馮必鈞
(吉首大學藥學院,湖南 吉首 416000)
新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)是一種由嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)引發(fā)的傳染病,具有傳播速度快、感染性強、致死人數(shù)多等特點.COVID-19是單鏈的RNA beta冠狀病毒,其基因組編碼為結(jié)構(gòu)蛋白,非結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白[1].COVID-19的癥狀多種多樣,通常包括發(fā)燒,咳嗽,疲勞,呼吸困難以及嗅覺或味覺喪失,大多數(shù)患者(81%)感染后會出現(xiàn)輕至中度癥狀(輕度肺炎),14%患者出現(xiàn)嚴重癥狀(如呼吸困難,缺氧或影像學上肺部受累超過50%),5%患者出現(xiàn)更為嚴重的癥狀(如呼吸衰竭,休克或多器官功能障礙)[2].目前,國內(nèi)外學者還未發(fā)現(xiàn)針對COVID-19的特異性治愈方法[3].傳統(tǒng)中藥(Traditional Chinese Medicine,TCM)的臨床驗證表現(xiàn)良好,是許多嚴重疾病(如嚴重急性呼吸道綜合癥(SARS))的補充治療方法[4].許多臨床實踐結(jié)果表明,中藥在COVID-19的治療中也起著重要作用[5].連花清瘟膠囊,金花清感顆粒,血必凈注射液,清肺排毒湯,化濕敗毒方,宣肺敗毒方,簡稱“三藥三方”,均被證實對COVID-19治療有效[6].研究表明,金花清感顆??捎行Эs短COVID-19患者的核酸檢出時間,促進肺炎性滲出物的吸收[7].有學者研究了使用連花清瘟膠囊治療COVID-19的安全性和有效性,他們發(fā)現(xiàn)連花清瘟膠囊能夠改善COVID-19的臨床癥狀[8].此外,有研究證實了,血必凈注射液可有效改善重癥COVID-19患者的炎癥指標[9].清肺排毒湯是張仲景研制的中藥復方,具有抗病毒,抗炎,免疫調(diào)節(jié)和退燒等多種藥效功能,臨床證明清肺排毒湯對COVID-19有良好的治療作用.黃連(Coptischinensis)是一種在中國被廣泛用于治療腸胃炎的草藥,最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中便有記載,書中記載的黃連主要用于治療寒熱互結(jié),濕熱中陰,痞滿嘔吐等癥.2019年COVID-19爆發(fā)時,網(wǎng)傳雙黃連口服液可以治療COVID-19,但沒有確切的證據(jù).中藥黃連的成分較為復雜,因此在發(fā)揮藥效的過程中往往有多種成分共同參與其中.目前,沒有單獨用黃連治療COVID-19的相關(guān)報道,也沒有學者研究黃連治療COVID-19的作用機理,因而探尋一種全面綜合分析和解釋黃連治療COVID-19機理的方法具有重要意義.
網(wǎng)絡(luò)藥理學是利用系統(tǒng)生物學和計算機技術(shù),構(gòu)建“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò),分析藥物活性成分及靶點在網(wǎng)絡(luò)模塊中的相互作用,了解相關(guān)通路網(wǎng)絡(luò)存在的潛在機制,解釋藥物作用于人體的奧秘.分子對接能夠預測小分子配體與適當目標靶標結(jié)合位點的結(jié)合構(gòu)象,其結(jié)合行為的表征在藥物的合理設(shè)計以及闡明基本的生化過程中起著重要作用[11-12].基于此,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的方法,篩選出中藥黃連的成分,探究其治療COVID-19的潛在作用靶點及作用機制,以期為臨床上使用中藥黃連治療或輔助治療COVID-19提供理論依據(jù).
中草藥系統(tǒng)藥理學平臺(TCMSP)(https:∥tcmspw.com/tcmsp.php),Uniprot數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org/),GeneCards(https:∥www.genecards.org/),OMIM(https:∥www.omim.org/),功能蛋白聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)(STRING)數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org/),R語言軟件Rx64.4.0.3(https:∥www.r-project.org/),R語言部分插件來源于Bioconductor(https:∥www.bioconductor.org/).
利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺,結(jié)合中藥整合藥理學平臺檢索中藥黃連的所有活性成分.根據(jù)研究結(jié)果,以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)不小于30%,類藥性(drug likeness,DL)不小于0.18作為藥物化學成分的篩選條件,得到黃連的生物活性成分.用Uniprot將黃連(TCMSP數(shù)據(jù)庫中收錄)有效活性成分的靶點“蛋白名”統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“基因名”.
將“COVID-19”作為檢索詞,在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索,限定物種為“人類(Homo sapiens)”,獲得疾病的相關(guān)靶點.
