汪漢成, 蔡劉體, 劉文鋒, 劉亭亭,3, 孫美麗,3,陸 寧, 陳興江, 穆 青

(1. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081；2. 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，武漢 430040；3. 長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；4. 貴州省煙草公司黔西南州公司，貴州 興義 562400)

灰葡萄孢Botrytis cinerea是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要病原真菌，可引起植物灰霉病，其常見(jiàn)寄主有200 多種，可造成多種作物產(chǎn)前、產(chǎn)后的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]?；颐共【哂袧摲诙?、流行速度快等特點(diǎn)，在環(huán)境有利條件下，短時(shí)間內(nèi)可產(chǎn)生大量分生孢子，分生孢子借助風(fēng)雨的傳播可造成病害大面積流行[2]。碳源是植物病原菌生存和產(chǎn)孢的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅影響病原菌的致病力，還影響其孢子的產(chǎn)生[3]。已有的研究表明，灰葡萄孢菌可利用的碳源種類(lèi)豐富，包括多種糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)等多種化合物[4]。然而，各類(lèi)碳源化合物是否會(huì)影響灰葡萄孢分生孢子的形成尚缺乏了解。而分生孢子的形成與灰霉病的再侵染密切相關(guān)，了解碳源營(yíng)養(yǎng)與灰葡萄孢分生孢子形成間的關(guān)系有助于增加對(duì)灰霉病再侵染規(guī)律的認(rèn)識(shí)。

當(dāng)前，化學(xué)防控仍是對(duì)作物灰霉病進(jìn)行防控的主要手段。多菌靈、丙環(huán)唑、嘧霉胺、異菌脲和咪鮮胺等幾種作用機(jī)制不同的殺菌劑在國(guó)內(nèi)外均已被登記用于防控多種作物灰霉病[5-6]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，這些殺菌劑對(duì)灰葡萄孢碳源利用表現(xiàn)出不同的表型特征[5]，但殺菌劑對(duì)其分生孢子形成過(guò)程中所需碳源種類(lèi)仍缺乏了解。為此，本文采用Biolog FF 板，測(cè)定了在上述5 種殺菌劑脅迫下灰葡萄孢的產(chǎn)孢情況，以期揭示灰葡萄孢孢子形成所需的的產(chǎn)孢碳源種類(lèi)，以及殺菌劑對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)孢所需碳源種類(lèi)的影響，旨在為灰霉病的科學(xué)防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 灰葡萄孢Botrytis cinerea菌株H1，由貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)分離、鑒定所得[7-8]。

1.1.2 藥劑與試劑 80%多菌靈 (carbendazim) 原藥，江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司；95%丙環(huán)唑 (propiconazole) 原藥，上海艾科思生物公司；96%嘧霉胺 (pyrimethanil) 原藥，江蘇耕耘化工有限公司；97.30%異菌脲 (iprodione) 原藥，山東泰安圣聚華有限公司；96%咪鮮胺 (prochloraz) 原藥，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司。將多菌靈溶于0.20 mol/L 的稀鹽酸，其余藥劑均分別溶于甲醇，配制成質(zhì)量濃度為1.0 × 104mg/L 的母液，于4 ℃下黑暗保存，備用。

Biolog FF 板 (貨號(hào)：#1006)、FF-IF (#72106)接種液、OmniLog PM 系統(tǒng) (#91171) 和8 通道電動(dòng)移液器 (#3501A)，購(gòu)自美國(guó)Biolog 公司。

1.2 灰葡萄孢對(duì)Biolog FF 板碳源的利用及其產(chǎn)孢情況

將灰葡萄孢于25 ℃黑暗條件下在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上培養(yǎng)，5 d 后將平板置于15 ℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h，菌落表面產(chǎn)生大量分生孢子，使用無(wú)菌水潤(rùn)濕的無(wú)菌棉簽在菌落表面旋轉(zhuǎn)蘸取分生孢子，將其定容至12 mL 的FFIF 接種液中，將孢子懸浮液濃度調(diào)至62% T (T 為Biolog 標(biāo)準(zhǔn)濃度單位)[9]。用8 通道電動(dòng)移液器將混勻后的孢子懸浮液添加至Biolog FF 板中，每孔100 μL。將Biolog FF 板置于OmniLog 恒溫培養(yǎng)箱中，于25 ℃培養(yǎng)7 d，設(shè)置OmniLog 工作軟件，收集數(shù)據(jù)。根據(jù)灰葡萄孢的代謝曲線(xiàn)，分析其碳源利用表型特征[5]。同時(shí)，肉眼觀察灰葡萄孢在Biolog FF 板各孔上的產(chǎn)孢情況，有灰色孢子形成的孔，其孔內(nèi)碳源視為能促進(jìn)灰葡萄孢產(chǎn)孢的碳源，記錄碳源的種類(lèi)。

