張德峰 高德珍 于淑紅

RHD和RHCE基因由于同源性、相近性和方向相反，可以交換核苷酸從而產(chǎn)生變異等位基因[1]。RH等位基因多態(tài)性的存在導(dǎo)致表型的變異。對于有輸血或妊娠免疫史的患者，當(dāng)檢出與自身Rh抗原對應(yīng)的Rh抗體時，很難通過血清學(xué)試驗區(qū)分是自身抗體還是同種抗體[2]。本例報道為一例RhD陽性患者產(chǎn)生抗-D抗體，通過血清學(xué)試驗聯(lián)合RH基因分型技術(shù)，確定RH等位基因是否有變化，進(jìn)而判定抗體的性質(zhì)。

材料與方法

1 臨床資料 患者，女，47歲，15年前因頭暈、乏力伴茶色尿第一次入住我院，血紅蛋白為48 g/L，總膽紅素、間接膽紅素升高，直接抗人球蛋白試驗（direct antiglobulin test，DAT）陽性，骨髓穿刺提示溶血骨髓象。糖皮質(zhì)激素控制溶血有效，臨床診斷為自身免疫性溶血性貧血。交叉配血不合，同型輸注B型RhD陽性洗滌紅細(xì)胞4 U，血紅蛋白升至99 g/L。患者院外自服潑尼松治療，間斷復(fù)查血常規(guī)，血紅蛋白維持在90 g/L左右。既往剖宮產(chǎn)術(shù)后病史13年余，糖尿病病史8年余。2年前，因乏力加重再次入院，血紅蛋白為46 g/L，直接抗人球蛋白試驗陽性，不規(guī)則抗體篩查試驗陽性，抗體鑒定試驗提示抗-D抗體。近兩年，為提高血紅蛋白，反復(fù)多次輸注RhD陰性紅細(xì)胞，輸注后復(fù)查血紅蛋白，均提示輸注有效。

2 主要儀器與試劑 Ortho Autovue Innova全自動血型分析儀、貝索毛細(xì)管離心機(jī)、Kubota KA-2200血清離心機(jī)、Grifols凝膠卡離心機(jī)、Diamed-ID孵育器；IgM型單克隆抗體抗-A和抗-B、抗-D血型定型試劑（批號：20201017、20210115）均購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，反定型細(xì)胞及不規(guī)則抗體篩選細(xì)胞（批號：A473Z、3SS0072）、血型卡及抗篩卡（批號：ABR245J、AHC209J）均購自奧森多臨床診斷（英國）有限責(zé)任公司，抗人球蛋白檢測卡（批號：21050.01.1）購自蓋立復(fù)診斷股份有限公司，16系抗體鑒定譜細(xì)胞及IgM型單克隆抗體抗-K（批號：8000453845、8000254004）均購自荷蘭三昆試劑有限公司，人類紅細(xì)胞RHD血型基因分型試劑盒及RHD外顯子測序試劑盒（批號：20210401）由江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司提供，0.2M 2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，2-Me）試劑由本實驗室配制。

3 血型鑒定及DAT 全自動血型分析儀檢測血型。毛細(xì)離心管分離出患者新生紅細(xì)胞，配制成3%的紅細(xì)胞懸液，手工加入血型卡中，離心檢測ABO及Rh血型抗原，并做試管法DAT。

4 不規(guī)則抗體篩查及抗體鑒定 微柱凝膠法及鹽水試管法進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查試驗，微柱凝膠法進(jìn)行16系譜細(xì)胞抗體鑒定。0.2M二巰基乙醇（2-Me）處理RhD抗原陽性的譜細(xì)胞后，加入患者血漿進(jìn)行間接抗人球蛋白試驗，并選用處理前K抗原陽性的譜細(xì)胞加入抗-K抗體作為對照試驗。

5 吸收放散試驗 選用B型RhD抗原陰性的獻(xiàn)血者紅細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[3]以及文獻(xiàn)[4]報道的方法進(jìn)行吸收試驗。分離吸收后上清用于測定抗體效價。紅細(xì)胞洗滌后放散，吸收后放散液進(jìn)行抗體鑒定。

6 交叉配血 與B型RhD抗原陰性的獻(xiàn)血者紅細(xì)胞，分別以微柱凝膠法、試管法、聚凝胺法進(jìn)行交叉配血試驗。

7RHD基因檢測 抽取患者抗凝全血，血樣外送至江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司，按人類紅細(xì)胞RHD血型基因分型試劑盒說明書，采用熒光PCR法進(jìn)行RHD基因檢測。按RHD外顯子測序試劑盒說明書，進(jìn)行RHD外顯子測序。

