廖文通

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510330）

氯霉素為呈白色或微黃色的針狀、片狀晶體，無臭，味苦，熔點(diǎn)為149～153 ℃；易溶于乙醇、丙酮和乙酸乙酯，微溶于水、乙醚和氯仿，不溶于苯和石油醚。在室溫下pH值為2～9的水溶液中，氯霉素能穩(wěn)定存在24 h以上，蒸餾水煮沸5 h也不會(huì)影響它的活性。氯霉素作為一種廣譜抗生素，過去在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用，但是它本身的毒副作用較強(qiáng)，殘留在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)食物鏈傳給人類，會(huì)危害人體健康。《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)）中明確規(guī)定：禁止氯霉素及其鹽、酯在所有食品動(dòng)物中使用；《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規(guī)定：氯霉素在所有動(dòng)物源性食品中不得檢出[1]。目前，食品中氯霉素的檢測技術(shù)方法較多，且人員、環(huán)境、技術(shù)操作等因素均會(huì)影響檢測結(jié)果，因此檢驗(yàn)人員必須加強(qiáng)質(zhì)量控制。

1 食品中氯霉素的來源和危害

1.1 氯霉素的來源

近年來的監(jiān)督檢查中發(fā)現(xiàn)，在部分動(dòng)物性食品如雞、鴨、豬、牛和魚肉中檢測出氯霉素。這些氯霉素主要來源于3個(gè)方面：①為防止動(dòng)物生病，促進(jìn)動(dòng)物生長，縮短養(yǎng)殖周期，動(dòng)物養(yǎng)殖過程中在飼料內(nèi)違規(guī)添加氯霉素；②水產(chǎn)品運(yùn)輸過程中保存活力，尤其是海鮮產(chǎn)品長途運(yùn)輸中，在水中加入氯霉素延長海鮮的存活時(shí)間，降低死亡率，從而獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益；③飼養(yǎng)過程中的水質(zhì)出現(xiàn)外源性污染，這種情況比較少見。

1.2 氯霉素的危害

氯霉素本身既是一種抗生素，也是一種殺菌劑，對革蘭陽性菌和陰性菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌以及肺炎球菌等引起的感染有較高的治療效果。作為藥物服用時(shí)，氯霉素口服后經(jīng)胃腸吸收，每6 h服用0.5 g，血藥濃度維持在 4 μg·mL-1以上；口服 15 mg·kg-1后，2 ～ 3 h達(dá)到血藥濃度峰值為10～20 μg·mL-1；靜脈用藥時(shí)，同等劑量下的血藥濃度峰值稍高于該數(shù)值。

但是，食品中殘留的氯霉素，經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體后會(huì)帶來嚴(yán)重危害。①長期攝入微量氯霉素，人體會(huì)對部分細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，造成體內(nèi)正常菌群失調(diào)。造成這一情況的原因是細(xì)菌在乙酰轉(zhuǎn)移酶的介導(dǎo)作用下，導(dǎo)致氯霉素失活以及部分細(xì)菌改變了膜的通透性，導(dǎo)致氯霉素不能進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)。②氯霉素直接攻擊血液系統(tǒng)，會(huì)提高再生障礙性貧血、白血病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，通過血象檢查可以進(jìn)行監(jiān)測評估。③新生兒和嬰幼兒可能發(fā)生灰色綜合征，表現(xiàn)為腹脹、嘔吐、紫紺、呼吸淺表和循環(huán)障礙等癥狀[2]。由于新生兒和嬰幼兒的肝臟發(fā)育不全，腎臟排泄能力較差，發(fā)生灰色綜合征的死亡率約為40%。

2 酶聯(lián)免疫吸附法在食品氯霉素檢測中的應(yīng)用

氯霉素?zé)o色無味，消費(fèi)者在購買、食用過程中肉眼無法鑒別，因此必須采用專業(yè)的檢測技術(shù)手段檢測食品中的氯霉素殘留。目前常用方法有微生物法、免疫法、色譜法以及光譜法等，本文僅對酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）在食品氯霉素檢測中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

