劉美艷 李學(xué)波 魏鴻 潘曉麗

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137)

阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)是一種老年癡呆最常見的形式，由于慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)而導(dǎo)致的疾病，尤其好發(fā)于老年人當(dāng)中[1-3]。AD的病死亡率很高，僅次于心血管疾病和癌癥，不僅給患者帶來了巨大的傷痛，同時(shí)給患者家屬帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。然而不幸的是到目前為止，AD的發(fā)病原因尚無定論，人們也還未找到治療AD的特異性藥物和方法。目前，關(guān)于AD有多種發(fā)病機(jī)理假說[5-11]，很多病理學(xué)和基因證據(jù)支持淀粉樣蛋白假說。AD患者腦內(nèi)老年斑的主要成分是β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ) ，其聚集會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而損傷神經(jīng)細(xì)胞，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、記憶力衰退等臨床現(xiàn)象[12-14]。近年來，通過Aβ為靶點(diǎn)治療AD已成為研究熱點(diǎn)[15]。

科研人員尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)老年斑中金屬離子含量異常，其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常人，并且發(fā)現(xiàn)金屬離子如Zn2+和Cu2+等在體外能促進(jìn)Aβ的聚集[16-17]。金屬離子穩(wěn)態(tài)假說認(rèn)為大腦中金屬離子紊亂會(huì)影響AD的病理進(jìn)程。由于Aβ上具有金屬螯合位點(diǎn), 而AD患者腦內(nèi)的金屬離子含量高于正常人，因此許多金屬離子如Fe3+、Cu2+、Zn2+和Al3+等都能與Aβ結(jié)合形成Aβ-金屬復(fù)合物。因此，通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)金屬離子平衡可能成為治療AD的方向之一[18]。

近年來，丹參作為傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分如醌類和酚酸類或與其他中藥配伍的方劑都能明顯改善AD癥狀[19-21]。丹酚酸A是從唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)中提取分離得到的一種酚酸類活性成分[22]。本文基于淀粉樣蛋白聯(lián)級(jí)假說和金屬離子穩(wěn)態(tài)假說，利用ThT熒光實(shí)驗(yàn)探究金屬Zn2+對(duì)Aβ聚集的影響，以及丹酚酸A對(duì)Zn2+誘導(dǎo)Aβ聚集的干預(yù)作用；同時(shí)在體外合成丹酚酸A金屬配合物，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，研究其可能的配位情況。希望通過本研究為探索中藥丹參治療AD的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)購自湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司；BP211D型電子分析天平購自德國Sartorius公司；A560型雙光束紫外可見分光光度計(jì)購自翱藝儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器購自成都市國偉科技有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自Thermo公司；Tensor-27型傅立葉變換中紅外光譜儀購自Bruker公司；DZF型真空干燥箱購自北京科偉永興儀器有限公司；移液槍、96孔板購自成都勝拓儀器有限公司； AM-600型超導(dǎo)核磁共振購自Bruker公司。

1.2 試劑

六氟異丙醇、乙酸鋅、硫黃素T購自上海麥克林生化科技有限公司；氘代DMSO購自上海泰坦科技股份有限公司；Aβ42購自上海吉爾生化有限公司；丹酚酸A購自成都普思生物科技有限公司(純度大于98%)；色譜甲醇購自諾爾施公司；Herpes緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇購自成都科隆有限公司。

2 樣品溶液的配制

2.1 Aβ42單體化

將Aβ42溶于六氟異丙醇中配成1 mmol/L清澈透明的溶液，然后置于通風(fēng)廚內(nèi)讓六氟異丙醇自然揮發(fā)12 h，而后真空冷凍干燥4 h后于-20℃儲(chǔ)存[23]。

2.2 Aβ42及各待試樣品溶液的配制

HFIP處理后的Aβ42用適量的DMSO完全溶解，隨后用Herpes緩沖液(0.1 mol/L, pH7.4)稀釋至所需濃度；1 mmol/L金屬Zn2+和丹酚酸A母液均用DMSO配制；5 mmol/L ThT母液用Herpes緩沖液(0.1 mol/L,pH7.4)配制，避光保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)使用上述Herpes緩沖液稀釋。

