核糖體蛋白調(diào)控病毒生命周期的研究進展

郭宏元，朱 杰，繆秋紅，湯傲星，戚睿斌，唐井玉，楊洪早,2，劉光清

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070）

核糖體是所有細胞中不可或缺的細胞器，在生物體中負責細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成過程，其生物學功能主要是將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，同時進行遺傳密碼的傳遞，在細胞中充當?shù)鞍踪|(zhì)的翻譯工廠[1]。核糖體由4種rRNA和80種不同類型核糖體蛋白（ribosomal protein, RPs）組成[2]。真核生物的核糖體又稱為80S核糖體，由40S小亞基和60S大亞基組成，合成蛋白質(zhì)時，大小亞基處于不斷解聚和聚合的動態(tài)平衡中。核糖體蛋白的命名與蛋白在核糖體的大小亞基有關(guān)。小亞基核糖體蛋白分別命名為S1-S31，大亞基核糖體蛋白命名為L1-L44[3]。作為核糖體主要組成成分的RPs，除了在核糖體進行生物合成階段發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用外，還參與調(diào)節(jié)細胞的多種生命活動過程，例如細胞增殖和凋亡、腫瘤發(fā)生、基因組完整性和發(fā)育等[4-5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白的功能除組成核糖體參與蛋白質(zhì)合成外，還有可能被病毒劫持，參與調(diào)控病毒的蛋白翻譯和復制等生命過程[6]。

眾所周知，病毒是依靠活細胞內(nèi)的物質(zhì)進行增殖的專性寄生生物，作為最小的病原體，其基因資源有限。在病毒感染過程中，病毒必須利用多種宿主細胞因子才能生存并產(chǎn)生新的病毒顆粒。最重要的是，隨著人們對病毒認識的不斷加深，發(fā)現(xiàn)RPs在一些病毒的生命周期中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。病毒在感染細胞后，通過“劫持”宿主細胞的內(nèi)源性翻譯途徑，從而進行自身蛋白質(zhì)的翻譯和合成，促進病毒的復制和增殖[5]。宿主細胞的翻譯系統(tǒng)則因此而受到抑制，導致宿主細胞mRNA的翻譯水平受到影響，而病毒的復制和蛋白質(zhì)的合成水平能夠持續(xù)上升；病毒利用宿主細胞的翻譯系統(tǒng)合成RPs以維持自身繁殖，這是病毒與宿主相互博弈的結(jié)果。在RPs的眾多功能中，一方面主要是依賴核糖體參與病毒蛋白的生物合成，另一方面則是獨立于核糖體調(diào)控病毒感染宿主細胞。本文就近年來有關(guān)RPs參與病毒生命活動的研究進展進行綜述，尤其是在對RPs調(diào)控病毒蛋白翻譯和復制過程的機制進行重點探討。

1 核糖體蛋白對病毒生命周期的正調(diào)控作用

1.1 核糖體蛋白與病毒內(nèi)核糖體進入位點（internal ribosome entry site, IRES）結(jié)合調(diào)控病毒蛋白翻譯真核細胞mRNA的主要翻譯起始途徑是cap依賴性的，即通過mRNA 5'cap與翻譯起始因子4E（eIF4E）結(jié)合，進而招募eIF4G和eIF4A形成cap結(jié)合復合物（eIF4F），并將40S亞單位招募到mRNA的5'末端。然而，許多病毒mRNA沒有5'cap結(jié)構(gòu)，它們利用宿主mRNA中的cap充當自身RNA合成起始引物[7]，同時，也有一些RNA病毒利用cap無關(guān)的方式募集核糖體，由病毒內(nèi)部IRES介導[8]。