結(jié) 果

1 血型鑒定及DAT 全自動血型分析儀檢測血型為B型、RhD陽性。近心端細(xì)胞柱凝集法血型鑒定為B型RhD陽性，ccEE，見表1。DAT陽性：AHG 1+，IgG 1+，C3d 1+。

表1 血型鑒定結(jié)果

2 不規(guī)則抗體篩查及抗體鑒定 抗人球蛋白卡顯示，不規(guī)則抗體篩查1號篩選細(xì)胞1+，2號篩選細(xì)胞2+，3號篩選細(xì)胞陰性。鹽水法1號、2號、3號篩選細(xì)胞均為陰性，自身陰性，見表2?；颊哐獫{及放散液抗體鑒定結(jié)果符合抗-D格局，與15號譜細(xì)胞反應(yīng)效價為8，自身對照3+s，見表3。按文獻(xiàn)[5]報道的方法，采用0.2M 2-Me處理RhD抗原陽性的譜細(xì)胞，處理后的譜細(xì)胞與患者血漿抗體反應(yīng)為陽性，對照陰性，排除抗-LW抗體[6]。

表2 不規(guī)則抗體篩查結(jié)果

表3 抗體鑒定結(jié)果

3 吸收放散試驗 吸收后放散液抗體鑒定譜細(xì)胞全為陰性，吸收后血漿抗-D抗體效價仍為8，患者血漿抗-D抗體未被RhD抗原陰性紅細(xì)胞吸收。

4 交叉配血 患者血漿與B型RhD抗原陰性的獻(xiàn)血者紅細(xì)胞進(jìn)行交叉配血試驗，鹽水法、微柱凝膠法、聚凝胺法主側(cè)均為陰性，提示主側(cè)配血相合。本次入院共輸注RhD陰性去白懸浮紅細(xì)胞4 U，血紅蛋白由32 g/L升至56 g/L，臨床提示輸注有效。

5RHD基因檢測RHD基因分型結(jié)果顯示，該患者RHD熒光分型E1-E7、E9-E10為陽性，見表4。RHD測序結(jié)果顯示，第2外顯子150T＞C雜合、178A＞C雜合、201G＞A雜合、203G＞A雜合及307T＞C雜合，該患者基因型為RHD*D-CE（2）-D/RHD*01，見表5。

表4 RHD基因分型結(jié)果

表5 RHD外顯子測序結(jié)果

討 論

基因分型是一種預(yù)測Rh表型的可靠的方法，并可以確定大多數(shù)RHD和RHCE變異等位基因以及RHD合子性[7]。RHD測序結(jié)果顯示患者基因型為RHD*D-CE（2）-D/RHD*01。RHD*01是國際輸血協(xié)會（international society of blood transfusion，ISBT）命名的標(biāo)準(zhǔn)的RHD等位基因，可表達(dá)正常的RhD抗原。RHD*D-CE（2）-D等位基因[8]，ISBT命名為RHD*03.02或RHD*DⅢb，相對于標(biāo)準(zhǔn)的RHD等位基因（RHD*01），其核苷酸改變位點為150T＞C，178A＞C，201G＞A，203G＞A，307T＞C。雖然RHD*D-CE（2）-D/RHD*01攜帶變異等位基因RHD*DCE（2）-D，但由于RHD*01的存在，仍可表達(dá)正常的D抗原。因此，患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗-D抗體為自身抗體。

嚴(yán)重的自身免疫性溶血性患者常能檢出類同種自身抗體（autoantibodies mimicking alloantibodies），簡稱為類抗體，是一種針對自身抗原的具有同種抗體特異性的自身抗體[9]。大多數(shù)類抗體是針對Rh抗原，如抗-C+e，抗-e，抗-C，抗-D。MIZUNO等[10]、陸榮等[11]、BERCOVITZ 等[12]報道RhD抗原陽性的AIHA患者，產(chǎn)生單一抗-D抗體的案例，給予輸注RhD抗原陰性的紅細(xì)胞，輸注有效。目前，對于類抗體患者是否輸注相應(yīng)抗原陰性紅細(xì)胞尚存爭議[13]，如果相應(yīng)抗原陰性的獻(xiàn)血者罕見，則難以獲得滿意配型的紅細(xì)胞。而且，選擇相應(yīng)抗原陰性的紅細(xì)胞輸注，有可能因非同型輸注而暴露于陽性抗原，進(jìn)而產(chǎn)生同種抗體。類抗體是一種自身抗體，而非同種抗體，也可選擇抗原陽性的紅細(xì)胞進(jìn)行輸注。

總之，對于檢出自身Rh抗原對應(yīng)的Rh抗體的患者，可依靠Rh血型基因分型技術(shù)，區(qū)分抗體的性質(zhì)，有助于制定合適的輸血方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突