使用R語言軟件取黃連活性成分作用靶點和COVID-19疾病靶點的交集,獲得藥物與疾病的共同靶點,并繪制韋恩圖.
利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物—活性成分—靶點—疾病”互作網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)圖中以“節(jié)點(node)”代表藥物、活性成分、疾病和靶點,“邊(edge)”代表以上節(jié)點之間的相互關(guān)系.使用的R包通過R和Bioconductor網(wǎng)站下載.
將藥物與疾病的共同靶點上傳至STRING11.0數(shù)據(jù)庫中,選取Multiple protein,選擇研究物種為“Homo sapiens”,構(gòu)建共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中“node”代表不同靶點,“edge”代表不同靶點之間的相互關(guān)系.所用R包通過R和Bioconductor網(wǎng)站下載.
通過R語言的“clusterProfiler”包對藥物與疾病的共同靶點進行GO分析,即對黃連作用于COVID-19的靶點進行GO功能富集分析,結(jié)果以條形圖呈現(xiàn).此外,應用R語言軟件對以上共同靶點進行KEGG通路富集分析,定義P<0.05,Q<0.05.同時根據(jù)富集因子值進一步分析核心通路的富集程度,以探究中藥黃連治療COVID-19的潛在作用機制.
從黃連的有效成分中選取標志性成分與其治療COVID-19的主要靶點進行分子對接,從RCSB數(shù)據(jù)庫(https:∥www.rcsb.org/)下載相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu),使用Pymol軟件去除其溶劑分子與配體,從pubchem數(shù)據(jù)庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載配體化合物結(jié)構(gòu),使用Auto Dockvina進行分子對接.
從TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索黃連的活性成分以及相關(guān)靶點,以O(shè)B不小于30%和DL不小于0.18作為篩選條件,篩選出黃連的活性化合物14個,見表1.TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄了黃連的成分作用靶點共596個.利用Uniprot將靶點名稱轉(zhuǎn)化為標準的基因名,剔除重復非人源以及無標準基因名的靶點,最終獲得黃連有效活性成分作用靶點235個.
表1 黃連的活性成分
通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到與COVID-19相關(guān)的基因共341個,其中GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索到COVID-19靶點基因339個,OMIN數(shù)據(jù)庫搜索到COVID-19相關(guān)靶點基因2個.
使用R軟件獲取中藥黃連的潛在作用靶點與疾病靶點之間的交集基因,得到8個藥物與疾病的互作基因(圖1),分別是EGFR,VEGFA,IL10,IL6,POR,HMOX1,PLAT,CRP.將8個互作基因定義為黃連治療COVID-19的“關(guān)鍵靶點”.
圖1 藥物與疾病靶點韋恩圖Fig.1 Venn Diagram of Drugs and Disease Targets
將獲得的黃連治療COVID-19的8個“關(guān)鍵靶點”以及藥物的活性成分導入Cytoscape 3.7.2軟件中,構(gòu)建“藥物—活性成分—靶點—疾病”互作網(wǎng)絡(luò),見圖2.在網(wǎng)絡(luò)圖中,六邊形代表藥物黃連,三角形代表黃連所含的活性成分,菱形代表疾病COVID-19,橢圓形代表藥物活性成分所作用的靶點映射到疾病的靶點,圖2中共包含節(jié)點11個,其中代表黃連活性成分的節(jié)點1個,代表作用靶點的節(jié)點10個,節(jié)點與節(jié)點之間的連線(17條邊)代表“藥物—活性成分—疾病—靶點”的作用關(guān)系.網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果表明,黃連有效成分中的槲皮素是該網(wǎng)絡(luò)中自由度最高的成分,是治療COVID-19的主要活性成分.
圖2 “藥物—活性成分—疾病—靶點”互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 "Drug-Active Ingredient-Disease-Target" Interaction Network
在STRING數(shù)據(jù)庫中導入藥物黃連作用于疾病的8個靶點基因,獲取蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,如圖3所示.圖中含有8個節(jié)點和17條互作邊,平均節(jié)點4.25,其中邊代表作用靶點之間的關(guān)聯(lián),節(jié)點代表作用靶點.在該網(wǎng)絡(luò)中,圓形節(jié)點表示藥物和疾病相互作用的靶點,每條邊代表靶點之間的靶向相互作用關(guān)系.在該網(wǎng)絡(luò)中起主導作用的核心基因是VEGFA,IL6,POR,PLAT,它們位于PPI網(wǎng)絡(luò)的中心位置.說明中藥黃連活性成分槲皮素與它們有較高的結(jié)合活性,可作為黃連治療COVID-19的潛在靶點.