IRES是病毒mRNA 5'UTR的一段較短的特征結(jié)構(gòu)元件，結(jié)構(gòu)與起始tRNA相似，它能招募核糖體蛋白從而啟動病毒蛋白的生物合成[9]。根據(jù)IRES的二級結(jié)構(gòu)不同可以將其分為四類（IRES Ⅰ-Ⅳ）（表1）[10-11]。IRES-Ⅰ是IRES結(jié)構(gòu)中最簡單的一種類型，因為它不需要任何eIFs輔助，可直接與核糖體蛋白結(jié)合并招募40S和60S亞基，從而形成功能性80S核糖體。小珀椿象腸道病毒（Plautia stali intestine virus, PSIV）、蟋蟀麻痹病毒（Cricket paralysis virus,CrPV）和陶拉綜合征病毒（Taura syndrome virus,TSV）是該類型的典型成員[10]。與IRES-Ⅰ不同的是，IRES-Ⅱ招募40S亞基則需要在eIF2、eIF3和MettRNA的參與下才能完成[10]。該類主要來自以豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）為代表的黃病毒科[12]。對于IRES-Ⅲ，這類IRES在兔網(wǎng)織紅細胞裂解物（Rabbit reticulocyte lysate, RRL）中起作用，它的翻譯始于3'端，以口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdisease virus, FMDV）和泰勒氏小鼠腦脊髓炎病毒（Theiler's Murine Encephalomyelitis virus, TMEV）為典型。IRES-Ⅳ以脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus, PV）和人鼻病毒（Rhinovirus）等為典型成員。IRES-Ⅲ和IRES-Ⅳ這兩類除了需要典型的eIFs和Met-tRNA外，還需要一種稱為IRES反式激活因子（IRES transactivating factors, ITAFs）的蛋白質(zhì)共同參與來結(jié)合核糖體[10]。雖然IRES-Ⅰ和IRES-Ⅱ在與核糖體結(jié)合時均使其構(gòu)象發(fā)生了改變[13-14]，但它們與40S亞基的結(jié)合位點不同。IRES-Ⅰ與40S亞基占據(jù)的P、E位點亞基間表面結(jié)合[14]，IRES-Ⅱ則是與40S亞基結(jié)合并占據(jù)E位點[15]。IRES-Ⅱ與40S亞基的結(jié)合由RPS5（具有β發(fā)夾結(jié)構(gòu)）調(diào)節(jié)，而不依靠RPS25[16-18]；IRES-Ⅰ則依賴于RPS25與40S亞基結(jié)合[18]，其中RPS5的功能是保證真核生物翻譯的準確性。由此看出，RPS25在病毒帽依賴性翻譯中不是必需的，但它在所有IRES介導的病毒翻譯中起著關(guān)鍵作用。利用IRES方式的病毒（如脊髓灰質(zhì)炎病毒和HCV）在缺乏RPS25的細胞中的增殖受到損害，這是因為，在招募40S亞基后，四種IRES都依賴于RPS25進行有效翻譯[18-19]。同時，RPS25可能在下游反應(yīng)中發(fā)揮作用，例如將病毒mRNA加載到40S亞基、起始密碼子的識別或60S亞基的連接。當cap依賴性翻譯啟動受阻時，人類免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1）基因組RNA的5'端可折疊成IRES以招募40S亞基并驅(qū)動病毒Gag蛋白的翻譯啟動，其中IRES的活性也依賴于RPS25[20]。RACK1作為核糖體支架蛋白，也是病毒IRES-Ⅱ介導的翻譯所必需的，RACK1與eIF3結(jié)合以組裝翻譯前起始復合物[21]。此外，研究還表明，細胞內(nèi)40S亞基的水平在促進HCV翻譯中起著關(guān)鍵作用，HCV IRES和宿主mRNA的翻譯起始對40S亞基的減少具有不同的敏感性[22]。據(jù)研究報道，RPS2（p40）、RPS3a、RPS14和RPS16可與丙型肝炎病毒的IRES相互作用[23-24]，這可能是HCV-IRES對40S亞基水平更敏感的原因之一，這些RPs在病毒RNA翻譯起始中的作用還需要進一步探索。因此，無論是通過最簡單的系統(tǒng)還是復雜的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)病毒的翻譯起始，RPs在整個過程中均起著不可替代的作用[25]。

