張鴻超, 陳德勇, 韓 瑩, 陳捷胤,戴小楓, 孔志強(qiáng)*,, 顏廷才

(1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，沈陽 110866；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100193；3. 塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū) 阿拉爾 843300)

黃瓜種植過程易發(fā)生病蟲害，目前主要通過化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，但由于連續(xù)大量使用化學(xué)農(nóng)藥，使得病蟲害的抗藥性增加，農(nóng)藥使用量進(jìn)一步加大，且因黃瓜果實(shí)成熟期短和安全間隔期不足，導(dǎo)致黃瓜中農(nóng)藥殘留甚至超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)升高[1-2]。

目前，國內(nèi)登記用于黃瓜病蟲害防治的藥劑多達(dá)幾百種，但在黃瓜種植過程中仍然存在使用未登記農(nóng)藥的現(xiàn)象，如以調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的多效唑、防治黃瓜紅蜘蛛的丁氟螨酯以及防治黃瓜赤霉病的丙硫菌唑?yàn)榇淼霓r(nóng)藥殘留處于監(jiān)管盲區(qū)，導(dǎo)致其使用存在安全隱患。此外，噴施到植物上的農(nóng)藥母體有10%～20% 轉(zhuǎn)化為其代謝產(chǎn)物[3]，這些代謝物表現(xiàn)出的遷移性、持久性及毒性等各不相同[4]。如丁氟螨酯在環(huán)境中會(huì)轉(zhuǎn)化成復(fù)雜的代謝產(chǎn)物，主要代謝產(chǎn)物中B-3 對(duì)哺乳動(dòng)物毒性大，難降解，對(duì)環(huán)境和人類都有潛在的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

目前，關(guān)于黃瓜中農(nóng)藥檢測(cè)方法主要有液相色譜 (LC)[6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLCMS/MS)[7-8]、氣相色譜 (GC)[9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (GC-MS/MS)[10]等，但同時(shí)檢測(cè)黃瓜中多效唑、戊唑醇、丙硫菌唑等6 種農(nóng)藥及3 種代謝物(丁氟螨酯代謝物B-3、三唑酮代謝物三唑醇、苯醚甲環(huán)唑代謝物CGA205375) 殘留的分析方法尚未見報(bào)道，且目前已有的結(jié)果大多是在單次直接施用農(nóng)藥后進(jìn)行試驗(yàn)獲得的，而在實(shí)際設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，農(nóng)藥常為多次頻繁使用，不斷累積造成了農(nóng)藥的 “持久” 殘留[11]。因此，本研究選擇設(shè)施蔬菜-黃瓜中常用的6 種農(nóng)藥，參照其在設(shè)施蔬菜生產(chǎn)過程中的施藥劑量與殘留水平，設(shè)置了推薦劑量和極端施藥劑量 (5 倍推薦劑量) 兩種劑量，通過QuEChERS 前處理方法，采用UPLCMS/MS 法測(cè)定其在黃瓜中的消解動(dòng)態(tài)及代謝規(guī)律，以期為其在黃瓜上的科學(xué)施用提供理論依據(jù)并指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC 液相色譜儀， Xevo TQ-S micro Triple Quadrupole Mass Spectrometry 質(zhì)譜儀和MassLynx 工作軟件，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (美國Waters 公司)；十萬分之一天平 (瑞士Mettler Toledo 公司)；渦旋混勻器(Scientific Industries 公司)；Centrifuge 5424 高速冷凍離心機(jī) (德國 eppendorf 公司)；VX-Ⅲ 多管渦旋振蕩器 (北京安簡(jiǎn)科技有限公司)；EVAPTM111 氮吹儀 (美國OA 公司)；Cleanert MAS-Q 2 mL Centrifuge Tube 固相萃取填料 (天津博納艾杰爾公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：丙硫菌唑 (prothioconazole)、丁氟螨酯代謝物B-3[(2-(trifluoromethyl) benzamide)]、丁氟螨酯 (cyflumetofen)、苯醚甲環(huán)唑 (difenoconazole)、三唑酮 (triadimefon)、戊唑醇 (tebuconazole)、多效唑 (paclobutrazol)、苯醚甲環(huán)唑代謝物CGA205375(difenoconazole-alcohol)、三唑酮代謝物三唑醇 (triadimenol)，質(zhì)量濃度均為1000 μg/mL，購于天津阿爾塔科技有限公司。田間試驗(yàn)藥劑信息見表1。乙腈 (色譜級(jí)，99.0%)， 購自Macklin 公司 (中國)，甲酸 (色譜級(jí)) ，購自賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽由國藥化學(xué)試劑有限公司 (中國上海) 提供。

