劉 也，付傳君，劉 娜，李先輝，劉細寒

(1. 吉首大學藥學院，湖南 吉首 416000；2. 吉首大學醫(yī)學院，湖南 吉首 416000)

隨著全球老齡化的加劇，癡呆中的認知障礙逐漸成為對中、低收入國家經(jīng)濟、社會效益影響巨大的非傳染性疾病之一.最新的世界阿爾茨海默病報告指出，2050年全球患阿爾茨海默病的人數(shù)預計從4 600萬人增加至1.315億人.阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是認知障礙中最常見的一種類型[1]，主要患病人群是45歲以上老年人.AD可分為早期、中期和后期，早期以輕度認知功能障礙為主要表現(xiàn)；中期出現(xiàn)多種認知功能障礙，程度加重；后期出現(xiàn)嚴重的認知障礙，并伴有精神行為癥狀以及人格改變等.AD的常見癥狀是記憶力減退，患者通常會出現(xiàn)計算能力下降、認知能力下降、思維判斷能力下降、語言功能障礙、方向感缺失、生活被動、情緒變化、精神癥狀和行為改變，患者最終可能會逐漸喪失生活能力[2].

目前，臨床上用于治療AD的藥物主要包括膽堿酶抑制劑(如多奈哌齊、利斯的明、加蘭他敏、石杉堿甲等)、抗氧化劑(如維生素E等)、腦代謝激活劑(如茴拉西坦、吡拉西坦等)、谷氨酸受體拮抗劑(如鹽酸美金剛等)，但大部分藥物只能改善AD的癥狀，減緩病程進展，目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)可逆轉AD疾病進程的藥物.研究發(fā)現(xiàn)，百合花提取物具有抗AChE作用及抗氧化作用，這為抗阿爾茨海默病提供了新線索[3].

百合為百合科植物百合(Lilumbrownill)的肉質鱗莖，具有觀賞、食用、藥用價值.百合中除含有淀粉、蛋白質、脂肪及鈣、磷、鐵、維生素Bi、B2、C等常規(guī)營養(yǎng)元素外，還含有一些特殊成分，如豆甾醇、秋水仙堿等多種生物堿.中醫(yī)認為，百合味甘微苦，性微寒，具有治療情志不遂、虛煩驚悸、失眠多夢、精神恍惚等癥狀的作用[4].本研究主要通過網(wǎng)絡藥理學來研究百合化學成分是否能改善認知障礙的癥狀.

基于系統(tǒng)生物學理論的網(wǎng)絡藥理學是一門新興學科，研究者可利用網(wǎng)絡藥理學分析生物網(wǎng)絡，并從中篩選出比較感興趣的節(jié)點，進而設計多靶點藥物分子[5-6].當前網(wǎng)絡藥理學已被應用于復雜疾病的中醫(yī)藥研究，如癌癥、AD等[6-7].目前AD的發(fā)病機制及治療方法尚未完全被探明.現(xiàn)使用的藥物大多只能改善AD癥狀，但存在一定副作用，無法根治AD.目前大多數(shù)研究只探索了百合花提取物對抗阿爾茨海默病的潛在治療作用，還未探索百合對認知障礙的治療功效?；诖?，本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學方法研究百合化學成分防治認知障礙的作用機理，初步探究其抗阿爾茨海默病的主要藥效物質以及潛在的作用靶點、作用通路，以期為后續(xù)研究提供參考.

1 數(shù)據(jù)庫及對應的網(wǎng)址或軟件

本研究所使用的數(shù)據(jù)庫及對應的網(wǎng)址或軟件如表1所示．

表1 實驗使用的數(shù)據(jù)庫及對應的網(wǎng)址或軟件

2 實驗方法

2.1 構建數(shù)據(jù)庫

2.1.1 構建百合化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫 以“BAI HE”為關鍵詞，在藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)中，調節(jié)生物利用度(OB)不小于30%，類藥性(DL)不小于0.18[6]，搜索百合的化學成分，篩選出口服利用度高的化學成分作為研究對象.然后在藥品標準數(shù)據(jù)庫中，選擇人類(Homo sapiens)作為研究物種，預測得到相關的潛在作用靶點[6]，進而獲取百合化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫.最后將中藥有效成分與中藥潛在靶點整合得到百合化學成分及相關靶點數(shù)據(jù)庫.

2.1.2 構建認知障礙相關靶點數(shù)據(jù)庫 以認知障礙常用的英文表達方式“Cognitive impairment”為關鍵詞，在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)、比較毒物基因數(shù)據(jù)庫(CTD)、在線人類孟德爾遺傳(OMIM)、藥物遺傳學和藥物基因組學知識庫(PharmGkb)與藥物數(shù)據(jù)庫(DrugBank)中搜索，獲得與認知障礙相關的所有疾病靶點，刪除多個數(shù)據(jù)庫之間重復存在的基因，得到最核心的認知障礙相關基因，繪制Venn圖.