2.1 反應(yīng)原理

ELISA法的檢測原理是利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)，即酶標(biāo)記物與樣品中的氯霉素、微孔中的抗體進(jìn)行競爭反應(yīng)[3]。反應(yīng)過程中，若樣品中的氯霉素含量高，競爭反應(yīng)的酶標(biāo)記物越多，微孔中抗體與酶標(biāo)記物的結(jié)合減少，顯色后氯霉素含量與樣品吸光度值呈反比，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出定量結(jié)果。

2.2 儀器試劑

ELISA法檢測食品中的氯霉素，需要的儀器包括酶標(biāo)儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、勻漿器、振蕩器、冷凍離心機(jī)、微量移液器、電子天平和氮?dú)獯蹈裳b置等。使用的試劑均達(dá)到分析純標(biāo)準(zhǔn)，主要有乙酸乙酯、乙腈、正己烷、鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液和氯霉素ELISA試劑盒等。

2.3 操作步驟

樣品制備完成后，ELISA法操作步驟如下。①在不同微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入完成前處理的樣品溶液。②在每一個(gè)微孔中加入酶標(biāo)記物。③溶液與酶標(biāo)記物充分混合后，置于室溫下避光靜置溫育。④去除微孔中的反應(yīng)液，加入洗液洗滌，重復(fù)進(jìn)行3次，并使用吸水紙拍干。⑤在微孔中加入底物溶液，充分混合，置于室溫下避光靜置溫育。⑥在微孔中加入反應(yīng)終止液。⑦使用酶標(biāo)儀判定波長為450 nm的數(shù)據(jù)。⑧結(jié)果判定。計(jì)算樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值（B）與零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值（B0）的比值；以B/B0值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)半對數(shù)曲線；根據(jù)樣品的B/B0值，從曲線上讀出對應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)即可。

2.4 技術(shù)優(yōu)勢

ELISA法檢測食品中的氯霉素，其技術(shù)優(yōu)勢包括：①檢測范圍廣，可對雞鴨、魚蝦蟹、牛奶、血清、肌肉、飼料與蜂蜜等進(jìn)行檢測；②檢測效率高，樣品預(yù)處理簡單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，檢測數(shù)十個(gè)、上百個(gè)樣品僅需幾個(gè)小時(shí)；③檢測精度和靈敏度高，回收率在80%～120%。區(qū)兌鵬等[4]采用酶聯(lián)免疫法快速檢測水產(chǎn)品中的氯霉素、氟苯尼考、硝基呋喃類代謝物，其靈敏度高、快速簡便，適用于水產(chǎn)品的快速批量檢測。劉姚等[5]則采用直接競爭ELISA法檢測蜂蜜中的氯霉素殘留，結(jié)果檢出限為0.15 ng·g-1，定量限為0.33 ng·g-1，回收率在97.58%～100.94%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)小于11%。

3 食品中氯霉素檢測結(jié)果的影響因素及應(yīng)對措施

ELISA法檢測水產(chǎn)品中的氯霉素具有操作簡單、靈敏度高、可批量處理樣品等優(yōu)點(diǎn)，被列為我國的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。但在實(shí)際檢測中，存在假陽性、回收率不穩(wěn)定等問題，直接影響檢測結(jié)果的可靠性?；诖?，從每一個(gè)操作環(huán)節(jié)入手分析影響檢測結(jié)果的因素，并提出有效應(yīng)對措施。