表1 6 種田間試驗(yàn)藥劑信息Table 1 Commercial information of 6 pesticides

1.2 田間試驗(yàn)與取樣

田間試驗(yàn)根據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[12]于2020 年5 月在北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)趙前旗蔬菜大棚進(jìn)行，共劃分為3 個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，分別設(shè)5 倍推薦劑量和推薦劑量及空白對(duì)照組，每個(gè)小區(qū)面積為16 m2，小區(qū)間設(shè)1 m 寬的保護(hù)行。于黃瓜植株掛果期施藥1 次，采取噴霧方式分別施用推薦劑量和5 倍推薦劑量的混合農(nóng)藥，分別于施藥后2 h 及1、3、5、7、10、14、21 d，采收成熟健康可食用果實(shí)，于 ?20 ℃下保存，待測(cè)。

1.3 樣品前處理

稱取10 g (精確至0.1 g) 均質(zhì)后的黃瓜樣品于50 mL 聚乙烯離心管中，加入1.0 g 的L-半胱氨酸鹽酸鹽與10.0 mL 乙腈提取，高速渦旋振蕩勻漿5.0 min 后，加入6 g 硫酸鎂與1.5 g 氯化鈉，高速渦旋振蕩1.0 min 后，于4000 r/min 下離心5.0 min；準(zhǔn)確吸取1.5 mL 上清液，加入裝有Cleanert MASQ 2mL Centrifuge Tube (150 mg MgSO4，50 mg PSA，15 mg GCB) 固相萃取填料的試管中，高速渦旋振蕩30 s，于8000 r/min 下離心5.0 min；取上清液，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，供UPLC-MS/MS分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 (用作添加回收、校準(zhǔn)和對(duì)照溶液)：9 種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (1000 μg/mL)各取1 mL 置于10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，配成100 μg/mL 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于 ?20 ℃保存，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 (用于繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線)：用乙腈稀釋上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度在0.001～0.8 μg/mL 之間的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 (用于繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算添加回收率)：取空白黃瓜樣品，按1.3 節(jié)中前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋上述混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成0.001～0.8 μg/mL 的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 儀器檢測(cè)條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)；柱溫40 ℃；樣品室溫度4 ℃；流動(dòng)相及梯度洗脫條件見表2，流動(dòng)相A 相為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水，B 相為乙腈；進(jìn)樣量5 μL；流速0.5 mL/min。

表2 流動(dòng)相及洗脫梯度Table 2 Mobile phase and elution gradient

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描 (ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。毛細(xì)管電壓2.20 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；錐孔氣流量150 L/h；脫溶劑氣流量1000 L/h；碰撞氣體壓力270 kPa。詳細(xì)質(zhì)譜離子參數(shù)見表3。

表3 6 種農(nóng)藥及3 種代謝物質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Mass spectrometry parameters of 6 pesticides and their 3 metabolites

1.6 數(shù)據(jù)處理

參照文獻(xiàn)[13]，利用SigmaPlot version 12.0(Systat Software Inc. Point Richmond，CA) 一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合農(nóng)藥在黃瓜中的消解趨勢(shì)。

基質(zhì)效應(yīng)的存在會(huì)影響方法的準(zhǔn)確性和靈敏度。評(píng)價(jià)凈化劑的凈化效果時(shí)，應(yīng)考慮分析方法的基質(zhì)效應(yīng) (Me)，基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算公式見式 (1)。

式中，km為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，ks為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)Me在80%～120%之間時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略；當(dāng)Me>120%時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)Me<80%時(shí)為基質(zhì)減弱效應(yīng)[14]。

1.7 添加回收試驗(yàn)

稱取10.0 g (精確至0.1 g) 空白黃瓜樣品于離心管中，分別添加0.001、0.01、0.05、0.1 和0.5 mg/kg 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)5 次，按1.4 節(jié)及1.5 節(jié)的方法進(jìn)行前處理及測(cè)定，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法驗(yàn)證

