尤夢(mèng)瑤, 閆佳佳, 萬(wàn) 璐, 吳 桐, 鄭春英

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心, 哈爾濱 150080;2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高等學(xué)校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150080;3.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150080)

0 引 言

黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.Mongholicus (Bge.) Hsiao)或膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.)的干燥根[1]，含有黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)和多糖等多種活性成分[2]，具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒性心肌炎和降血糖等作用[3]，是既食又藥的功能性保健食品[4]，深受人們喜愛(ài)。

近年來(lái)，對(duì)黃芪內(nèi)生菌的研究報(bào)道[5-6]越來(lái)越多，但是這些報(bào)道大多局限在對(duì)黃芪內(nèi)生菌的分離和鑒定方面，對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道。本文選取分離自黃芪根部的內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8(Baci-llussubtilis)為研究對(duì)象，作為典型工業(yè)模式微生物[7]，枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)是中國(guó)農(nóng)業(yè)部和美國(guó)食品藥物管理局(FDA)認(rèn)定的安全菌株[8-9]，含有內(nèi)酯類(lèi)、多肽、萜類(lèi)、異香豆素類(lèi)、生物堿類(lèi)和有機(jī)酸[10]等活性物質(zhì)，具有抗腫瘤[11]、抗菌[12]、抗炎[13]和抗?jié)僛14]等活性作用，在藥品生產(chǎn)[15]和食品發(fā)酵[16]等方面被廣泛應(yīng)用。本文對(duì)黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8(B.subtilis)發(fā)酵液中的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，旨在深入開(kāi)發(fā)利用該菌株，為其次生代謝產(chǎn)物的獲取及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1儀器與試劑

高效液相色譜儀(FL2200，浙江溫嶺福立分析儀器有限公司)；超聲波清洗器(KQ-100DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈和甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.2供試菌

內(nèi)生細(xì)菌HS8分離自黑龍江省大興安嶺地區(qū)野生黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)根，委托上海生工生物工程股份有限公司鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，現(xiàn)保藏于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutrient agar, NA)和營(yíng)養(yǎng)肉湯(Nutrient broth, NB)培養(yǎng)基：見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8的抗菌活性分析

(1) 發(fā)酵液的制備

將內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8接種于NA培養(yǎng)基，恒溫活化培養(yǎng)(37 ℃，3 d)，取活化后的內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8，制備1×107CFU·mL-1的種子液(制備方法：在無(wú)菌條件下接種于60 mL的NB培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r·min-1，3 d)；以5%接種量將內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8的種子液接種到300 mL的NB培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)(37 ℃，120 r·min-1，5 d)，過(guò)濾，即得發(fā)酵液。

(2) 黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8的抗菌活性分析

取發(fā)酵液，減壓濃縮至100 mL，采用乙酸乙酯萃取(3×100 mL)，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，凍干。取凍干粉5 mg，以10 mL甲醇溶解，作為濃度為500 μg·mL-1的供試品液；以鏈霉素溶液和制霉菌素溶液(0.1 mg·mL-1)作為陽(yáng)性對(duì)照，甲醇溶液作為溶劑對(duì)照。參閱文獻(xiàn)[18]，采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液進(jìn)行抗菌活性的測(cè)定。

1.2.2黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8的次生代謝物分析

(1) 液相色譜條件

Venusil XBP-C18柱(φ4.6 mm×250 mm，5 μm，USA)；流動(dòng)相①：甲醇-水-冰醋酸(50∶49.7∶0.3)；流動(dòng)相②：甲醇-水-冰醋酸(30∶69.5∶0.5)；流動(dòng)相③：乙腈-水(92.5:7.5)；流動(dòng)相④：甲醇-水(50∶50)；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

