侯辰蕊 陳東科 戎建榮 李亞楠 周永年 栗子洋 董怡然,*

(1 山西白求恩醫(yī)院(山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院 同濟(jì)山西醫(yī)院)，山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，太原 030032；2 衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730)

耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌(carbapenem-resistant Gram-negative bacillus)已造成全球流行，并持續(xù)增長。世界衛(wèi)生組織(WHO)將腸桿菌目細(xì)菌列為ESKAPE(耐萬古霉素屎腸球菌、 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐碳青酶烯肺炎克雷伯菌、耐碳青酶烯鮑曼不動桿菌、耐碳青酶烯銅綠假單胞菌、耐碳青酶烯腸桿菌)中一種，被認(rèn)為是醫(yī)院感染的主要原因之一。2017年將碳青霉烯類耐藥腸桿菌目(CRE)細(xì)菌、碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌(CRPA)和碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌(CRAB)列為最高危級別[1]。為了應(yīng)對全球流行，盡早識別并持續(xù)監(jiān)測耐碳青霉烯革蘭陰性菌非常重要。有證據(jù)表明，感染碳青霉烯耐藥菌的患者比感染敏感菌的患者發(fā)病率和死亡率更高[2]，而多數(shù)原因是由于使用的抗生素對這些病原菌活性不佳或無活性所致[3]。因此，認(rèn)識到碳青霉烯耐藥的風(fēng)險(xiǎn)和早期確定碳青霉烯耐藥機(jī)制是降低死亡率、住院時(shí)間和治療成本的關(guān)鍵因素[4-6]。陰溝腸桿菌是一種條件致病菌且已出現(xiàn)多重耐藥，作為醫(yī)院感染的重要病原菌給臨床治療和醫(yī)院感染控制帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。本研究主要調(diào)查山西白求恩醫(yī)院(以下簡稱“本院”)2017—2020年臨床分離耐碳青霉烯陰溝腸桿菌的臨床分布、耐藥率、產(chǎn)碳青霉烯酶表型、耐藥基因檢出及傳播情況等，為臨床患者感染的診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集本院2017年1月至2020年9月臨床分離陰溝腸桿菌531株，經(jīng)過質(zhì)譜儀鑒定復(fù)核菌種，根據(jù)2020年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)判斷標(biāo)準(zhǔn)和臨床藥敏報(bào)告篩選耐碳青霉烯陰溝腸桿菌33株(剔除同一患者同一部位重復(fù)分離菌株)。

1.2 儀器與試劑

全自動快速生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)MALDI-TOF(美國Bruker, MicroflexLT/SH B)；全自動微生物分析儀Vitek2(法國生物梅里埃)；PCR擴(kuò)增儀(杭州Bioter,TC96/G/H)；電泳儀(Major Sciene/MINI-300)；凝膠像儀(AlphalmagerHP，Proteinsimple)。引物(由北京博邁德生物公司合成)；2×TaqPCR MasterMix(北京博邁德生物公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(北京博邁德生物公司)；10 μg美羅培南藥敏紙片(Oxoid公司)；血平板(鄭州安圖，批號2020040501)；質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922；質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC35218；受體菌大腸埃希菌EC600、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705和肺炎克雷伯菌ATCCBAA-2146由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院周冬生教授惠贈。

1.3 菌株鑒定及藥物敏感試驗(yàn)

將篩選出的菌株用血平板傳代后置于35℃培養(yǎng)18～24 h，用質(zhì)譜儀鑒定菌種并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。使用E-test條和MH平板復(fù)核藥敏試驗(yàn)結(jié)果，大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.4 碳青霉烯酶表型及耐藥基因檢測

1.4.1 MALDI-TOF檢測碳青霉烯酶活性特征性蛋白

配置亞胺培南抗生素溶液(終濃度0.5 mg/mL)20 μL。用1 μL接種環(huán)取過夜孵育的待測菌株一環(huán)，均勻懸浮于含有亞胺培南抗生素溶液的離心管中，37℃孵育20 min，14000 g離心2 min。取孵育后的抗生素溶液上清1 μL至MSP靶板上，自然晾干后覆蓋1 μL基質(zhì)溶液，晾干上機(jī)檢測?；|(zhì)溶液為空白對照手動模式采集質(zhì)譜圖(激光頻率60 Hz，單次激光照射次數(shù)為40)。保存并導(dǎo)入FlexAnalysis軟件分析。

1.4.2 mCIM及eCIM改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)