根據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[12]要求，通過線性、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限(LOD) 和定量限 (LOQ) 等參數(shù)驗(yàn)證方法是否滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。結(jié)果表明：按1.5 節(jié)的條件測(cè)定，該方法實(shí)現(xiàn)了黃瓜基質(zhì)中9 種分析物較好的分離，無干擾峰 (圖1)。在0.001～0.8 μg/mL 之間，9 種分析物的線性方程決定系數(shù) (R2)均大于0.99，表明該方程線性關(guān)系良好。以10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的添加水平作為定量限 (LOQ)，則9 種分析物的LOQ 在0.001～0.01 mg/kg 之間 (表4)。

表4 9 種分析物在黃瓜中的線性方程、決定系數(shù)、回收率、基質(zhì)效應(yīng)及定量限Table 4 Linear equation, R2, recovery, matrix effect and LOQ of 9 analytes in cucumber

續(xù)表4Table 4 (Continued)

圖1 9 種分析物總離子色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of 9 analytes

Me在87.00%～102.55%之間，表明不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)[14]。故本研究采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線或黃瓜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析均可。

9 種分析物在黃瓜中的平均回收率在71%～105%之間，RSD 在1.7%～8.8%之間，小于20%，可滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求[12]。

2.2 6 種農(nóng)藥在黃瓜中的消解動(dòng)態(tài)

本研究中農(nóng)藥殘留量是指使用農(nóng)藥后，殘存在黃瓜果實(shí)中的農(nóng)藥母體或代謝物的量。除丙硫菌唑外，其余5 種農(nóng)藥 (多效唑、三唑酮、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、丁氟螨酯) 在黃瓜中的消解動(dòng)態(tài)均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。按照表1 推薦劑量和5 倍推薦劑量施用，2 h 后黃瓜樣品中5 種農(nóng)藥的殘留量分別為0.0064～0.021、0.73～3.7、0.49～2.1、2.7～12 及0.12～0.68 mg/kg，5 種農(nóng)藥在黃瓜中的殘留量均與施藥時(shí)間成指數(shù)關(guān)系，可用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行擬合，其消解動(dòng)態(tài)曲線見圖2。由表5 可知，5 種農(nóng)藥在黃瓜中的半衰期在3.15～9.62 d 之間，均屬于易降解農(nóng)藥 (< 30 d)。多效唑在黃瓜中的半衰期為4.31～7.15 d，其5 倍推薦劑量下的半衰期與推薦劑量下的相差最大，延長(zhǎng)2.84 d，施藥后 5～7 d 消解率達(dá)到85%，21 d后未檢出，與楊銳[15]關(guān)于多效唑在番茄中的殘留研究結(jié)果相吻合。三唑酮在黃瓜中的半衰期為3.15～5.21 d，施藥后7～10 d 消解率為 95%，與前人[16-17]的研究結(jié)果相吻合。戊唑醇在黃瓜中的半衰期為3.35～4.62 d，施藥后7～10 d 消解率為 95%，與李洪等[18]的研究結(jié)果一致。苯醚甲環(huán)唑在黃瓜中的半衰期為4.29～4.66 d，5～7 d 消解率為 90%，施藥后 21 d 未檢出，與周松等[16]關(guān)于其在草莓果實(shí)中半衰期4.09 d 的結(jié)果相符。丁氟螨酯在黃瓜中的半衰期為6.90～9.62 d，10～14 d 消解率為80%，21 d 后未檢出，與李敏敏等[19]關(guān)于丁氟螨酯在土壤中的半衰期大于10 d 相比，存在一定的差距，這可能是因?yàn)槎》サ南馀c有氧和厭氧環(huán)境、光解作用的影響有關(guān)。從總體數(shù)據(jù)看，在極端施藥 (5 倍推薦劑量) 條件下，除丙硫菌唑外，其余5 種農(nóng)藥的半衰期都比推薦劑量下有不同程度延長(zhǎng)。農(nóng)藥的降解與農(nóng)藥性質(zhì)、初始濃度、環(huán)境pH 值、溫濕度、作物栽培條件及作物生長(zhǎng)狀況等因素有關(guān)，在不同條件下，半衰期有不同程度的變化。吳祥為[20]的研究表明，農(nóng)藥的半衰期與其使用劑量和施藥頻次相關(guān)，高劑量施用會(huì)明顯抑制農(nóng)藥的降解并導(dǎo)致半衰期延長(zhǎng)。三唑酮、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑均屬于內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，其揮發(fā)性、極性、空氣-水分配系數(shù)、辛醇-水分配系數(shù)各不相同。丙硫菌唑按推薦劑量施藥后殘留量低于LOQ，在5 倍推薦劑量下，2 h 的殘留量為0.053 mg/kg，1 d 后低于LOQ，這可能是因?yàn)楸蚓虻南馑俾史浅？?，極容易被氧化，更容易受環(huán)境因素的影響[20-21]。