表1 4類IRES的結(jié)構(gòu)特征Table 1 Structural features of 4 types of IRES

1.2 核糖體分流與程序化-1核糖體移碼調(diào)控病毒蛋白翻譯核糖體分流是細胞內(nèi)的病毒開啟自身翻譯的一種替代機制（圖1）[26]，在其翻譯過程中，病毒通過cap依賴的方式將40S亞基招募到RNA的5'末端。隨后，40S亞基通過掃描5'UTR或翻譯一個短的開放閱讀框（open reading frame, ORF）的方式，從原來的分流供體區(qū)（莖環(huán)結(jié)構(gòu)上游）繞過轉(zhuǎn)錄物的中間二級結(jié)構(gòu)區(qū)轉(zhuǎn)到下游受體區(qū)（莖環(huán)結(jié)構(gòu)下游），在下游受體區(qū)識別一個新的AUG從而啟動病毒蛋白的生物合成過程[27]。核糖體分流機制在病毒蛋白質(zhì)的翻譯中較為常見，其中包括水稻苔蘚桿菌型病毒（Rice tungro bacilliform virus, RTBV）、花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus, CaMV）、仙臺病毒和腺病毒等[27-30]，但其具體的調(diào)節(jié)機制尚不清楚。據(jù)報道，40S亞基固定在mRNA上主要是通過與18S rRNA的堿基配對（mRNA與18S rRNA互補配對可以反映出核糖體分流機制可能與特定的RNA結(jié)構(gòu)特征或mRNA和rRNA的相互作用有關(guān)）或與eIF3結(jié)合這兩種方式進行的[31-32]。此外，腺病毒通過核糖體分流機制進行自身翻譯，但有報道稱在RPS25缺陷的細胞中，腺病毒的這種翻譯機制受損抑制了病毒蛋白的翻譯，這表明RPS25也是核糖體分流所必需的[18]。綜上，RPS25可能在IRES和核糖體分流介導的翻譯啟始中發(fā)揮相同作用。

圖1 核糖體分流機制Fig.1 The mechanism of ribosomal shutting

程序化-1核糖體移碼（programmed -1 ribosomal frameshifting, -1PRF）也是病毒中常見的一種在翻譯水平上對蛋白質(zhì)合成進行調(diào)節(jié)的病毒翻譯機制，在蛋白質(zhì)生物合成階段，核糖體在mRNA的特定序列處從一個核苷酸位點滑向另一個核苷酸位點，使翻譯從一個ORF至下一個新的ORF不斷連續(xù)進行的過程[32]。病毒通過此種機制進行蛋白翻譯，可以從一個mRNA模板翻譯得到兩種不同的蛋白質(zhì)，從而使病毒有限的遺傳信息得以廣泛利用。其中，HIV-1通過-1PRF機制從Gag編碼mRNA表達Gag-Pol多蛋白就是一個典型例子。當HIV-1 Gag被翻譯到ORF末端時，一部分核糖體通過識別-1PRF信號將閱讀框移到-1位點，從而產(chǎn)生Gag Pol（圖2）[33-34]。Gag與Gag-Pol的比例被嚴格地保持，以便有效地組裝病毒[35-36]。近年來，HIV-1的-1PRF調(diào)節(jié)機制得到了很好的闡明。宿主因子無移位被鑒定為-1PRF的抑制劑，它與HIV-1 mRNA的-1PRF信號相互作用并翻譯核糖體，導致移碼位點的翻譯提前終止[37]。在此過程中，需要翻譯釋放因子eRF1和eRF3，以及與無移位交互的eS31（RPS27A）和uL5（RPL11），通過構(gòu)象重排和亞單位間旋轉(zhuǎn)的方式，與分別來自40S和60S亞基的兩個RPs聯(lián)合起來，從而維持無移位與核糖體和病毒RNA的結(jié)合[37]。

圖2 -1核糖體移碼機制[33-34]Fig.2 The mechanism of -1 ribosomal frameshifting (-1PRF)