圖3 黃連治療COVID-19關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 PPI Network Diagram of the Key Targets of Coptis chinensis Treatment of COVID-19
使用R軟件對黃連作用于COVID-19的靶點進行GO功能富集分析.GO富集分析發(fā)現(xiàn),有22個具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的生物過程,通過對8個交集靶點進行功能富集,以GO功能為縱坐標,以在GO上富集的基因數(shù)為橫坐標,以矯正P值(紅色的深淺)為標值,對前20個GO基因富集做GO功能富集條形圖,見圖4.由圖4可知,基因主要在生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、信號轉(zhuǎn)導受體激活劑、氧化還原酶活性(作用于成對供體,結(jié)合或還原分子氧)等功能上富集,在這些功能上富集的基因主要有VEGFA,IL6,POR,PLAT.結(jié)果表明,黃連可能主要通過VEGFA,IL6,POR,PLAT等基因調(diào)節(jié)生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合等功能進而達到治療COVID-19的目的.
圖4 黃連治療COVID-19的主要生物學過程(前20個)Fig. 4 Main Biological Process of Coptis chinensis Treatment of COVID-19 (Top 20)
KEGG通路富集分析得到34條信號通路(P<0.05),排除廣泛通路后,表2中列出了排名前20的信號通路.由表2可知,共同靶點主要富集于HIF-1信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、FoxO信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、JAK-STAT信號通路、PI3K-Akt信號通路等相關(guān)信號通路上.基因在HIF-1信號通路中富集圖見圖5(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因),此通路調(diào)節(jié)與血管生成有關(guān)的VEGF的表達,調(diào)節(jié)與血管張力有關(guān)的HMOC1的表達.基因在EGFR信號通路中的富集圖見圖6(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因),此通路調(diào)節(jié)炎性細胞因子IL6的表達,表皮生長因子EGFR的表達,調(diào)節(jié)表皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化,細胞的生長、增殖、生存和血管的生成.基因在JAK-STAT信號通路中的富集圖見圖7(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因),此通路促進細胞因子與細胞因子受體的結(jié)合,調(diào)節(jié)細胞的凋亡、生存和細胞周期.基因在FoxO信號通路中的富集圖見圖10(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因),此通路促進炎性因子IL-6,IL-10和表皮生長因子EGFR的表達,調(diào)節(jié)細胞周期,細胞的凋亡、自噬、氧化應激及DNA的修復和代謝,以此達到治療COVID-19的目的.
表2 靶點通路富集結(jié)果(前20個)
圖5 基因在HIF-1信號通路中富集圖Fig. 5 Gene Enrichment Map in the HIF-1 Signaling Pathway
圖6 基因在EGFR信號通路中的富集圖Fig. 6 Enrichment Map of Genes in the EGFR Signaling Pathway
圖7 基因在JAK-STAT信號通路中的富集圖Fig. 7 Enrichment Map of Genes in JAK-STAT Signaling Pathway
圖8 基因在FoxO信號通路中的富集圖Fig. 8 Gene Enrichment Map in FoxO Signaling Pathway
用黃連活性成分榭皮素分別與其治療COVID-19的主要靶點VEGFA,IL6,POR,PLAT對接,最佳結(jié)果如表3所示.結(jié)果表明:榭皮素與PLAT不能形成氫鍵,但能與IL6,POR和VEGFA形成氫鍵,榭皮素和VEGFA,IL6,POR,PLAT的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol,因此,它們可能在黃連治療COVID-19中起主要作用.
表3 黃連活性成分與其治療COVID-19的主要靶點蛋白的分子對接結(jié)果
本研究通過對黃連有效活性成分的挖掘,發(fā)現(xiàn)黃連中主要活性成分榭皮素為“藥物—成分—疾病—靶點”網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點,是該網(wǎng)絡(luò)中自由度最高的成分.據(jù)報道,榭皮素是一種多酚類化合物,其生理作用包括抗氧化,抗炎,抗病原和免疫調(diào)節(jié).動物和體外研究表明,榭皮素對免疫活性有影響,包括嗜中性粒細胞趨化性增強,巨噬細胞吞噬作用,NK細胞裂解活性和促有絲分裂原刺激的淋巴細胞增殖.榭皮素可調(diào)節(jié)與細胞因子產(chǎn)生有關(guān)的某些基因的表達[14].榭皮素具有抗病毒和抗菌特性,包括抑制甲型流感病毒H1N1,H3N2和抑制H5N1的侵入[16],這提示榭皮素在治療COVID-19中可能發(fā)揮著重要作用.
