王偉平 王君 鄧飛 趙彩杰 韓景新

（唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院護理系，唐山 063300）

慢性氣道炎癥性疾病是多種細胞因子引起的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，支氣管上皮細胞在維持氣道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用，支氣管上皮細胞損傷與感染性疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1-2］。牡荊素是一種天然黃酮類化合物，可通過抗神經(jīng)凋亡、調(diào)節(jié)炎癥因子對神經(jīng)系統(tǒng)起保護作用［3］。牡荊素還可通過減少心肌細胞凋亡，降低炎癥因子水平保護心肌炎癥細胞免受CVB3病毒誘導(dǎo)的損傷［4］。但牡荊素對支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及機制尚不清楚。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可誘導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)，因此，本研究采用LPS刺激支氣管上皮細胞，觀察牡荊素對LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及機制，為慢性氣道炎癥性疾病治療提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料人支氣管上皮細胞系16HBE購自上海酶研生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；LPS、牡荊素（純度≥95%）購自美國Sigma公司；TUNEL檢測試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司；凋亡檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-6、IL-13、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 肺損傷小鼠模型構(gòu)建15只C57BL/6健康雄性小鼠隨機分為對照組、模型組、牡荊素低、中、高劑量組，每組3只。所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，仰臥位固定于滴注板，吸除小鼠口咽部分泌物后將帶針芯的靜脈留置針插入氣管內(nèi)，立即拔出針芯，模型組小鼠向氣管內(nèi)快速滴注LPS（1 000 μg/ml，4 mg/kg），對照組注入等量生理鹽水，并立即注入空氣0.5 ml，牡荊素低、中、高劑量組先用LPS滴注，損傷模型成功建立后分別滴注1.5、3、6 mg/kg牡荊素。給藥結(jié)束后正常飼養(yǎng)小鼠24 h，麻醉處死小鼠后取肺組織，石蠟切片。

1.2.2 原位缺口末端標(biāo)記法檢測小鼠肺組織細胞凋亡情況取各組小鼠石蠟切片，按試劑盒說明書操作，細胞核中有棕褐色顆粒者為陽性細胞，記錄3個高倍鏡視野下的凋亡細胞數(shù)，凋亡指數(shù)（%）=凋亡細胞數(shù)/3個高倍鏡視野下細胞總數(shù)×100%。

1.2.3 免疫組化法檢測小鼠肺組織IL-6、IL-13、TNF-α表達取各組小鼠肺組織石蠟切片（5 μm），脫蠟水化，抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，避光20 min，PPS洗2次，5 min/次；5%胎牛血清封閉，分別加入兔抗人IL-6、IL-13、TNF-α一抗，37℃孵育2 h，PPS洗2次，5 min/次；加入山羊抗兔二抗，PPS洗2次，5 min/次，DAB染色，蘇木素復(fù)染2 min，脫水，透明，封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 細胞培養(yǎng)與分組人支氣管上皮細胞系16HBE復(fù)蘇后接種于RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37℃、5%CO2培養(yǎng)，2~3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。50 μg/ml LPS處理細胞16HBE，記為LPS組，正常培養(yǎng)的細胞作為對照組（Con），分別用25、50、100 mg/L牡荊素處理后再用50 μg/ml LPS處理，記為牡荊素低、中、高劑量組（LPS+VT-L、LPS+VT-M、LPS+VT-H）。將miR-NC、miR-219a-5p轉(zhuǎn)染至16HBE細胞后采用50 μg/ml LPS處理，記為LPS+miR-NC組、LPS+miR-219a-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-219a-5p轉(zhuǎn)染至16HBE細胞后采用100 mg/L牡荊素和50 μg/ml LPS處理，記為LPS+VT+anti-miR-NC組、LPS+VT+anti-miR-219a-5p組。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測16HBE細胞凋亡收集各組細胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞密度為6×104個/ml，將細胞接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，棄培養(yǎng)基，500 μl/孔加入胰蛋白酶消化細胞，細胞從培養(yǎng)板上脫落時加入血清終止消化，1 500 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)基，重懸細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至EP管，4℃、1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，5 min/次，棄PBS，加入200 μl結(jié)合緩沖液，加入5 μl Annexin VFITC振蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液振蕩混勻，室溫避光孵育10 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液振蕩混勻，過濾，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Cellauest軟件計算。

1.2.6 Western blot檢測16HBE細胞Bcl-2、Bax蛋白表達提取各組細胞總蛋白，定量，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，分別加入相應(yīng)的一抗（1∶800）4℃孵育過夜，加入二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，曝光顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白表達。

1.2.7 ELISA檢測IL-6、IL-13、TNF-α水平各組細胞培養(yǎng)48 h后取上清，稀釋標(biāo)準品：酶標(biāo)板內(nèi)設(shè)標(biāo)準孔，微量加樣器在酶標(biāo)板第1、2孔內(nèi)分別加入標(biāo)準品（100 μl）與標(biāo)準品稀釋液（50 μl），充分混勻，第3（100 μl）、4孔（100 μl）內(nèi)分別加入混勻后的第1、2孔內(nèi)液體、標(biāo)準品稀釋液50 μl，按照上述方法稀釋標(biāo)準品，待稀釋至第9、10孔時充分混勻，每孔加樣量均為50 μl，設(shè)置不加樣品孔與酶標(biāo)試劑的空白對照孔，待測樣品孔內(nèi)加入樣品稀釋液40 μl、上清10 μl，37℃水浴孵育30 min，按試劑盒說明書進行檢測。