1.3 核糖體蛋白通過與病毒蛋白相互作用促進病毒的復制迄今為止，有大量研究報道病毒蛋白（結(jié)構(gòu)蛋白或者非結(jié)構(gòu)蛋白）與多種RPs存在一定的相互作用，例如牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）和CSFV的N末端蛋白酶（Npro），就有26種RPs與之相互作用[38]，煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus, TEV）的P1與煙草中的17種RPs相互作用[39]。當然，核糖體蛋白和病毒蛋白相互作用的意義還有待進一步確認?？傮w來說，其功能可分為三類：（1）核糖體蛋白促進病毒的翻譯。Sin-nombre漢坦病毒（Sin-nombre hantavirus, SNV）中核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein, N）與RPS19相互作用，其調(diào)控翻譯機制的核心組成部分是由N介導的，具體過程是N蛋白通過RPS19與40S核糖體亞基結(jié)合，從而調(diào)節(jié)病毒的翻譯[40]。SNV-N可以通過與RPS19相互作用，與40S亞基、mRNA cap和未磷酸化的eIF2結(jié)合形成43S預起始復合物，取代eIF4F復合物直接介導病毒mRNA翻譯起始[41-42]。RPL18也是細胞內(nèi)參與病毒翻譯過程的一個關(guān)鍵核糖體蛋白，它可以與許多病毒蛋白相互作用。在CaMV生命周期中，病毒P6蛋白與來自宿主擬南芥健康葉片和感染葉片中的多個核糖體蛋白相互作用，表明這些核糖體蛋白參與了病毒的翻譯過程[43]。Leh等[45]進一步研究發(fā)現(xiàn)擬南芥的RPL18與CaMV的P6相互作用是在多個RPs和eIF3組成的復合物中完成的，并且這種相互作用是CaMV翻譯激活所必需的[43-44]。水稻條紋病毒（Rice stripe virus, RSV）核衣殼蛋白（N）是RSV核糖核蛋白顆粒（RNPs）的主要成分，在RSV感染期間，RPL18的表達雖然沒有改變，但N蛋白與RPL18相互作用結(jié)果表明，敲除RPL18基因，病毒RNA和蛋白水平顯著降低，其中病毒蛋白表達下降更明顯，這表明RPL18能夠促進RSV的翻譯和復制。該發(fā)現(xiàn)與Cervante-Salazar等[46]的研究結(jié)果，即登革熱病毒（Dengue virus，DENV）NS1與人肝細胞RPL18的相互作用具有相似的意義。綜上所述，RPL18能夠上調(diào)病毒蛋白的翻譯水平，進而促進病毒的感染過程。（2）核糖體蛋白參與病毒組裝和復制。RPL7作為HIV-1 Gag輔助因子，具有強大的DNA/RNA伴侶活性，Gag NC與RPL7的相互作用證明了RPL7有助于Gag介導的病毒顆粒的組裝[47]。RPL9也是Gag蛋白的伴侶分子，它作為核糖體大亞基的一種重要成分，RPL9與小鼠乳腺腫瘤病毒（Mouse mammary tumor virus, MMTV）Gag蛋白在核仁中進行相互作用，這種相互作用對病毒粒子的組裝起到調(diào)節(jié)作用[48]。在許多情況下，RPs要行使一些功能主要是通過核糖體外的特定定位來開展，如RPL22由核仁向核質(zhì)轉(zhuǎn)運進入細胞核后，與HSV-1 ICP4相互作用，這種相互作用對病毒DNA的合成和晚期基因表達有調(diào)控作用[49]。（3）作為病毒受體。例如RPS2（RPSA）是一種具有層粘連蛋白受體功能的核糖體蛋白，它可以與DENV和黃熱病病毒（Yellow fever virus, YFV）的包膜蛋白E結(jié)合[50]。

2 核糖體蛋白對病毒生命周期的負調(diào)控作用

截至目前，對RPs正向調(diào)節(jié)病毒感染的報道多于RPs對病毒復制的負調(diào)節(jié)。Cardinali等[51]早期發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒感染細胞后會使大多數(shù)宿主蛋白的合成受到抑制，而細胞則可以用翻譯RP mRNA和RPS6磷酸化的方式來抵抗病毒對細胞的侵害。RPs發(fā)揮抗病毒機制的方式主要有以下兩種。第一種是RPs通過與病毒蛋白相互作用，從而直接使病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄或翻譯受到抑制。例如，RPL9與狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）的磷蛋白（phosphoprotein,P）相互作用，P作為病毒RNA聚合酶的一個重要輔助因子，在相互作用的過程中RPL9從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)。過表達RPL9、RABV的復制受到抑制；敲低RPL9，RABV的復制水平升高。這說明RPL9與RABV P蛋白相互作用抑制了RABV轉(zhuǎn)錄的初始階段[52]。第二種是RPs（作為免疫因子）通過激活抗病毒防御信號通路抑制病毒的復制。例如， CSFV的Npro蛋白與核糖體蛋白S20（uS10）相互作用，過表達uS10，CSFV的復制受到抑制；敲低uS10，則CSFV的復制水平升高。其中，uS10主要通過調(diào)節(jié)Toll樣受體3（Toll-like receptors 3, TLR3）來抑制細胞中CSFV的復制，TLR3通過激活免疫應(yīng)答途徑，從而調(diào)節(jié)CSFV感染過程中先天性抗病毒免疫反應(yīng)[53]。在雙子病毒（Geminivirus）核穿梭蛋白（NSP）相互作用激酶（NIK）介導的植物抗病毒防御途徑中，RRL10充當抗病毒信號的直接下游效應(yīng)器，其中RRL10-NIK的特異性相互作用和底物磷酸化，并重定向到細胞核以調(diào)節(jié)病毒感染[54-55]。這是一種新的植物細胞防御病毒的策略。

