王婷 劉宗明

(十堰市人民醫(yī)院 1富康社區(qū)醫(yī)院糖尿病科，湖北 十堰 442000；2內分泌科)

目前糖尿病的各種并發(fā)癥是導致糖尿病患者死亡的主要原因，而糖尿病腎病(DN)是糖尿病的微血管慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制復雜仍未完全闡明可能與糖代謝紊亂、炎癥反應等相關〔1〕。lncRNA可與miRNA、mRNA或蛋白質結合發(fā)揮轉錄后水平的調控，且lncRNA參與DN的發(fā)生發(fā)展，可作為其診斷和預后的新型潛在生物標志物〔2〕。如LncRNA MALAT1在DN中表達失調，并通過與β-連環(huán)蛋白的相互作用參與高葡萄糖誘導的足細胞損傷〔3〕；LncRNA ENSMUST00000147869保護腎小球系膜細胞免受DN誘導的增殖和纖維化〔4〕；而尚未見lncRNA X染色體失活特異性轉錄本基因(lncRNA XIST)在DN中的相關研究。研究表明miRNA在DN的發(fā)生及發(fā)展過程中起重要作用〔5〕。miR-30b-5p在小鼠DN模型中下調表達，過表達調控高糖誘導HK2細胞上皮間充質轉化(EMT)〔6〕。但miR-30b-5p在DN中的作用機制尚不清楚，本文旨在研究lncRNA XIST在高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷中的表達及其對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的作用，且lncRNA XIST是否通過靶向調控miR-30b-5p的表達影響高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 腎小管上皮細胞HK-2購自中國科學院上海細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自日本Takara公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海聯(lián)科生物技術有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；蛋白提取試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 腎小管上皮細胞HK-2常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細胞消化后，接種于96孔板(1×104個/孔)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后吸取原培養(yǎng)液，分別換成5.5 mmol/L(對照組)和25.0 mmol/L(高糖組)葡萄糖的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集備用。轉染組：取對數(shù)生長期HK-2細胞，用無血清培養(yǎng)基同步化12 h；將si-NC、si-XIST、miR-NC、miR-30b-5p、si-XIST+anti-miR-NC、si-XIST+anti-miR-30b-5p轉染至HK-2細胞培養(yǎng)24 h，后用25.0 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)液刺激培養(yǎng)48 h ，分別記為高糖+si-NC組、高糖+si-XIST組、高糖+miR-NC組、高糖+anti-miR-NC組、高糖+miR-30b-5p組高糖+si-XIST+anti-miR-NC組、高糖+si-XIST+anti-miR-30b-5p組。

1.2.2qRT-PCR分析miR-30b-5p及XIST mRNA表達水平 用Trizol提取總RNA，逆轉錄cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書進行qRT-PCR擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.3Western印跡檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，上樣60 μg后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5 %脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應的一抗，4 ℃孵育過夜；再加入相對應的二抗室溫孵育2 h，暗室曝光顯影、定影，分析蛋白條帶吸光度，計算蛋白表達水平。

1.2.4ELISA檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6的表達 取各組細胞上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 離心收集細胞，用結合緩沖液重懸細胞，然后加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min；上流式細胞儀檢測。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗 構建XIST 3′UTR野生型和突變型熒光素酶表達載體(WT-XIST和MUT-XIST)，將其分別與miR-NC和miR-30b-5p共轉染至HK-2細胞，依據(jù)說明書要求檢測，以熒光素酶活性和Renilla活性的比值作為細胞熒光素酶相對活性。將pcDNA、pcDNA-XIST、si-NC、si-XIST轉染至HK-2細胞，qRT-PCR分析miR-30b-5p表達水平。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1高糖對腎小管上皮細胞HK-2中l(wèi)ncRNA XIST和miR-30b-5p表達的影響 相較于對照組，高糖組腎小管上皮細胞HK-2中miR-30b-5p表達水平顯著降低，XIST mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 高糖對腎小管上皮細胞HK-2中l(wèi)ncRNA XIST和miR-30b-5p表達的影響

2.2下調XIST表達對高糖誘導的HK-2細胞炎癥因子表達的影響 相較于對照組，高糖組腎小管上皮細胞HK-2中XIST mRNA的表達水平顯著升高，相較于高糖+si-NC組，高糖+si-XIST組腎小管上皮細胞HK-2中XIST mRNA的表達水平顯著降低(均P<0.05)。相較于對照組，高糖組腎小管上皮細胞HK-2中IL-6、TNF-α的表達水平顯著升高，相較于高糖+si-NC組，高糖+si-XIST組腎小管上皮細胞HK-2中IL-6、TNF-α的表達水平顯著降低(均P<0.05)。見表2。可見，下調XIST表達抑制高糖誘導的HK-2細胞炎癥因子的表達。

表2 下調XIST表達對高糖誘導的HK-2細胞炎癥因子表達的影響

2.3下調XIST表達對高糖誘導的HK-2細胞凋亡的影響 相較于對照組，高糖組Bax表達水平顯著升高，而Bcl-2表達水平顯著降低；相較于高糖+si-NC組，高糖+si-XIST組Bax表達水平顯著降低，而Bcl-2表達水平顯著升高(均P<0.05)。相較于對照組，高糖組HK-2細胞凋亡率顯著升高，相較于高糖+si-NC組，高糖+si-XIST組HK-2細胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)。見圖1、圖2、表3?？梢娤抡{XIST表達抑制高糖誘導的HK-2細胞凋亡。