3 ThT熒光實(shí)驗(yàn)

3.1 研究金屬Zn2+對(duì)Aβ42聚集的影響

配制一系列Aβ42濃度恒定而金屬Zn2+濃度不同的溶液。具體步驟：將Aβ42溶液分別與不同濃度的金屬Zn2+溶液混合，于37℃恒溫箱中共同孵育48 h。

3.2 研究丹酚酸A對(duì)Aβ42聚集的影響

配制一系列Aβ42濃度恒定而丹酚酸A濃度不同的溶液。具體步驟：將Aβ42溶液分別與不同濃度的丹酚酸A溶液混合，于37℃恒溫箱中共同孵育48 h。

3.3 研究丹酚酸A對(duì)金屬Zn2+誘導(dǎo)的Aβ42聚集的影響

配制一系列Aβ42和金屬Zn2+濃度恒定而丹酚酸A濃度不同的溶液。具體步驟：將Aβ42和金屬Zn2+溶液混合，于37℃恒溫箱中共同孵育5 min，加入不同濃度的丹酚酸A溶液，繼續(xù)置于37℃恒溫箱中孵育48 h。

3.4 研究丹酚酸A對(duì)Aβ42聚集體解聚的影響

配制一系列Aβ42濃度恒定而丹酚酸A濃度不同的溶液。具體步驟：將Aβ42溶液放置于37℃恒溫箱中孵育48 h，形成聚集體，隨后加入不同濃度的丹酚酸A溶液，繼續(xù)置于37℃恒溫箱中孵育48 h。

3.5 研究丹酚酸A對(duì)金屬Zn2+誘導(dǎo)的Aβ42聚集體解聚的影響

配制一系列Aβ42和金屬Zn2+濃度恒定而丹酚酸A濃度不同的溶液。具體步驟：將Aβ42和金屬Zn2+溶液混合，于37℃恒溫箱中共同孵育48 h，形成聚集體，隨后加入不同濃度的丹酚酸A溶液，繼續(xù)置于37℃恒溫箱中孵育48 h。

上述孵育液孵育好后，取20 μL至黑色96孔板中，加入180 μL硫黃素T溶液(5 μmol/L)，同時(shí)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。最后，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量熒光吸收值，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)482 nm，記錄5 min末的熒光強(qiáng)度。

4 金屬配合物的合成

準(zhǔn)確稱取丹酚酸A 49.4 mg(0.1 mmol)溶于5 mL無水乙醇中，在磁力攪拌器中溶解，待丹酚酸A完全溶解后滴加含有21.95 mg乙酸鋅(0.1 mmol)的無水乙醇溶液，反應(yīng)液隨著乙酸鋅溶液的滴加逐漸從淡黃色變?yōu)辄S綠色，同時(shí)反應(yīng)液變渾濁，繼續(xù)在室溫下攪拌反應(yīng)1 h，靜置一段時(shí)間后有沉淀，沉淀離心，再用無水乙醇洗滌數(shù)次直至上清液變?yōu)闊o色，產(chǎn)物于35℃真空干燥，得黃綠色粉末狀固體產(chǎn)物，稱重，W=實(shí)際重量，W0=理論重量，計(jì)算配合物產(chǎn)率。

產(chǎn)率(%)=W/W0×100%

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，并且比較組間差別，當(dāng)P<0.05判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)Aβ42蛋白的熒光值來描述金屬Zn2+和丹酚酸A對(duì)Aβ42聚集的影響。