表5 5 種農(nóng)藥在黃瓜中的消解動(dòng)力學(xué)方程、半衰期及決定系數(shù)Table 5 Dissipation kinetic equation, dissipation rate constant, half-life,and determination coefficient of 5 pesticides in cucumber

圖2 5 種農(nóng)藥在黃瓜中的消解動(dòng)態(tài)Fig. 2 Dissipation dynamics of 5 pesticides in cucumber

2.3 代謝物消解動(dòng)態(tài)

圖3 為丁氟螨酯、苯醚甲環(huán)唑、三唑酮3 種母體對(duì)應(yīng)代謝物的消解動(dòng)態(tài)。推薦劑量下，丁氟螨酯代謝物B-3 在施藥后5 d 達(dá)到最大值 (0.0047 mg/kg) ；5 倍推薦劑量下，施藥后3 d 達(dá)到最大值(0.0081 mg/kg)，21 d 時(shí)依然能檢測(cè)到B-3 殘留，與Wang 等[21]的研究結(jié)果趨勢(shì)一致，說明丁氟螨酯代謝物性質(zhì)較穩(wěn)定，在不同生態(tài)環(huán)境條件下殘留差異不明顯。由于B-3 的毒性大于母體化合物[21]，殘留時(shí)間比母體化合物長(zhǎng)，因此在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析中其代謝物的殘留分析不容忽視。與B-3 的趨勢(shì)相同，在推薦劑量下，三唑酮代謝物三唑醇在施藥后5 d 達(dá)到最大值 (0.044 mg/kg)；5 倍推薦劑量下，在施藥后3 d 達(dá)到最大值 (0.12 mg/kg)，但在14 d 后沒有檢測(cè)到其殘留，可能是因?yàn)槿蛲脑汲练e量相對(duì)較少，與蘭騰芳等[22]關(guān)于三唑酮在小麥和土壤中消解動(dòng)態(tài)的研究結(jié)果相似。苯醚甲環(huán)唑代謝物CGA205375 在推薦劑量下于施藥后3 d 達(dá)到最大值 (0.034 mg/kg)；5 倍推薦劑量下同樣在施藥后3 d 達(dá)到最大值(0.051 mg/kg)，在10 d 后未檢測(cè)到其殘留。CGA205375 在黃瓜中消解速率較快，可能是因?yàn)橹参锛?xì)胞自身代謝較強(qiáng)和在大氣中易光解所致。

圖3 B-3，CGA205375 和三唑醇在黃瓜中的殘留消解動(dòng)態(tài)Fig. 3 Residual dissipation dynamics of B-3, CGA205375 and triadi menol in cucumber

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-MS/MS 技術(shù)，通過田間試驗(yàn)對(duì)黃瓜中6 種常用農(nóng)藥 (多效唑、戊唑醇、丙硫菌唑、苯醚甲環(huán)唑、丁氟螨酯、三唑酮) 的消解動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，除丙硫菌唑外，其余5 種農(nóng)藥在黃瓜中的消解動(dòng)態(tài)均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，在極端施藥 (5 倍推薦劑量)條件下，5 種農(nóng)藥的半衰期均有不同程度延長(zhǎng)。本研究同時(shí)針對(duì)CGA205375、B-3 和三唑醇3 種代謝物的殘留動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究。研究結(jié)果可為設(shè)施蔬菜的日常監(jiān)控及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供數(shù)據(jù)支撐。