(2) 對(duì)照品及對(duì)照藥材液的制備

分別精確稱(chēng)取適量的原兒茶酸、阿魏酸和β-谷甾醇對(duì)照品，加入色譜級(jí)甲醇，分別制成0.2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液；分別稱(chēng)取黃芪根和黃芪莖干粉各10 g，加入100 mL甲醇，超聲提取1 h，過(guò)濾后于50 ℃減壓濃縮至10 mL，即得黃芪對(duì)照藥材液。

(3) 供試品液的制備

采用1.2.1的方法制備發(fā)酵液，依次采用氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇進(jìn)行萃取(3×100 mL)，合并萃取液，低溫濃縮后，分別溶于10 mL色譜級(jí)甲醇，即得內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液氯仿萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水飽和正丁醇萃取部位。

取10 L HS8發(fā)酵液緩慢通過(guò)D101大孔樹(shù)脂柱(控制流速)，采用乙醇梯度洗脫(乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為：30%、50%、70%和90%)，收集不同洗脫餾分，對(duì)不同洗脫餾分進(jìn)行活性成分分析。

1.2.3黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產(chǎn)物分離

根據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行有目的的分離。

選取1.2.2(3)中30%乙醇洗脫部位進(jìn)行聚酰胺柱分離，采用氯仿∶甲醇(10∶1)洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測(cè)跟蹤，合并20～70號(hào)組分，回收溶劑，進(jìn)行硅膠柱色譜分離，采用氯仿∶甲醇(2∶1)洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測(cè)跟蹤，合并100～127號(hào)組分，回收溶劑，重結(jié)晶，得化合物A。

選取1.2.2(3)中90%乙醇洗脫部位進(jìn)行聚酰胺柱分離，依然采用乙醇梯度洗脫，隨行TLC檢測(cè)跟蹤，取90%乙醇洗脫部位濃縮近干后進(jìn)行硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測(cè)跟蹤，合并25～36號(hào)組分，回收溶劑，重結(jié)晶，得化合物B。

選取1.2.2(3)中乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測(cè)跟蹤，合并125～190號(hào)組分，回收溶劑后進(jìn)行硅膠柱色譜純化，采用石油醚：乙酸乙酯(1∶2)洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測(cè)跟蹤，合并17～30號(hào)組分，重結(jié)晶，得化合物C。

2 結(jié)果分析

2.1 黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8的抗菌活性分析

對(duì)黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性篩選，結(jié)果如表1所示。由表1可知，黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液對(duì)11種供試細(xì)菌以及供試真菌均有不同程度的抑制作用，陰性對(duì)照的甲醇無(wú)干擾，且抑菌譜廣，尤其對(duì)肺炎克雷伯菌、銅綠假單孢菌和短小芽孢桿菌的抑制效果最為顯著，抑菌圈直徑分別達(dá)到(20.8±0.1)、(20.7±0.3)和(20.5±0.1) mm，對(duì)糞腸球菌的抑制效果也較為明顯，抑菌圈直徑達(dá)到(19.3±0.1) mm。上述結(jié)果表明，黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液具有較好的抗菌活性，可應(yīng)用于抗菌劑的開(kāi)發(fā)。

表1 HS8發(fā)酵液抗菌活性結(jié)果(mm)

對(duì)黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液的水飽和正丁醇、乙酸乙酯以及氯仿萃取部位中的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液的水飽和正丁醇、乙酸乙酯以及氯仿萃取部位中均含有多種次生代謝產(chǎn)物，其中，乙酸乙酯萃取部位含有的活性成分較多；以黃芪莖和根生藥為對(duì)照，內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8的乙酸乙酯萃取部位在保留時(shí)間為10 min和17 min時(shí)出現(xiàn)與黃芪生藥相同的色譜峰。因此，選取黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的分離。

2.2 黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8的次生代謝產(chǎn)物分析

注： A：黃芪根樣品；B：黃芪莖樣品；C：NB空白對(duì)照；D：HS8水飽和正丁醇萃取部位；E：HS8乙酸乙酯萃取部位；F：HS8氯仿萃取部位圖1 黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8不同萃取部位次生代謝產(chǎn)物分析Fig.1 Analysis of secondary metabolites in different extracted parts of endophytic Bacillus subtilis HS8