3.1 采樣保存

檢測水產(chǎn)品中的氯霉素，產(chǎn)品對象主要是魚類和蝦類，如草魚、鯉魚、南美白對蝦等。魚蝦樣品采集后，送檢過程中的溫度控制在0～5 ℃，保存溫度為-18 ℃。制取樣品時(shí)，先去皮、去殼，再取肌肉組織，最后經(jīng)均質(zhì)器均質(zhì)處理，以上這些操作環(huán)節(jié)，均可能受到污染，進(jìn)而影響最終的檢測結(jié)果。對此，應(yīng)對措施如下。①魚蝦樣品采集時(shí)，要選擇新鮮的對象，因?yàn)榘l(fā)生腐爛或變質(zhì)的對象有病原菌生長，會(huì)分解抗原抗體的蛋白，對酶標(biāo)記物產(chǎn)生干擾。②制取樣品時(shí)，不能反復(fù)凍融，而是一次性規(guī)范操作完成。反復(fù)凍融過程中，會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響抗原與抗體結(jié)合。

3.2 試劑選用

試劑類型的選擇、試劑盒運(yùn)輸保存方法、試劑的使用過程，也會(huì)影響最終檢測結(jié)果。對此，應(yīng)對措施如下。①優(yōu)選試劑，最好選擇同一廠家的配套試劑，確保試劑滿足檢測試驗(yàn)要求，且處于有效期內(nèi)。②試劑盒在運(yùn)輸過程中，放在有冰袋的保溫盒內(nèi)，縮短運(yùn)輸時(shí)間；保存時(shí)溫度控制在4～8 ℃。一般情況下，按照說明書中的要求進(jìn)行保存即可，防止高溫導(dǎo)致蛋白變性或活性降低。③試劑盒使用時(shí)，從冰箱內(nèi)取出先在室溫下靜置30 min，并且充分搖勻。這是因?yàn)樵噭┖型蝗恢糜谑覝叵?，可能形成水化層，影響溫育時(shí)間，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。④制備試劑時(shí)，在空管內(nèi)先加入稀釋液，再加入稀釋物，并且充分混勻。

3.3 加樣

加樣操作中，加樣量不精確、加樣速度過快，會(huì)影響最終的檢測結(jié)果。對此，應(yīng)對措施如下。①向微孔加入試劑或樣品提取液時(shí)，使用移液器操作，對移液器定期校正，確保精準(zhǔn)度；一個(gè)樣品使用一個(gè)移液頭，避免發(fā)生交叉污染。②加樣時(shí)控制好速度，液體在微孔下方1/3處放注，加在孔壁上部會(huì)影響吸附效果；不能產(chǎn)生氣泡，會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)誤差。③樣品數(shù)量較多時(shí)進(jìn)行分批操作，盡量縮短整個(gè)檢測用時(shí)，避免引起誤差。

3.4 溫育

溫育是ELISA法檢測過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，將微孔板置于恒溫箱中或進(jìn)行水浴處理，該環(huán)節(jié)看似簡單，實(shí)際上很容易出現(xiàn)問題。從ELISA法的原理看，抗原與抗體在固相上結(jié)合反應(yīng)，必須有一定的反應(yīng)條件和時(shí)間。溫育需要的時(shí)間長短和溫度高低是反比關(guān)系，隨著溫度增高，需要的時(shí)間縮短[6]。但是，溫度升高可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，抗原與抗體反應(yīng)結(jié)合物減少，會(huì)降低試驗(yàn)敏感性；時(shí)間縮短對弱陽性樣本不夠友好，由于分子含量低，反應(yīng)不完全易出現(xiàn)假陰性。對此，應(yīng)對措施如下。①根據(jù)試劑盒說明書，確定溫育時(shí)間和溫度，常見的溫度包括2～8 ℃、室溫、37 ℃和43 ℃；如果說明書中給出2個(gè)溫度，試驗(yàn)時(shí)選擇較低的溫度，適當(dāng)延長溫育時(shí)間，確保抗原與抗體充分反應(yīng)。②將微孔板置于恒溫箱中或進(jìn)行水浴處理，從室溫升高至目標(biāo)溫度需要一段時(shí)間，尤其是室溫較低的情況下；不考慮這段時(shí)間，實(shí)際溫育時(shí)間不夠，弱陽性樣本可能檢測不出來。③“邊緣效應(yīng)”是使用96孔板時(shí)，外圍孔的顯色較深、中心孔的顯色較淺；溫育時(shí)盡量采用水浴法，可以排除這一效應(yīng)，提高測定的重復(fù)性。