6 結(jié)果與討論

6.1 ThT熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.1.1 金屬Zn2+對(duì)Aβ42聚集的影響

本研究結(jié)果顯示，隨著金屬Zn2+濃度增加，Aβ42的熒光值逐漸升高。具體結(jié)果見圖1。

6.1.2 丹酚酸A對(duì)Aβ42聚集的影響

本研究結(jié)果顯示，隨著化合物丹酚酸A濃度增加，Aβ42的熒光值逐漸降低。具體結(jié)果見圖2。

6.1.3 丹酚酸A對(duì)金屬Zn2+誘導(dǎo)的Aβ42聚集的影響

本研究結(jié)果顯示，隨著化合物丹酚酸A濃度增加，金屬Zn2+誘導(dǎo)Aβ42聚集的熒光值逐漸降低。具體結(jié)果見圖3。

6.1.4 丹酚酸A對(duì)Aβ42聚集體解聚的影響

本研究結(jié)果顯示，隨著化合物丹酚酸A濃度增加，Aβ42聚集體的熒光值逐漸降低。具體結(jié)果見圖4。

6.1.5 丹酚酸A對(duì)金屬離子誘導(dǎo)的Aβ42聚集體解聚的影響

本研究結(jié)果顯示，隨著化合物丹酚酸A濃度增加，金屬Zn2+誘導(dǎo)Aβ42聚集體的熒光值逐漸降低.具體結(jié)果見圖5。

6.2 配合物的表征

6.2.1 配合物的一般性質(zhì)

丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物收率為53.47%。丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物與丹酚酸A及乙酸鋅相比較，外觀顏色和性質(zhì)都發(fā)生了顯著的變化。丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物粉末顏色為黃綠色，難溶于丙酮、乙醚、三氯甲烷和乙酸乙酯等極性小的試劑，微溶于甲醇，溶于DMSO。

6.2.2 紫外光譜

本研究結(jié)果顯示，在200～600 nm范圍內(nèi)對(duì)丹酚酸A和丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物進(jìn)行UV-vis 掃描分得到紫外吸收光譜(表1)。丹酚酸A的紫外吸收光譜中，205 nm為苯環(huán)的E帶吸收，289 nm為苯環(huán)的K帶吸收。丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物的紫外光譜中仍有2個(gè)主要吸收峰。具體結(jié)果見表1。

表1 丹酚酸A及其金屬配合物的UV(nm)主要數(shù)據(jù)Tab.1 UV (nm) main data of salvianolic acid A and its metal complexes

6.2.3 紅外光譜

本研究結(jié)果顯示，在400 cm-1～4000 cm-1范圍內(nèi)對(duì)丹酚酸A和丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物進(jìn)行掃描得到紅外光譜主要特征峰。具體結(jié)果見表2。

表2 丹酚酸A及其金屬配合物的IR(cm-1)主要數(shù)據(jù)Tab.2 Main data of IR (cm-1) of salvianolic acid A and its metal complexes

6.2.4 核磁共振氫譜

本研究結(jié)果顯示，丹酚酸A及其金屬配合物的核磁共振氫譜(表3)。由數(shù)據(jù)可見，金屬配合物相比于丹酚酸A，其核磁共振氫譜發(fā)生了少許變化。具體結(jié)果見表3。

表3 丹酚酸A及其金屬配合物的1H NMR 的數(shù)據(jù)(DMSO-d6)Tab.3 1H NMR data of salvianolic acid A and its metal complexes (DMSO-d6)

由參考文獻(xiàn)[24]和以上結(jié)構(gòu)表征結(jié)果，可推測(cè)金屬配合物可能結(jié)構(gòu)式：1分子丹酚酸A與1分子金屬Zn2+通過丹酚酸A的羧基和羧基鄰位的苯環(huán)形成配合物(圖6)。