1.3 5 種殺菌劑脅迫下灰葡萄孢產(chǎn)孢所需碳源種類(lèi)分析

參照1.2 節(jié)的方法準(zhǔn)備灰葡萄孢的分生孢子。根據(jù)灰葡萄孢對(duì)5 種殺菌劑的敏感性[7-8]，用FFIF 接種液配制各藥劑系列濃度的測(cè)試液。多菌靈的最終測(cè)試質(zhì)量濃度為0、0.05、1 mg/L，丙環(huán)唑?yàn)?、1、10 mg/L，嘧霉胺為0、0.08、1 mg/L，異菌脲為0、0.1、5 mg/L，咪鮮胺為0、0.04、5 mg/L。參照1.2 節(jié)的方法配制各藥劑測(cè)試濃度的灰葡萄孢分生孢子接種液，并檢測(cè)在藥劑脅迫下分生孢子的形成情況，肉眼觀察并記錄在各種殺菌劑脅迫下灰葡萄孢產(chǎn)孢所需碳源種類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葡萄孢對(duì)Biolog FF 板碳源的利用及其產(chǎn)孢情況

灰葡萄孢在Biolog FF 板上培養(yǎng)7 d 后，其對(duì)Biolog FF 板上碳源的利用及其產(chǎn)孢情況見(jiàn)表1?；移咸焰吣芾锰穷?lèi)、氨基酸類(lèi)等92 種碳源，其中高效利用的有L-阿拉伯糖、熊果苷、D-纖維二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖和麥芽三糖等；不能利用的碳源有異L-果糖、葡萄糖醛酰胺和L-乳酸。灰葡萄孢能利用且能產(chǎn)孢的碳源有35 種，包括苦杏仁苷、L-阿拉伯糖、甘油等；能利用但不能產(chǎn)孢的碳源有57 種，包括吐溫80、D-阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和D-山梨糖醇等。

表1 灰葡萄孢對(duì)Biolog FF 板碳源的利用及其產(chǎn)孢情況Table 1 Carbon substrate utilization and sporulation of Botrytis cinerea on Biolog FF microplate

續(xù)表1Table 1 (Continued)

2.2 5 種殺菌劑脅迫下灰葡萄孢的產(chǎn)孢碳源種類(lèi)

灰葡萄孢在5 種殺菌劑不同濃度下均表現(xiàn)出不同的碳源利用特性[5]，其在Biolog FF 板上的產(chǎn)孢碳源情況存在差異 (表2)。用多菌靈0.05 mg/L、丙環(huán)唑1 mg/L、嘧霉胺0.08 mg/L、異菌脲0.1 mg/L及咪鮮胺0.04 mg/L 處理時(shí)，灰葡萄孢可產(chǎn)孢的碳源種類(lèi)分別為12、4、36、38 及37 種；用多菌靈1 mg/L、丙環(huán)唑10 mg/L、嘧霉胺1 mg/L、異菌脲5 mg/L 及咪鮮胺5 mg/L 處理時(shí)，灰葡萄孢能產(chǎn)孢的碳源種類(lèi)分別為6、3、36、34 及5 種。

表2 5 種殺菌劑脅迫下灰葡萄孢在Biolog FF 板上產(chǎn)孢的碳源種類(lèi)Table 2 Carbon substrates for sporulation of Botrytis cinerea under five different fungicide pressures on Biolog FF microplate

續(xù)表2Table 2 (Continued)

在多菌靈脅迫下，能促進(jìn)灰葡萄孢產(chǎn)孢的碳源主要為多糖類(lèi)碳水化合物，包括β-環(huán)式糊精、D-核糖等；隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加，部分碳源被抑制，如L-阿拉伯糖、D-半乳糖、肝糖和麥芽糖等。在丙環(huán)唑1 和10 mg/L 脅迫下，能促進(jìn)灰葡萄孢產(chǎn)孢的碳源種類(lèi)基本一致，主要為多糖類(lèi)碳水化合物D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖和β-環(huán)式糊精；此外，病原菌在1 mg/L 的丙環(huán)唑脅迫下還能利用熊果苷并產(chǎn)孢。在嘧霉胺0.08 和1 mg/L 脅迫下，灰葡萄孢能產(chǎn)孢的大部分碳源種類(lèi)一致，包括麥芽糖、麥芽三糖、β-環(huán)式糊精等36 種碳源。在異菌脲0.1 和5 mg/L 脅迫下，灰葡萄孢能產(chǎn)孢的大部分碳源種類(lèi)一致，包括N-乙?；?β-D-葡萄糖胺、麥芽三糖、D-甘露醇、D-苷露糖等30 多種碳源。在咪鮮胺1 mg/L 脅迫下，灰葡萄孢能產(chǎn)孢的碳源種類(lèi)較多，包括核糖醇、杏苷、麥芽三糖、D-甘露醇等37 種碳源；在咪鮮胺10 mg/L 脅迫下，灰葡萄孢能產(chǎn)孢的碳源僅為D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖胺、D-核糖及D-木糖。