3 利用核糖體蛋白對病毒復制的調(diào)控作用開發(fā)新型藥物

RPs具有抗病毒作用，可以將其應(yīng)用到治療病毒性疾病上，將其作為靶點具有一定的應(yīng)用潛力。核糖體失活蛋白（ribosome inactivating protein, RIPs）是RNA N-糖苷酶，它通過選擇性修飾大的rRNA分子和失活核糖體以抑制蛋白質(zhì)的合成，從而達到抗病毒活性的效果[56]。由于核糖體的非特異性失活，許多RIPs對真核細胞具有很強的毒性[57]，這也限制了RIPs在抗病毒治療中的應(yīng)用。

在各種病毒的生命周期中，有許多RPs在其中發(fā)揮了很重要的調(diào)控作用，為設(shè)計小分子抗病毒藥物提供了潛在靶點，尤其像RPS25、RPS27、RPLP1、RPLP2、RPL3和RPL18值得多加關(guān)注，它們在核糖體維持細胞周期的功能中并非必需RPs。在這些非必需的RPs中，RPS27調(diào)控病毒范圍廣，因為它對致命的IV-A、DENV、HCV和Sindbis病毒的感染具有調(diào)控作用，因此可選作潛在靶點[58]。目前，以這些RPs為靶點的抗病毒治療的發(fā)展還不夠，但吡啶酸（PA）和鐮刀菌酸（fusaric acid, FU）是抗腫瘤藥物成功的例子，它們通過破壞RPS27的ZFP結(jié)構(gòu)并使其失活，從而對一系列DNA和RNA病毒表現(xiàn)出有效的抗病毒和預防作用[58]。此外，許多病毒編碼含有病毒復制蛋白的ZFP，如HIV-1np7、HSV-1icpo、IVA-M1和HCV-NS2等，而PA和FU能夠破壞病毒必需的ZFP，致使病毒失活[58]，增強了PA和FU的抗病毒作用。RPS25通過控制病毒IRES和核糖體分流介導的翻譯，RPL18具有多種病毒調(diào)節(jié)作用，這些調(diào)控作用為這兩種RPs在抗病毒應(yīng)用方面提供了很大的可能。RNAi和CRISPR/Cas9策略是靶向RP基因的有效途徑，對于潛在的RPs靶點，盡管在實驗中通過缺失的方式對核糖體的基本功能影響不大，但在應(yīng)用中，最好選擇敲低和抑制這些RPs而不是敲除或突變，這是由RPs在細胞中的多樣性決定的，任何RP的缺失和突變都可能導致細胞對生理和非病毒性病理刺激的異常反應(yīng)。目前RPs相關(guān)研究仍處于早期階段。

4 小結(jié)

綜上所述，細胞內(nèi)RPs在病毒生命周期中發(fā)揮重要的調(diào)控作用（圖3）。了解核糖體蛋白調(diào)節(jié)病毒復制過程與機制，對于深入理解病毒的生命過程及規(guī)律有很大幫助。雖然這方面的研究成果還不是很多，但是其在病毒感染和復制過程中的作用越來越受到人們的關(guān)注。此外，隨著人們對RPs調(diào)控病毒生命周期的新機制不斷被發(fā)現(xiàn)，也為研發(fā)針對一些以RPs為靶標的新型抗病毒藥物提供了新的線索。

圖3 核糖體蛋白在病毒生命周期中的作用Fig.3 The role of ribosomal proteins in the life cycle of viruses