1～4:對照組，高糖組，高糖+si-NC組,高糖+si-NC組圖1 Western印跡檢測凋亡相關蛋白的表達

圖2 下調XIST對高糖誘導的HK-2細胞凋亡的影響

表3 下調XIST對高糖誘導的HK-2細胞凋亡的影響

2.4miR-30b-5p過表達對高糖誘導的HK-2細胞損傷的影響 相較于高糖+miR-NC組，高糖+miR-30b-5p組Bax表達水平顯著降低，Bcl-2表達水平顯著升高(均P<0.05)；miR-30b-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)；IL-6、TNF-α的表達水平顯著降低(P<0.05)；凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表4，圖3?？梢妋iR-30b-5p過表達抑制高糖誘導的HK-2細胞凋亡和炎癥因子的釋放，改善高糖誘導的細胞損傷。

表4 miR-30b-5p過表達對高糖誘導的HK-2細胞損傷的影響

圖3 Western印跡檢測各組Bcl-2、Bax的表達

2.5lncRNA XIST靶向調控miR-30b-5p的表達 TargetScan預測到XIST與miR-30b-5p存在結合位點，見圖4。miR-30b-5p與WT-XIST共轉染后HK-2細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而miR-30b-5p與MUT-XIST共轉染后HK-2細胞的熒光素酶活性差異不顯著。見表5。相較于pcDNA組miR-30b-5p水平(1.02±0.09)，pcDNA-XIST組顯著降低(P<0.05)；而相較于si-NC組miR-30b-5p水平(1.01±0.08)，si-XIST組(2.76±0.27)顯著升高(P<0.05)?？梢奨IST靶向調控miR-30b-5p的表達。

圖4 XIST含有與miR-30b-5p互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-30b-5p表達逆轉了下調XIST表達對高糖誘導的HK-2細胞損傷的作用 相較于高糖+si-XIST+anti-miR-NC組，高糖+si-XIST+anti-miR-30b-5p組Bax表達水平顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)；miR-30b-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)；IL-6、TNF-α的表達水平顯著升高(P<0.05)；凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖5，表6?？梢妋iR-30b-5p抑制表達逆轉了下調XIST表達對高糖誘導的HK-2細胞凋亡和炎癥因子的釋放的抑制作用，逆轉了下調XIST表達改善高糖誘導的細胞損傷。

1，2:高糖+si-XIST+anti-miR-NC組,高糖+si-XIST+anti-miR-30b-5p組圖5 凋亡相關蛋白表達

表6 抑制miR-30b-5p表達逆轉了下調XIST表達對高糖誘導的HK-2細胞損傷的作用

3 討 論

DN是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥，其發(fā)病率逐年升高，已成為危害人類的重大疾病〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA和miRNA在DN中異常表達，參與了DN的發(fā)生及發(fā)展〔8〕。lncRNA XIST是一種表觀遺傳調節(jié)因子，已發(fā)現(xiàn)其在多種癌癥中表達失調，XIST沉默通過調節(jié)miR-320/NOD2對氧化低密度脂蛋白誘導的內皮細胞損傷發(fā)揮保護作用〔9〕。lncRNA XIST在脊髓損傷小鼠脊髓組織中的表達顯著上調，抑制XIST表達可通過PI3K/AKT信號通路的再激活來抑制細胞凋亡而保護脊髓損傷〔10〕。XIST在心肌梗死后的心肌細胞中過表達，通過靶向miR-130a-3p調節(jié)心肌梗死〔11〕。lncRNA XIST可通過miR-211/CXCR4軸促進骨關節(jié)炎軟骨細胞的增殖并促進細胞凋亡〔12〕。敲除LncRNA-XIST通過Notch-1途徑抑制非小細胞肺癌中的增殖和轉化生長因子(TGF)-β1誘導的EMT〔13〕。本研究結果表明lncRNA XIST在高糖誘導的腎小管上皮細胞中表達升高，下調XIST表達可抑制細胞凋亡，保護高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷。且lncRNA XIST靶向調控miR-30b-5p的表達。

研究發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p通過靶向SOCS3穩(wěn)定缺氧誘導因子1α表達可改善缺氧/復氧誘導的腎小管上皮細胞損傷〔14〕。miR-30b-5p在腎細胞癌組織和細胞系均低表達，過表達可抑制腎細胞癌細胞系的增殖、侵襲、遷移和EMT〔15〕。缺血再灌注誘導的小鼠肝臟組織中miR-30b表達下調，miR-30b可減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷，抑制肝細胞凋亡，促進肝細胞的損傷修復〔16〕。過氧化氫處理心肌細胞可下調miR-30b的表達，miR-30b通過抑制親環(huán)素(Cyp)D可保護心臟免受缺血/再灌注損傷和減少心肌梗死范圍〔17〕。本研究結果表明在高糖誘導的腎小管上皮細胞中miR-30b-5p表達水平降低，miR-30b-5p過表達可抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡。

TNF-α主要由巨噬細胞和T細胞產生，可直接損害腎小球系膜細胞和上皮細胞，還能誘發(fā)其他炎癥因子的釋放，促進DN的炎癥過程〔18〕。研究發(fā)現(xiàn)高葡萄糖激活的巨噬細胞釋放的TNF-α可促進足細胞凋亡，而阻斷TNF-α的分泌可減弱足細胞凋亡和延緩DN進展〔19〕。IL-6是免疫反應和葡萄糖代謝的關鍵介質，IL-6受體通過抑制炎性和減少胰島素抵抗，起到延緩糖尿病腎損傷的作用〔20〕。在慢性壓迫性損傷的大鼠模型中l(wèi)ncRNA XIST高表達，XIST下調可通過降低炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6來抑制神經炎癥〔21〕。

綜上，lncRNA XIST可抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，改善高糖誘導的HK-2細胞損傷，其機制可能與miR-30b-5p的表達及炎癥因子的含量有關。