3.5 洗滌

洗滌是將反應(yīng)液中未與抗原抗體結(jié)合的物質(zhì)、干擾性物質(zhì)排除的過程，雖不是反應(yīng)步驟，但也會(huì)影響最終檢測結(jié)果。采用ELISA法，一般分為人工洗滌、洗板機(jī)洗滌兩種方式，應(yīng)對措施如下。①人工洗滌時(shí)，不同微孔中的液體可能交叉，使用吸水紙拍干時(shí)應(yīng)垂直，防止發(fā)生交叉污染。②洗板機(jī)洗滌時(shí)，洗液量不足、洗板針堵塞是常見問題，應(yīng)經(jīng)常檢查洗液量，及時(shí)補(bǔ)充，觀察沖洗頭是否通暢；洗板后的液體殘留及時(shí)處理，以提高洗滌效果。

3.6 顯色

酶作為一種催化劑，和底物結(jié)合后會(huì)發(fā)生反應(yīng)。酶與底物的催化反應(yīng)需要一定時(shí)間，而且受到反應(yīng)溫度的影響，一般來說溫度越高，反應(yīng)需要的時(shí)間越短。為避免對檢測結(jié)果造成影響，檢驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，控制好反應(yīng)時(shí)間和溫度。顯色完成后，及時(shí)加入終止液，防止顯色變?nèi)跎踔料恕?/p>

3.7 比色

比色使用酶標(biāo)儀完成，其原理為酶與底物一一對應(yīng)，兩者反應(yīng)后生成不同的顯色物，它們的有效吸收波長不同[7]。例如，使用HPR催化TMB，生成的顯色物有效吸收波長是450 nm。酶標(biāo)儀對微孔的測定值，決定了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，測定前使用無塵紙擦除酶標(biāo)板上的水汽，不要影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

3.8 結(jié)果計(jì)算

氯霉素的殘留檢測結(jié)果，以明確的定量數(shù)值進(jìn)行表示，計(jì)算過程與相對吸光值、稀釋倍數(shù)有關(guān)，而且標(biāo)準(zhǔn)半對數(shù)曲線的繪制有一定難度，這些因素也會(huì)影響檢測結(jié)果。對此，應(yīng)對措施如下。①嚴(yán)格按照試劑盒說明書中的要求進(jìn)行計(jì)算，一人計(jì)算，另一人核對，保留所有原始數(shù)據(jù)。②為避免其他因素的干擾，還要做好室內(nèi)質(zhì)控工作，包括儀器設(shè)備的校正、環(huán)境（溫度、濕度）檢測、測試流程的控制等。

4 結(jié)語

綜上所述，食品安全關(guān)系到人們的健康，落實(shí)食品安全檢測工作，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，是從業(yè)人員關(guān)注的要點(diǎn)。本文以ELISA法檢測食品中的氯霉素為核心，介紹了技術(shù)原理和優(yōu)勢，從各個(gè)操作環(huán)節(jié)分析了影響因素和應(yīng)對措施，希望為實(shí)際檢測工作提供參考。食品安全質(zhì)量檢測不僅是社會(huì)關(guān)注的一個(gè)要點(diǎn)，也是保證飲食安全健康的一個(gè)重要手段。相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)和檢驗(yàn)人員只有認(rèn)識(shí)到這一工作的重要性，不斷學(xué)習(xí)新知識(shí)、新技術(shù)，提升職業(yè)技能和綜合素質(zhì)，才能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為食品安全監(jiān)督管理提供數(shù)據(jù)支持。