3 討論

Biolog FF 板中含有單糖、多糖、醇類(lèi)、氨基酸類(lèi)等95 種碳源，不同微生物對(duì)不同碳源會(huì)表現(xiàn)出不同的代謝指紋圖譜，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于真菌的鑒定[10-11]。本文采用代謝技術(shù)分析了灰葡萄孢對(duì)Biolog FF 板碳源的利用及其在5 種殺菌劑脅迫下的產(chǎn)孢情況，結(jié)果揭示了不同作用機(jī)制殺菌劑脅迫下灰葡萄孢產(chǎn)孢所需碳源種類(lèi)。

不同煙草微生物在Biolog FF 板上表現(xiàn)出不同的代謝表型。已有的研究發(fā)現(xiàn)，煙草九州鐮孢菌Fusarium kyushuense能利用的碳源有89 種，但其不能利用N-乙?；鵇-半乳糖胺、N-乙?；?β-D-葡萄糖胺、葡萄醛酰胺、癸二酸、L-絲氨酸和腺苷-5′-磷酸鹽6 種碳源[12]；源自煙草育苗基質(zhì)的哈慈木霉Trichoderma harzianum和棘孢木霉Trichoderma asperellum分別能利用57 和55 種碳源，其中24 種能促進(jìn)其大量產(chǎn)孢，包括D-纖維二糖、糊精、赤蘚糖醇和D-果糖[13]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢能高效利用的碳源有29 種，主要包括N-乙?；?β-D-葡萄糖胺、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯醇和熊果苷[5]，本文結(jié)果與前文基本一致。上述九州鐮孢菌、哈慈木霉、棘孢木霉及灰葡萄孢均能產(chǎn)

孢的碳源有D-阿拉伯糖、熊果苷等20 余種，這些碳源可能是大部分絲狀真菌生存和產(chǎn)孢的重要營(yíng)養(yǎng)碳源，有關(guān)碳源對(duì)真菌孢子形成的生化機(jī)理有待下一步研究。此外，灰葡萄孢菌的寄主廣泛，本文僅檢測(cè)了源自煙草灰葡萄孢的碳源利用特征，來(lái)自其他寄主的灰葡萄菌的相關(guān)研究也有待開(kāi)展。

Biolog FF 板的碳源代謝均發(fā)生于不同的生物化學(xué)反應(yīng)途徑中，可用于殺菌劑作用機(jī)理的研究?；诖思夹g(shù)研究發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯和醚菌酯均可抑制九州鐮孢菌F. kyushuense的糖酵解和三羧酸循環(huán)生化途徑中大部分碳源的代謝[14]；啶酰菌胺可抑制灰霉病菌三羧酸循環(huán)途徑中大部分碳源的代謝，多菌靈對(duì)灰葡萄孢糖酵解途徑的碳源代謝沒(méi)有抑制活性，異菌脲和嘧霉胺對(duì)灰葡萄孢碳源代謝的抑制活性較弱，丙環(huán)唑可抑制灰葡萄孢所有生化途徑碳源的代謝[5]。除研究殺菌劑對(duì)灰葡萄孢的碳源代謝表型外，本文進(jìn)一步明確了5 種不同作用機(jī)理殺菌劑脅迫下灰葡萄孢產(chǎn)孢所需的碳源種類(lèi)。作用于細(xì)胞核分裂期β微管蛋白形成的多菌靈[15]和作用于麥角甾醇形成的咪鮮胺[16]在高劑量脅迫時(shí)，均可減少灰葡萄孢產(chǎn)孢所需碳源的種類(lèi)；作用于甾醇合成的丙環(huán)唑[17]在低劑量和高劑量脅迫下，均可減少其產(chǎn)孢所需碳源的種類(lèi)。由此推測(cè)，多菌靈、咪鮮胺和丙環(huán)唑可影響灰葡萄孢產(chǎn)孢相關(guān)的生化途徑。作用于甲硫氨酸合成的嘧霉胺[18]和作用于組氨酸激酶的異菌脲[19]在本文測(cè)試濃度下，對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)孢所需碳源基本無(wú)影響，推測(cè)這兩種藥劑不作用于灰葡萄孢產(chǎn)孢相關(guān)生化途徑。各藥劑抑制灰葡萄孢產(chǎn)孢所需碳源種類(lèi)的差異及其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

綜上，使用嘧霉胺和異菌脲防控作物灰霉病存在灰葡萄孢繼續(xù)產(chǎn)生大量分生孢子的風(fēng)險(xiǎn)。相比而言，丙環(huán)唑、咪鮮胺和多菌靈在抑制分生孢子形成上更具優(yōu)勢(shì)。