根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)中改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)操作流程，進(jìn)行mCIM及eCIM改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)。35℃生化培養(yǎng)箱孵育18～24 h后測量抑菌圈直徑判讀結(jié)果。肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705為產(chǎn)絲氨酸酶陽性對照菌，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-2146為產(chǎn)金屬酶陽性對照菌。此試驗(yàn)不適用于僅耐厄他培南菌株。

1.4.3 耐藥基因檢測

挑取一定量的新鮮菌落(傳代24 h內(nèi))懸濁于500 μL無RNA酶純水中，沸水浴15 min后，10000 r/min離心10 min，吸取上清液作為模板于-20℃以下保存?zhèn)溆?。配置PCR體系：1 μL上下游引物、2 μL DNA模版、13 μL MasterMixPCR和8 μL無RNA酶的純水。PCR反應(yīng)條件為95℃ 2 min、95℃ 30 s、退火30 s、72℃ 1 min，20個(gè)循環(huán)后72℃ 2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為80 V，電流為100 mA。電泳完畢后置于凝膠成像儀成像，檢測是否有目的條帶。PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送北京博邁德生物公司純化后雙向測序，序列經(jīng)BLAST比對分析，以明確耐藥基因型。肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705為KPC陽性對照菌，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-2146為NDM陽性對照菌。

1.5 多位點(diǎn)序列分型(MLST)及同源性分析

1.5.1 MLST分型

PCR擴(kuò)增33株陰溝腸桿菌七對管家基因(dnaA、fusA、gyrB、leuS、pyrG、rplB和rpoB)序列(表2)。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min、95℃ 30 s、退火30 s、72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)后72℃ 5 min。將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物送至北京博邁德生物公司進(jìn)行測序，序列在MLST網(wǎng)站比對確定管家基因的等位基因序號，進(jìn)一步確認(rèn)菌株的ST型別。

表2 7對管家基因引物序列Tab.2 Seven pairs of housekeeper gene primer sequences

1.5.2 同源性分析

將所有菌株的7個(gè)基因位點(diǎn)的編號錄入BioNumerics(Version 8.0，Applied Maths，Belgium)軟件，用Categorical法計(jì)算相似性系數(shù)，用UPGMA方法構(gòu)建聚類樹，使用MST方法構(gòu)建最小生成樹。

1.6 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

以利福平耐藥大腸埃希菌EC600為受體菌(利福平750 μg/mL)，供體菌為待檢陰溝腸桿菌(亞胺培南100 μg/mL)搖菌過夜。次日各取4 mL混合37℃孵育12～18 h，吸取100 μL混合菌液涂布于新的LB平板上(含利福平750 μg/mL和亞胺培南100 μg/mL)37℃過夜孵育篩選陽性接合子。通過MALDI-TOF鑒定接合子是否為大腸埃希菌，藥敏實(shí)驗(yàn)檢測耐藥表型，PCR檢測基因是否在接合子中存在，驗(yàn)證接合轉(zhuǎn)移是否成功。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取接合子中的質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行測序后進(jìn)行比對分析。

表1 耐碳青霉烯基因引物序列Tab.1 Primer sequence of carbapenem resistant gene

2 結(jié)果

2.1 耐藥菌株分布及藥物敏感試驗(yàn)

篩選菌株顯示本院檢出耐碳青霉烯陰溝腸桿菌逐年遞增，2017年檢出1株，2018年檢出2株，2019年檢出7株，2020年檢出23株。33株菌患者來源前三位科室為神經(jīng)外科9例、普通外科4例、骨科3例(圖1A)。標(biāo)本來源前3位分別為痰液16例，尿液7例，引流液4例(圖1B)。藥敏試驗(yàn)表明33株菌對多種抗生素耐藥，22株對美羅培南、亞胺培南和厄他培南全部耐藥，11株僅對厄他培南耐藥。除耐碳青霉烯類抗生素外，對頭孢類及含有酶抑制劑抗生素均耐藥，對喹諾酮類抗生素少數(shù)菌株敏感或中介，對氨基糖苷類抗生素大部分敏感或中介(表3)。

表3 33株耐碳青霉烯陰溝腸桿菌最低抑菌濃度結(jié)果Tab.3 Antimicrobial suscepbility testing results of 33 strains of carbapenem resistant Enterobacter cloacae

圖1 33株耐碳青霉烯陰溝腸桿菌科室分布和標(biāo)本來源Fig.1 Department distribution and specimen source of 33 carbapenem resistant Enterobacter cloacae