2.1.3 構建“藥物成分—疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫 分別將2.1.1節(jié)構建得到的百合生物堿化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫與認知障礙相關靶點數(shù)據(jù)庫導入到Venny 2.1.0軟件中，取兩者交集，得到“藥物成分—疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫[6].

2.2 構建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡

將2.1.3節(jié)構建得到的交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫，選取人類(Homo sapiens)為研究物種，設置置信度為0.471，以確保數(shù)據(jù)的可靠性，保存相應結果.對PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析，并按degree值分布排列.繪制PPI網(wǎng)絡圖，根據(jù)拓撲分析結果篩選核心靶點，結合TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取的成分靶點數(shù)據(jù)，Excel統(tǒng)計核心靶點關聯(lián)成分，篩選得到核心成分[8].在Cytoscape 3.7.2軟件中導入node1、node2和結合分數(shù)(Combinedscore)等信息，構建蛋白相互作用網(wǎng)絡[6].

2.3 功能與通路富集

基于DAVID和Metascape富集分析工具，選定物種為“人”(Homo sapiens)，進行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析[8].

2.4 構建“藥物成分—交集靶點—作用通路”網(wǎng)絡

將百合成分進行編號，成分對應靶點，核心靶點對應通路，構建網(wǎng)絡文件屬性文件[8]，打開DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇6.7版本，將2.1.3節(jié)得到的交集靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫中，選擇Identifier為Office gene symbol，選擇List Type為Gene list，選取人類(Homo sapiens)為研究物種，選擇Pathways下的KEGG_PATHWAY進行KEGG分析，設置閾值P<0.05，篩選排名靠前的通路，利用Omishare Tools對結果進行可視化處理[6].

2.5 分子對接

在化學數(shù)據(jù)庫(PubChem)與蛋白質數(shù)據(jù)庫(RCSB-Pdb)中檢索核心成分靶點與配體文件，使用Autodock Vina軟件對百合的核心成分與疾病預測的靶點進行分子對接[8].

3 實驗結果

3.1 構建“藥物成分—疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫

3.1.1 構建百合化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫 將篩選且去重后得到的百合中7種化學成分(表2)導入藥品標準數(shù)據(jù)庫中，選擇人類(Homo sapiens)作為研究物種，預測得到相關的潛在作用靶點465個.將7種化學成分的相關潛在作用靶點合并，去掉重復的靶點后最終得到71個百合化學成分相關潛在作用靶點.通過對“7種活性化合物—化合物靶標”網(wǎng)絡的總體特征進行分析(圖1)，本研究發(fā)現(xiàn)7種活性成分不但存在一個化合物和多個靶蛋白結合的現(xiàn)象，而且存在多個化合物和同一個靶蛋白相互作用的現(xiàn)象，表明百合抗認知障礙存在多活性成分和多靶標作用特點.

表2 百合中藥有效成分

圖1 活性化合物—化合物靶標網(wǎng)絡Fig. 1 Active Compounds - Targets Network

3.1.2 構建認知障礙相關靶點數(shù)據(jù)庫 以認知障礙常用的英文表達方式“Cognitive impairment”為關鍵詞，在GeneCards等數(shù)據(jù)庫中搜索，查找與認知障礙相關的基因.在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得百合預測作用靶點87個；在TTD，GeneCards，OMIM，DrugBank，PharmGkb數(shù)據(jù)庫中獲得認知障礙相關靶點共9 966個，去除5個數(shù)據(jù)庫中重復的靶點后，TTD數(shù)據(jù)庫中存在35個靶點，GeneCards數(shù)據(jù)庫中存在9 831個靶點，OMIM數(shù)據(jù)庫中存在16個靶點，DrugBank數(shù)據(jù)庫中存在94個靶點，PharmGkb數(shù)據(jù)庫中存在97個靶點.最后去除交集后，得到9 965個共同靶點，Venn圖見圖2.

圖2 疾病靶點交集Venn圖Fig. 2 Venn Diagram of Disease Target Intersection

3.1.3 構建“藥物成分—疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫 取3.1.1節(jié)的百合生物堿化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫與3.1.2節(jié)的認知障礙相關靶點數(shù)據(jù)庫二者交集，獲得“藥物成分—疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫(圖3).研究發(fā)現(xiàn)，認知障礙相關靶點(9 965個靶點)與7種藥物成分相關靶點(71個靶點)之間共有44個交集靶點.