1.2.8 RT-qPCR檢 測16HBE細 胞miR-219a-5p表達各組細胞培養(yǎng)48 h后提取細胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR-219a-5p以U6為內(nèi)參進行PCR擴增，2-ΔΔCt法計算相對表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牡荊素對LPS誘導(dǎo)肺損傷小鼠模型肺部上皮細胞凋亡的影響與對照組相比，模型組小鼠肺部上皮細胞凋亡指數(shù)升高［（37.55±3.14）%vs（7.26±0.71）%］（P<0.05）；與模型組相比，牡荊素低、中、高劑量組小鼠肺部上皮細胞凋亡指數(shù)降低［（29.22±2.98）%、（22.13±2.06）%、（22.13±2.06）%vs（37.55±3.14）%］（P<0.05）。

2.2 牡荊素對LPS誘導(dǎo)肺損傷小鼠模型肺組織炎癥因子表達的影響與對照組相比，模型組小鼠肺組織中IL-6、IL-13、TNF-α陽性表達水平升高（P<0.05）；與模型組相比，牡荊素低、中、高劑量組小鼠肺組織中IL-6、IL-13、TNF-α陽性表達水平降低（P<0.05，圖1）。

圖1 牡荊素對LPS誘導(dǎo)肺損傷模型小鼠肺組織炎癥因子表達的影響（×100）Fig.1 Effect of vitexin on inflammatory factors expres?sions in lung tissue of LPS-induced lung injury model mice（×100）

2.3 牡荊素對LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響與對照組相比，LPS組細胞凋亡率和Bax表達升高，Bcl-2表達降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量增加（P<0.05）；與LPS組相比，牡荊素低、中、高劑量組細胞凋亡率和Bax表達降低，Bcl-2表達升高，IL-6、IL-13、TNF-α含量減少，且呈濃度依賴性（P<0.05，圖2）。

圖2 牡荊素對LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of vitexin on apoptosis of LPS-induced bron?chial epithelial cells

2.4 牡荊素對LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞中miR-219a-5p表達的影響與對照組相比，LPS組miR-219a-5p表 達 降 低（0.46±0.04 vs 1.00±0.07）（P<0.05）；與LPS組相比，牡荊素低、中、高劑量組miR-219a-5p表 達 升 高（0.59±0.05、0.71±0.06、0.86±0.06 vs 0.46±0.04），且呈濃度依賴性（P<0.05）。

2.5 miR-219a-5p過表達對LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響與LPS+miR-NC組相比，LPS+miR-219a-5p組miR-219a-5p表達升高，細胞凋亡率和Bax表達降低，Bcl-2表達升高，IL-6、IL-13、TNF-α含量減少（P<0.05，圖3）。

圖3 miR-219a-5p過表達對LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-219a-5p overexpression on apoptosis of LPS-induced bronchial epithelial cells

2.6 抑制miR-219a-5p表達逆轉(zhuǎn)牡荊素（100 mg/L）對LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用與LPS+VT+anti-miR-NC組相比，LPS+VT+antimiR-219a-5p組miR-219a-5p表達降低，細胞凋亡率和Bax表達升高，Bcl-2表達降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量增加（P<0.05，圖4）。

圖4 抑制miR-219a-5p表達逆轉(zhuǎn)了牡荊素對LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡的作用Fig.4 Inhibition of miR-219a-5p expression reversed effect of vitexin on LPS-induced apoptosis of bron?chial epithelial cells

3 討論

支氣管上皮細胞損傷在氣道炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抑制支氣管上皮細胞分泌炎癥細胞因子，減少細胞凋亡可能是治療氣道炎癥性疾病的有效方法［5-6］。研究報道，牡荊素可抑制小鼠卵清蛋白誘導(dǎo)的過敏性哮喘中的炎癥反應(yīng)［7］。牡荊素可通過抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡，降低TNF-α及干擾素-γ（interferon γ，IFN-γ）含量對大鼠神經(jīng)細胞損傷起保護作用［8］。牡荊素可減輕LPS誘導(dǎo)的中性粒細胞募集和促炎細胞因子水平升高，從而減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷［9］。表明牡荊素具有抗炎作用。IL-13是Th2細胞分泌的細胞因子，是哮喘和慢性阻塞性肺疾病發(fā)病的重要細胞因子［10］。IL-6、TNF-α是促炎因子，在慢性阻塞性肺疾病中高表達［11］。本研究構(gòu)建小鼠肺損傷模型后檢測肺部細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，小鼠肺部上皮細胞凋亡指數(shù)降低。采用不同劑量牡荊素處理LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞，結(jié)果顯示，細胞凋亡率降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量減少，且呈濃度依賴性，說明牡荊素可劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子釋放。

研究報道，上調(diào)miR-219a-5p表達可提高細胞活性，抑制乳酸脫氫酶釋放和細胞凋亡，對腦缺血再灌注損傷起保護作用［12］。miR-219a-5p可通過抑制Th1/Th17介導(dǎo)的免疫應(yīng)答抑制腸道炎癥［13］。原兒茶酸可激活miR-219a-5p表達緩解慢性酒精性肝?。?4］。表明miR-219a-5p具有抗炎及抗氧化作用。本研究顯示，miR-219a-5p過表達后支氣管上皮細胞凋亡率降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量減少，且肺損傷模型小鼠肺組織中IL-6、IL-13、TNF-α陽性表達水平降低，說明過表達miR-219a-5p可抑制LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子釋放。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)牡荊素可提高miR-219a-5p表達，而抑制miR-219a-5p表達逆轉(zhuǎn)了牡荊素對LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，牡荊素可能通過上調(diào)miR-219a-5p表達抑制LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子釋放。