2.2 MALDI-TOF檢測碳青霉烯酶活性特征性蛋白

在采集的質(zhì)譜圖中位于289 Da和478 Da為非產(chǎn)酶株與亞胺培南孵育后的特異峰。產(chǎn)酶株中此兩峰均消失，同時(shí)在433 Da出現(xiàn)新的峰(圖2)。

圖2 碳青霉烯酶活性質(zhì)譜檢測譜圖Fig.2 MALDI-TOF test of carbapenemase activity

2.3 改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)

根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果22 株耐碳青霉烯(對美羅培南、亞胺培南和厄他培南全部耐藥)陰溝腸桿菌株mCIM均為陽性，提示為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。聯(lián)合eCIM 18株為陽性，2株菌(4和7號)為陰性，如圖3所示。

圖3 mCIM和eCIM實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 mCIM and eCIM results

2.4 耐藥基因檢測結(jié)果

用PCR方法對22株全耐碳青霉烯陰溝腸桿菌進(jìn)行碳青霉烯酶基因篩查，檢出blaNDM、blaIMP-1和blaKPC耐藥基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)北京博邁德生物公司進(jìn)行測序后，序列進(jìn)行BLAST比對后結(jié)果顯示16株陰溝腸桿菌產(chǎn)NDM-1(GenBank登錄號為 LC532143.1，序列符合率為100%)，4株產(chǎn)NDM-5(GenBank登錄號為MN599031.1，序列符合率為100%)，1株產(chǎn)KPC-2((GenBank登錄號為MN477223.1，序列符合率為99.61%))，10號菌株同時(shí)產(chǎn)NDM-1和KPC-2；4號和7號菌株2株產(chǎn)IPM-1(登錄號為LC548758.1，序列符合率為100%)。僅厄他培南耐藥菌株有兩株檢出NDM-1(E5和E8)基因，兩株檢出KPC-2基因(圖4)。

圖4 耐藥基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.4 Electrophoresis results of drug resistance gene amplification

2.5 多位點(diǎn)序列分析及聚類分析結(jié)果

篩選出的33株耐碳青霉烯陽性菌7對管家基因擴(kuò)增測序MLST分析結(jié)果顯示最多為ST418型，其次為ST754 型。聚類分析結(jié)果顯示所有菌株同源性。以“標(biāo)本來源”為特征生成最小生成樹(圖5)。

圖5 MLST分型聚類分析結(jié)果Fig.5 MLST typing cluster analysis results

2.6 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

22株全耐碳青霉烯陰溝桿菌中有8株的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌EC600中。11株僅厄他培南耐藥陰溝腸桿菌沒有轉(zhuǎn)移成功的菌株。篩選的陽性接合子經(jīng)質(zhì)譜儀鑒定為大腸埃希菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果美羅培南、亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦等均耐藥。耐藥基因檢測檢出blaNDM，提取質(zhì)粒測序比對后為IncX3型。

3 討論

陰溝腸桿菌是革蘭陰性粗短桿菌，廣泛存在于自然界的土壤、水、植物中，但在人體腸道內(nèi)也可檢測出陰溝腸桿菌。陰溝腸桿菌被公認(rèn)為醫(yī)院內(nèi)感染主要病原體，是臨床上檢出除大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌第三主要的腸桿菌目細(xì)菌[7]。隨著抗生素廣泛使用，在抗生素選擇壓力下耐藥陰溝腸桿菌迅速出現(xiàn)，給臨床抗感染治療工作和實(shí)驗(yàn)室快速檢測帶來巨大挑戰(zhàn)[8]。1993年報(bào)道了第一例由產(chǎn)ESBLs的腸桿菌目菌株引起的醫(yī)院獲得性感染[9]，隨后有不同的ESBLs酶(包括TEM, SHV和CTX-M)在陰溝腸桿菌中被檢出[10]。目前美國、西班牙、印度、澳大利亞及我國等許多國家都有耐碳青霉烯陰溝腸桿菌感染的報(bào)道[11-13]。本院近4年間檢出33株耐碳青霉烯陰溝腸桿菌，2017至2020年逐年增加?？剖曳植家陨窠?jīng)外科(27%)最多，其次為普外科(12%)、骨科 (11%)和康復(fù)醫(yī)學(xué)科 (11%)，經(jīng)分析可能與前3位科室患者多有侵入性治療有關(guān)，而康復(fù)醫(yī)學(xué)科患者也多由前3位科室患者轉(zhuǎn)入繼續(xù)治療，造成耐藥菌株的傳播。標(biāo)本來源是痰液標(biāo)本(48%)最多，其次為尿液(21%)和引流液(12%)，這可能與送檢不同樣本比例及患者接受氣管插管、尿管及引流管侵入性操作有關(guān)。查閱患者用藥史，檢出耐碳青霉烯陰溝腸桿菌患者均曾有亞胺培南、哌拉西林他唑巴坦、左氧氟沙星、頭孢噻肟、慶大霉素等多種抗生素聯(lián)合用藥，這與耐藥菌感染直接相關(guān)。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室陰溝腸桿菌常規(guī)藥敏通常只有一種或兩種碳青霉烯類抗生素藥敏結(jié)果，多為亞胺培南和美羅培南，如果遇到僅對厄他培南耐藥的菌株則無法及時(shí)發(fā)現(xiàn)。有研究建議厄他培南藥敏作為篩檢碳青霉烯耐藥菌的實(shí)驗(yàn)[14]。