圖3 藥物成分—疾病靶點Venn圖Fig. 3 Venn Diagram of Medicinal Ingredient-Disease Target

3.2 構建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡

將44個“藥物成分—疾病”交集靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫中，點擊多蛋白(Multiple proteins)，選取物種為人類(Homo sapiens)，篩選置信區(qū)間大于0.4的靶點，刪除無連線的點(點擊hide disconnected nodes in the network)，獲得由42個“藥物成分—疾病”交集靶點之間的蛋白相互作用信息構建的PPI網(wǎng)絡圖(圖4)，然后把PPI網(wǎng)絡圖導入Cytoscape 3.7.2軟件中，按照重要性排列，按照節(jié)點度值(Degree)排序，重新構建核心靶點互作網(wǎng)絡，最后篩選得到10個核心靶點，分別是MAOB(單胺氧化酶B)，SLC6A3(多巴胺轉運蛋白基因)，CASP3(半胱天冬氨酸蛋白酶3)，PTGS2(環(huán)氧合酶-2)，AR(腎上腺素能受體)，PGR(類固醇受體基因)，CASP8(天冬氨酸蛋白水解酶8)，JUN(1號染色體的基因)，ESR1(雌激素受體)和CASP9(天冬氨酸蛋白水解酶9)，見圖5.

圖4 藥物成分—疾病交集靶點的PPI網(wǎng)絡圖Fig. 4 PPI Network Diagram of Medicinal Ingredients-Disease Intersection Targets

圖5 核心靶點互作網(wǎng)絡圖Fig. 5 Network Diagram of Core Target Interaction

3.3 功能與通路富集

統(tǒng)計生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC)的GO富集分析結果，分別取GO富集結果中排名前10者，繪制GO功能富集分析組圖(橫坐標為富集的數(shù)目，縱坐標為富集的GO名稱)，顏色越紅代表富集的顯著性越高，長度越長代表相關基因越多，結果見圖6、表3.由此可知，百合治療認知障礙主要涉及的生物過程有腺苷酸環(huán)化酶-調制G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、腺苷酸環(huán)化酶-激活腎上腺素能受體信號通路、對外來刺激的反應、管徑調節(jié)等；分子功能主要涉及調節(jié)G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、突觸后神經(jīng)遞質受體活動、G蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質受體活性、神經(jīng)遞質受體的活動等；細胞成分主要包括突觸后膜、腦突觸體膜、膜筏、膜微結構域等.

圖6 GO功能富集分析組圖Fig. 6 Group Diagram of Go Function Enrichment Analysis

表3 GO功能富集結果

由KEGG通路富集分析可得，認知障礙疾病主要涉及的通路包括神經(jīng)活性配體-受體介導相互作用，神經(jīng)退行性變的多種疾病，鈣信號途徑等，富集分析結果取前30，通路氣泡富集圖見圖7，氣泡大小代表通路上富集的基因數(shù)量，氣泡越大，表明富集的基因數(shù)目越多；氣泡顏色代表LogP值，其值由大到小從紅色到藍色變化[8].

圖7 KEGG富集分析圖Fig. 7 KEGG Enrichment Analysis Diagram

3.4 分子對接驗證

將核心成分與核心靶點進行分子對接，當結合鍵能低于-5 kcal/mol時，表明活性成分與作用靶點對接結果良好，核心成分與核心靶點對接的結合最小自由能如表4所示，由于結合的最小自由能大于-10 kcal/mol才能穩(wěn)定對接，所以最終篩選出可以發(fā)生對接的化學成分僅4種(圖8)，其中豆甾醇與MAOB的分子對接模型見圖9.

表4 基因與有效成分對接的結合最小自由能

圖8 對接的百合化學成分Fig. 8 Chemical Composition of Lily Docking

圖9 豆甾醇—MAOB蛋白結合模型Fig. 9 Stigmasterol-MAOB Protein Binding Model

4 討論

經(jīng)過幾千年的臨床實踐，中醫(yī)中藥被證實了在治病、防病、養(yǎng)生上都有效可行.傳統(tǒng)上，大多數(shù)新藥的發(fā)現(xiàn)都集中在識別或設計與單個靶標特異性相互作用的藥物上，但是，作用于單個分子靶標的藥物通常在治療某些疾病(例如糖尿病，炎癥和癌癥)時效果不佳[6,9].當前藥物研究與開發(fā)已逐漸從“單一目標，單一藥物”模式轉變?yōu)椤熬W(wǎng)絡目標，多成分治療”模式，網(wǎng)絡藥理學方法已用于研究“蛋白/基因—疾病”途徑，該途徑能夠從網(wǎng)絡角度描述生物系統(tǒng)、藥物和疾病之間的復雜性，具有與中醫(yī)相似的整體哲學觀念[6-7,10].中醫(yī)網(wǎng)絡藥理學是基于網(wǎng)絡藥理學來研究中藥化學成分防治人體疾病作用機制的一種新的研究范式，旨在將中醫(yī)藥從基于經(jīng)驗的醫(yī)學轉變?yōu)榛谧C據(jù)的醫(yī)學[6].