PPI網(wǎng)絡(luò)顯示,VEGFA,IL6,POR,PLAT位于PPI網(wǎng)絡(luò)的中心位置.說明中藥黃連活性成分與它們有較高的結(jié)合活性,這些靶點可作為黃連治療COVID-19的潛在靶點.IL-6是白介素超家族的主要成員[17],既可作為促炎性細胞因子,又可作為抗炎性肌因子[18].成骨細胞分泌IL-6以刺激破骨細胞形成.許多血管的中膜介質(zhì)中的平滑肌細胞也產(chǎn)生IL-6作為促炎性細胞因子.IL-6作為抗炎性肌動蛋白的作用是通過其對TNF-α和IL-1的抑制作用以及IL-1ra和IL-10的激活而介導的.IL-6可以用作嚴重COVID-19感染的炎性標志物[18].IL-6作為肌肉因子具有廣泛的抗炎功能[19].RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶是一種酶,在人中編碼AKT1基因.該酶屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的AKT亞家族[20].VEGF是急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征的關(guān)鍵因素,缺氧和嚴重炎癥會增加VEGF的水平,在COVID-19患者中顯著升高.VEGF的低氧上調(diào)通常通過ACE2的上調(diào)來抵抗[21].
通過對黃連有效成分作用的關(guān)鍵靶點進行生物學過程富集分析,基因主要在生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、信號轉(zhuǎn)導受體激活劑、氧化還原酶活性(作用于成對供體,結(jié)合或還原分子氧)等功能上富集,顯示黃連可能通過VEGFA,IL6,POR,PLAT等基因調(diào)節(jié)生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合等功能,進而治療COVID-19.在KEGG富集分析中,證實黃連對HIF-1信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號通路、FoxO信號通路具有調(diào)控作用.基因通過HIF-1信號通路,調(diào)節(jié)與血管生成有關(guān)的VEGF的表達,調(diào)節(jié)與血管張力有關(guān)的HMOC1的表達;通過EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號通路,調(diào)節(jié)表皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化,細胞的生長、增殖、生存和血管的生成;通過JAK-STAT信號通路,促進細胞因子與細胞因子受體的結(jié)合,調(diào)節(jié)細胞的凋亡、生存和細胞周期;通過FoxO信號通路,促進炎性因子IL-6、IL-10和表皮生長因子EGFR的表達,調(diào)節(jié)細胞周期,細胞的凋亡、自噬、氧化應激及DNA的修復和代謝,達到治療COVID-19的目的.
基因通過HIF-1信號通路治療COVID-19的可能機制是HIF-1α激活輕度缺氧條件下的信號通路,減少了ACE2和TMPRSS2的表達,并增加了表面的ADAM17水平肺泡細胞,因此降低了SARSCoV-2的侵襲性.相反,HIF-1α的蛋白質(zhì)靶標參與了嚴重的缺氧誘導的促炎細胞因子的表達激活,以及隨后的COVID-19炎癥過程和細胞因子風暴期.此外,適量的間歇性缺氧可以減輕促炎過程[22].在哺乳動物中,F(xiàn)OXO3a通過誘導DNA修復來調(diào)節(jié)細胞對應激的抵抗力,從而可能影響生物體的壽命[23].最近的研究表明,IL-6-JAK-STAT3軸與COVID-19發(fā)生的嚴重程度密切相關(guān)[24].因此,對于COVID-19的治療可以選擇從黃連的有效成分入手,探究是否可以通過某些關(guān)鍵靶點和通路發(fā)揮作用.
在此基礎(chǔ)上,本研究特別選用黃連的榭皮素分別與VEGFA,IL6,POR,PLAT對接.為了進一步合理驗證黃連治療COVID-19的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),在進行分子對接時,以結(jié)合能不超過-5.0 kJ/mol作為篩選標準,榭皮素與VEGFA,IL6,POR,PLAT的對接結(jié)合能均符合篩選標準,說明榭皮素可能直接作用于COVID-19的靶點從而治療COVID-19.
本研究黃連榭皮素與POR對接的結(jié)果與Derosa等[25]的發(fā)現(xiàn)基本一致,即榭皮素可抑制POR,榭皮素在理論上具有干擾SARS-CoV-2復制的能力.DI等[26]分子對接研究表明,槲皮素可抑制3CLpro,PLpro和S蛋白.最近有研究證實,榭皮素是一種有效的3CLpro抑制劑.迄今為止,未見有榭皮素與PLAT,VEGFA,IL6分子對接的報道,本研究首次完成了榭皮素與PLAT,VEGFA,IL6的分子對接,對接結(jié)果顯示,榭皮素與PLAT,VEGFA,IL6均有較好的對接,其結(jié)合能均在-6.4 kcal/mol以下.本研究結(jié)果為進一步研究COVID-19的靶點PLAT,VEGFA,IL6提供了理論基礎(chǔ).