陰溝腸桿菌對碳青霉烯類抗生素敏感性降低的主要機(jī)制是由于產(chǎn)生碳青霉烯酶[15]。根據(jù)Ambler分類系統(tǒng)β-內(nèi)酰胺酶分為4類(即A、B、C、D)，其中，A類、B類和D類為碳青霉烯酶，而C類酶主要水解頭孢菌素[16]。A、C、D類酶的活性催化位點(diǎn)為絲氨酸，而B類酶的活性位點(diǎn)為金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)，活性位點(diǎn)為鋅[17]。A類酶代表多為KPC酶，而B類包括獲得性VIM、IMP和NDM酶[18]，C類包括本身不是碳青霉烯酶的AmpC酶[19]。改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)是CLSI推薦的碳青霉烯酶表型檢測方法，本研究通過mCIM聯(lián)合eCIM試驗(yàn)對菌株進(jìn)行耐藥表型檢測，22株全耐藥陰溝腸桿菌株mCIM均為陽性，提示為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。聯(lián)合eCIM 2株(4、7)為陰性的菌株為黏液型陰溝腸桿菌判讀為產(chǎn)絲氨酸酶，但檢測耐藥基因?yàn)镮MP。MALDI-TOF檢測碳青霉烯酶活性特征性蛋白的方法簡單快速，但不能區(qū)分產(chǎn)酶類型[20]。某報(bào)道陰溝腸桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶以 A 類 KPC-2為主，B類和D類少見[21]，但本研究經(jīng)PCR檢測耐藥基因確認(rèn)全耐碳青霉烯陰溝腸桿菌主要產(chǎn)金屬酶NDM(80%)，此差異存在的原因可能與各地區(qū)間抗菌藥物使用情況以及地區(qū)環(huán)境不同所致。同時(shí)檢出NDM和KPC基因陰溝腸桿菌為我省首次報(bào)道，2017年曾有研究報(bào)道從慢性阻塞性肺疾病患者痰液中檢出1例[22]，后續(xù)我們將對此菌株進(jìn)一步做全基因組測序研究對比。另外本研究中1位患者同時(shí)檢出耐碳青霉烯陰溝腸桿菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，兩株菌均產(chǎn)金屬酶NDM-5，說明耐藥基因在不同菌種間傳播。

MLST和聚類分析結(jié)果分析得出2017年僅1株散發(fā)(ST851)，2018年兩株(ST55和ST754)，2019年3株全耐碳青霉烯(兩株ST754和一株ST74)，2020年16株全耐(其中9株ST418)。厄他培南耐藥陰溝腸桿菌在2019年檢出4株，2020年檢出7株。2020年暴發(fā)流行株為ST418型(共12株)，與2018年Jin[23]研究報(bào)道的最主要流行菌株型別一致。2020年7號菌株來源于腦脊液，ST分型為新型，進(jìn)一步研究將做全基因組測序確認(rèn)后上傳序列。

綜上所述，本院臨床檢出耐碳青霉烯陰溝腸桿菌呈現(xiàn)逐年上升趨勢，主要耐藥基因是NDM，而且質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)說明耐藥基因具有水平傳播能力。臨床患者感染CRE直接影響其治療和預(yù)后，應(yīng)當(dāng)引起臨床和院感部門的重視，警惕合理使用抗生素的同時(shí)早發(fā)現(xiàn)早隔離，避免造成院內(nèi)傳播。