本研究利用網(wǎng)絡藥理學對百合化學成分干預認知障礙的作用機制進行研討，以期發(fā)現(xiàn)百合中的活性成分及其潛在的抗認知障礙作用靶點及作用通路.本研究篩選得到百合的7種主要活性成分，并預測得到藥物化學成分的潛在作用靶點71個，71個潛在作用靶點中，與認知障礙相關的交集靶點共44個，即“藥物成分—疾病”交集靶點.此外，本研究發(fā)現(xiàn)，百合的7種主要活性成分與10個認知障礙關鍵核心靶標相關，并參與多種關鍵信號通路.進一步分析發(fā)現(xiàn)，百合的7種主要活性成分最有可能通過腺苷酸環(huán)化酶-調制G蛋白偶聯(lián)受體信號通路發(fā)揮抗認知障礙作用.該通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體配體的集合[11]，涉及神經(jīng)元乙酰膽堿受體(CHRNA1，CHRNA2，CHRNA3，CHRNA7)、腎上腺素能受體(ADRA1D，ADRA1A)、血清素受體(HTR2A，HTRlB)、多巴胺受體(DRD5，DRD1)等多種配體-受體信號轉導途徑，這些受體與人體的生理節(jié)律、內分泌、心血管控制、情緒、學習和記憶等功能有關.研究表明，CHRNA7其異常程度與認知功能相關[6,12]；DRD5屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，可能參與獎賞和強化機制、認知和情感以及運動的調節(jié)，這與認知障礙的發(fā)生、發(fā)展密切相關[6].除了上述通路以外，百合的7種主要藥效成分還可以通過腺苷酸環(huán)化酶-激活腎上腺素能受體信號通路、腎上腺素能受體信號通路、磷脂酶C-活化G蛋白-偶聯(lián)受體信號通路等發(fā)揮藥效作用.從構建的“藥物成分—交集靶點—作用通路”網(wǎng)絡的總體特征分析，百合化學成分抗認知障礙存在多活性成分、多靶標、多通路發(fā)揮作用的特點.通過構建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡，本研究篩選得到10種百合藥效成分抗認知障礙作用的關鍵靶點蛋白，分別是MAOB，SLC6A3，CASP3，PTGS2，AR，PGR，CASP8，JUN，ESR1，CASP9.其中MAOB是一種線粒體膜結合酶，主要分布于神經(jīng)元和膠質細胞中，在多巴胺分解代謝過程中起到關鍵作用.MAOB在將羥化的多巴胺分解為高香草酸的同時，伴有氧自由基的生成，而產(chǎn)生的氧自由基會對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用.此外，MAOB還能活化神經(jīng)毒性物質1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)，形成MPP+，MPP+是一種能誘導帕金森病的化學物質[13].因此，在帕金森病早期，使用抑制MAOB的藥物(如司來吉蘭)可減緩其疾病發(fā)展.帕金森病最大的病癥是認知障礙，位于x染色體上編碼MAOB的基因是目前研究較多的一個帕金森病的易感基因[13]，因此可以得知MAOB與認知障礙的產(chǎn)生密不可分.MAOB抑制劑可防止MAOB活化神經(jīng)毒性物質MPTP，從而減緩認知障礙進展.本研究分析“藥物成分—交集靶點—作用通路”網(wǎng)絡模型發(fā)現(xiàn)，MAOB僅可與百合的Stigmasterol(豆甾醇)產(chǎn)生相互作用，說明百合的化學成分豆甾醇可能是一種新的類固醇藥物，可用于治療神經(jīng)功能障礙.

綜上所述，百合的核心成分為豆甾醇，通過作用于核心靶點MAOB，參與調控神經(jīng)活性配體-受體介導相互作用、神經(jīng)退行性變的多種疾病、鈣信號途徑，多途徑共同發(fā)揮作用，防止MAOB活化神經(jīng)毒性物質MPTP，減緩認知障礙的病情發(fā)展，幫助治療認知障礙.

5 結語

基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接的分析結果，本研究探討了“化學成分—自由基氧化—認知障礙”之間的關系，提示百合可能通過防止MAOB活化神經(jīng)毒性物質MPTP的方式對認知障礙起到一定的治療作用.本研究借助網(wǎng)絡藥理學與分子對接的方法初步探討了百合治療認知障礙的機制，研究結果仍有不足之處，待于后續(xù)藥理實驗的進一步驗證.