對(duì)1.2.2(3)中的30%乙醇洗脫部位采用1.2.2(1)中流動(dòng)相②進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物分析，結(jié)果如圖2所示，對(duì)1.2.2(3)中90%乙醇洗脫部位1.2.2(1)中流動(dòng)相③進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物分析，結(jié)果如圖3所示。由圖2可以看出，30%乙醇洗脫部位中在與原兒茶酸對(duì)照品相同的保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)相同的色譜峰。由圖3可以看出，90%乙醇洗脫部位在與β-谷甾醇對(duì)照品相同的保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)相同的色譜峰，并且空白培養(yǎng)基無(wú)干擾。說(shuō)明在30%乙醇洗脫部位及90%乙醇洗脫部位中分別含有原兒茶酸及β-谷甾醇，可以針對(duì)這些活性部位有目的的進(jìn)行分離純化。此外，對(duì)1.2.2(3)中50%及70%乙醇洗脫部位中次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，尚未檢測(cè)到已知化合物。

注：A：原兒茶酸對(duì)照品；B：D101大孔樹(shù)脂柱30%乙醇洗脫部位；C：NB空白對(duì)照

elution fraction 注：A：β-谷甾醇對(duì)照品；B：D101大孔樹(shù)脂柱90%乙醇洗脫部位；C：NB空白對(duì)照

2.3 黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產(chǎn)物分離

從黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8中分離得到3個(gè)化合物。

化合物A：白色針狀結(jié)晶，易溶解于甲醇、乙醇和氯仿等有機(jī)溶劑。以原兒茶酸為對(duì)照品，選用1.2.2(1)中流動(dòng)相②，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)化合物A進(jìn)行HPLC分析，并對(duì)其純度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4和圖5所示。由圖可知，化合物A為純度較高的單一化合物，純度為99.48%，與原兒茶酸對(duì)照品混合后出現(xiàn)單一色譜峰，說(shuō)明化合物A可能為原兒茶酸，因此采用1H-NMR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。

圖4 化合物A的高效液相色譜圖

圖5 化合物A與原兒茶酸混合的高效液相色譜圖

化合物A的1H-NMR鑒定結(jié)果：1H-NMR(400 MHz，MeOD)：δ7.43(1H，s，H-2)，7.41(1H，d，J=1.9 Hz，H-6)，6.83(2H，dd，J=8.0 Hz，H-5)，苯環(huán)上有3個(gè)取代基，上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的原兒茶酸一致，綜合TLC、HPLC和1H-NMR分析結(jié)果，確定化合物A為原兒茶酸。

化合物B：白色結(jié)晶，難溶解于甲醇，易溶于氯仿。以β-谷甾醇為對(duì)照，選用1.2.2(1)中流動(dòng)相③，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)化合物B進(jìn)行HPLC分析，并對(duì)其純度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6和圖7所示。由圖可知，化合物B為純度較高的單一化合物，純度為98.21%，與β-谷甾醇對(duì)照品混合后出現(xiàn)單一色譜峰，說(shuō)明化合物B可能為β-谷甾醇，因此采用1H-NMR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。

圖6 化合物B的高效液相色譜圖

圖7 化合物B與β-谷甾醇混合的高效液相色譜圖

化合物B的1H-NMR鑒定結(jié)果：1H NMR (400 MHz，MeOD):δ5.34 (1H，s，H-6 )，1.02 (2H，s，H-19 )，0.95 (2H，d，J=6.4 Hz，H-21)，0.86 (3H，dd，J=15.5，7.8 Hz，H-26)，0.72 (1H，s，H-18)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的β-谷甾醇一致，綜合TLC、HPLC和1H-NMR分析結(jié)果，確定化合物B為β-谷甾醇。