6.3 討論

許多文獻(xiàn)已證明金屬離子能加速Aβ的聚集[25-26]，通過本次ThT熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可推斷金屬Zn2+能快速誘導(dǎo)Aβ42的聚集，并且其促進(jìn)作用呈現(xiàn)劑量依賴性，符合文獻(xiàn)所報(bào)道的。許多天然產(chǎn)物如楊梅素、槲皮素等，不僅自身能抑制Aβ的聚集，而且還能和金屬離子絡(luò)合從而抑制金屬離子誘導(dǎo)Aβ的聚集，具有雙靶點(diǎn)同時(shí)抑制作用[27-28]。丹酚酸A為酚酸類天然產(chǎn)物，通過本次ThT熒光實(shí)驗(yàn)初步顯示丹酚酸A不僅能明顯抑制Aβ42的聚集，而且可以明顯促進(jìn)Aβ42聚集體的解聚，并且其抑制作用和解聚作用均呈劑量依耐性；同時(shí)，丹酚酸A和Aβ42競(jìng)爭(zhēng)性的絡(luò)合金屬Zn2+，從而抑制金屬Zn2+誘導(dǎo)Aβ42的聚集和促進(jìn)金屬Zn2+誘導(dǎo)Aβ42聚集體的解聚。

紫外吸收峰的形狀基本保持不變，但吸收峰的位置發(fā)生了一定程度的紅移，表明配合物形成的同時(shí)沒有破壞丹酚酸A的共軛結(jié)構(gòu)[29]。峰位移動(dòng)的原因可能是：丹酚酸A與金屬Zn2+形成配合物后, 整個(gè)分子中電子的離域程度增大, 致使電子躍遷時(shí)需要的能量降低, 使吸收峰發(fā)生紅移[30]。

在紅外吸收光譜中丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物的羧酸羰基吸收峰相比于丹酚酸A發(fā)生了一定程度的紅移，而且吸收強(qiáng)度明顯減弱，可能是配合物中配位作用使 C=O鍵作用力減弱，從而使電子云密度減少，表明羧基參與了配位成鍵[30]。芳環(huán)骨架振動(dòng)頻率為1450 cm-1、1600 cm-1，丹酚酸A和丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物在此區(qū)域內(nèi)均出現(xiàn)吸收峰。然而丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物的苯環(huán)吸收峰相比丹酚酸A發(fā)生了小幅度的藍(lán)移，吸收強(qiáng)度明顯減弱 ，并且從參考文獻(xiàn)[24]可知分子的空間結(jié)構(gòu)上離配位點(diǎn)最近的苯環(huán)或雙鍵是最重要的影響因素，苯環(huán)的影響力要大于直鏈雙鍵，由苯環(huán)參與的配位更加穩(wěn)定，說明苯環(huán)參與了配位反應(yīng)。同時(shí)丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物在低頻區(qū)600 cm-1左右出現(xiàn)了一個(gè)新的弱吸收峰，表明氧原子與金屬Zn2+形成了Zn—O配位鍵[31]。

配合物和丹酚酸A1H NMR 中均有六個(gè)酚羥基信號(hào)，只是化學(xué)位移有不同程度的變化，可能是受配位作用的影響。丹酚酸A1H NMR 中δ13.03(1H，S)為羧基的活潑氫信號(hào)[32]，然而配合物的氫譜中未見此羧基氫的信號(hào)峰，表明羧基參與了配位反應(yīng)。

因此，通過本次實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果以及以往的文獻(xiàn)，可推測(cè)丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物可能結(jié)構(gòu)式為1分子丹酚酸A與1分子金屬Zn2+通過丹酚酸A的羧基和羧基鄰位的苯環(huán)形成配合物。

7 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于淀粉樣蛋白學(xué)說和金屬離子穩(wěn)態(tài)學(xué)說，采用ThT熒光法得出中藥丹參藥效成分丹酚酸A對(duì)Aβ42以及金屬Zn2+誘導(dǎo)Aβ42的聚集均有抑制作用，并且對(duì)Aβ42以及金屬Zn2+誘導(dǎo)Aβ42的聚集體均有解聚作用。體外模擬丹酚酸A和金屬Zn2+的絡(luò)合方式，并采用紫外光譜、紅外光譜、核磁共振氫譜對(duì)丹酚酸A-Zn(Ⅱ)配合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，研究其可能的配位結(jié)構(gòu)。我們?cè)趯?duì)丹參大量化合物進(jìn)行活性篩選的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A具有雙靶點(diǎn)同時(shí)抑制作用，因此希望通過本次實(shí)驗(yàn)?zāi)転樘剿髦兴幍⒅委烝D的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。