OH的能力與分子量的相關(guān)性，與陶傳云等人[26]研究褐藻糖膠多糖的體外抗氧化性能結(jié)果相一致，均證明了分子量越小的組分，體外抗氧化效果越好。由于時(shí)間限制，沒有進(jìn)一步研究D-1，D-2，D-3 3個(gè)組分與H-1，H-2，H-3 3個(gè)組分的對應(yīng)關(guān)系及相關(guān)性，褐藻糖膠各組分的組成、結(jié)構(gòu)及生物體內(nèi)的活性還需要繼續(xù)深入研究和探索。

4 結(jié)論

（1）采用2種方法對海帶褐藻糖膠粗品進(jìn)行分離純化，結(jié)果表明，DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱層析和高效液相凝膠色譜均分離出3個(gè)組分，適于褐藻糖膠的純化[27]。

（2）DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱層析的最佳條件為褐藻糖膠粗品上樣量為20 mL（質(zhì)量濃度為15 mg/mL），0.5 mL/min，0～2.0 mol/L的Na-Cl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，得到的3個(gè)峰分別為D-1，D-2，D-3，其中D-1為流出峰，D-2和D-3為鹽洗脫峰。高效液相凝膠色譜分離所得H-1，H-2，H-3共3個(gè)組分，分子量分別為193.148，74.407，44.452 kD。

（3）D-1，D-2，D-3組分對DPPH自由基和·OH自由基均表現(xiàn)出一定的清除能力，3個(gè)組分清除DPPH自由基能力均低于BHT；D-3清除·OH的能力高于維C，D-1和D-2清除·OH的能力低于維C。且3個(gè)組分對2種自由基的清除率隨質(zhì)量濃度升高而增大，清除2種自由基能力由強(qiáng)到弱的排列順序均為D-3>D-2>D-1，即分子量越小，體外抗氧化活性越高。