化合物C：透明針狀結(jié)晶，微溶于氯仿，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑。以阿魏酸為對(duì)照，選用1.2.2(1)中流動(dòng)相④，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)化合物C進(jìn)行HPLC分析，并對(duì)其純度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖8和圖9所示。由圖可知，化合物C為純度較高的單一化合物，純度為98.57%，與阿魏酸對(duì)照品混合后出現(xiàn)單一色譜峰，說(shuō)明化合物C可能為阿魏酸，因此采用1H-NMR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。

圖8 化合物C的高效液相色譜圖

圖9 化合物C與阿魏酸混合的高效液相色譜圖

化合物C的1H-NMR鑒定結(jié)果：1H-NMR (400 MHz，MeOD)：δ7.59 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.18 (1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，7.06 (1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-6)，6.81 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.31 (1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.89 (s，3-OCH3)。由1H-NMR數(shù)據(jù)分析可得，化合物C中存在反式烯烴，苯環(huán)為1′，3′，4′取代，4′取代基為—OCH3。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的阿魏酸一致，綜合TLC、HPLC和1H-NMR分析結(jié)果，確定化合物C為阿魏酸。

化合物A～C結(jié)構(gòu)如圖10所示。

圖10 化合物A～C的結(jié)構(gòu)

3 討 論

眾所周知，植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物豐富，是新型次生代謝產(chǎn)物資源[22]。通常，內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物含量較低，這為其研究帶來(lái)很大困難。為了避免分離的盲目性，基于植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性成分的理論，選取抑菌活性較好的黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8為研究對(duì)象，采用HPLC法對(duì)其發(fā)酵液中可能存在的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，并與黃芪生藥進(jìn)行對(duì)比分析。在分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，有針對(duì)性地設(shè)計(jì)次生代謝產(chǎn)物分離工藝，分離得到3個(gè)具有較好抗菌活性、且與宿主植物黃芪相同的次生代謝產(chǎn)物。其中化合物A為原兒茶酸，該化合物是一種在植物界中分布廣泛的天然酚酸，具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等活性作用[23]，同時(shí)，該化合物也是川芎嗪等合成藥物的前體物質(zhì)[24]；化合物B是β-谷甾醇，β-谷甾醇是一種常見(jiàn)的植物固醇類(lèi)化合物[25]，在抗炎、抗癌和降血糖等方面均表現(xiàn)出優(yōu)異的生物活性[26]；化合物C為阿魏酸，阿魏酸是一種廣泛存在于植物中的有機(jī)酸，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集、抗氧化、抗菌消炎和抗紫外線(xiàn)輻射等作用[27]，因其幾乎沒(méi)有毒副作用，所以具有較高的藥用價(jià)值[28]。

盡管已從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分離出多種次生代謝產(chǎn)物，但從枯草芽孢桿菌中分離、純化原兒茶酸(A)、β-谷甾醇(B)及阿魏酸(C)的研究未見(jiàn)報(bào)道。上述研究豐富了枯草芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物庫(kù)，為發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ)。因此，內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8是一株具有深入開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值的內(nèi)生枯草芽孢桿菌。此外，在內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產(chǎn)物的分離過(guò)程中，也分離得到了多種其他化合物，但得率較低，不能進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。后續(xù)將針對(duì)黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產(chǎn)物分離過(guò)程中存在的各種問(wèn)題進(jìn)行相應(yīng)的研究，為提高內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

在黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液中，既含有與宿主植物黃芪相同/相似的次生代謝產(chǎn)物，也存在大量不同的次生代謝產(chǎn)物，說(shuō)明黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8不僅為黃芪次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌，也可以作為目的菌株進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)其他活性代謝物。因此，黃芪內(nèi)生枯草芽孢桿菌HS8是一株值得深入開(kāi)發(fā)應(yīng)用的枯草芽孢桿菌。