山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)

楊 倩，李 婷，鮮思美

1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2. 貴州省動(dòng)物疫病研究所，貴州貴陽 550025

白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2， IL-2），主要由Th1型淋巴細(xì)胞分泌，能促進(jìn)T、B細(xì)胞增殖及維持其活性[1]，在IL-2的作用下抗原提呈顯著增強(qiáng)，它對其它細(xì)胞因子的分泌也有一定的促進(jìn)作用，是促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫的一類重要細(xì)胞因子[2]。通過持續(xù)注射一定劑量IL-2，對T細(xì)胞分化成熟有一定效果，并能增加外周血中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力。所以，可以把IL-2與亞單位疫苗或核酸疫苗等聯(lián)用，以作為細(xì)胞因子免疫佐劑，增強(qiáng)免疫效果。目前，人源或不同動(dòng)物來源的IL-2作為細(xì)胞因子佐劑已在多種疫病核酸疫苗研究中得到應(yīng)用[3]。本研究欲構(gòu)建貴州黑山羊IL-2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，為將pVAX1-IL-2作為核酸疫苗免疫佐劑研究提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 主要材料

MDBK細(xì)胞、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、陽性質(zhì)粒pMD19-T-IL-2和pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；IL-2基因ELISA檢測試劑盒購自武漢基因美公司；Lipofatamiane 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank登錄的山羊IL-2基因序列（NM_001287567），利用軟件設(shè)計(jì)一對引物，IL-F：5'-CCCAAGCTTACCACCATGTACAAGCTACAACTCTTG TC-3'，IL-R：5'-CGGAATTCTCAAGTCATTGTTGACTAG ATG-3'，預(yù)擴(kuò)增片段大小為468 bp，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3 山羊IL-2基因擴(kuò)增

以pMD19-T-IL-2克隆質(zhì)粒為DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將質(zhì)粒pMD19-T-IL-2及載體質(zhì)粒pVAX-1經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切并進(jìn)行膠回收，回收純化后的IL-2基因與pVAX1載體利用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化成功的單菌落質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，同時(shí)送往上海英濰捷基公司測序。

1.5 山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞及鑒定

抽提無內(nèi)毒素pVAX1-IL-2質(zhì)粒，利用Lipofatamiane 2000將pVAX1-IL-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染相同劑量的pVAX1載體空載體對照組，正常細(xì)胞為空白對照組。收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行cDNA合成。以cDNA為模板進(jìn)行PCR檢測。同時(shí)收集細(xì)胞上清，采用IL-2 ELISA檢測試劑盒對上清進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 山羊IL-2基因擴(kuò)增

IL-2基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1，條帶大小約為468 bp，與預(yù)期片段大小相符。

圖1 山羊IL-2基因重組克隆質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果M，Marker D2000；1.重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；2.陰性對照

2.2 pVAX1-IL-2質(zhì)粒鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確（圖2、圖3），鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往上海英濰捷基公司測序，測序比對正確。表明貴州黑山羊IL-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，并將其命名為pVAX1-IL-2。

圖2 貴州黑山羊IL-2基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒PCR 鑒定M.DNA Marker D200; 1: 陰性對照; 2和3: IL-2重組真核表達(dá)質(zhì)粒

圖3 貴州黑山羊IL-2基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定M.Marker D2000;1和2:重組山羊IL-2真核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切

2.3 pVAX1-IL-2體外轉(zhuǎn)錄和表達(dá)結(jié)果

提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后，結(jié)果顯示，空白對照組和空載體組未見IL-2基因擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染了pVAX1-IL-2質(zhì)粒的細(xì)胞總RNA中能擴(kuò)增出IL-2基因（圖4）。同時(shí)收集轉(zhuǎn)染后的上清，采用ELISA方法檢測pVAX1-IL-2的表達(dá)，結(jié)果顯示pVAX1-IL-2轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、空白對照組IL-2表達(dá)量分別為112、84.1、72.3pg/mL，pVAX1-IL-2轉(zhuǎn)染組明顯高于空白對照組和空載體組，表明pVAX1-IL-2在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)量較高。

圖4 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-IL-2在細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)果 M.Marker D2000; 1.pVAX1-IL-2轉(zhuǎn)染; 2.空載體組；3. 空白對照組

3 討論

Morgan等最先在小鼠脾臟細(xì)胞上清液中發(fā)現(xiàn)一種能促進(jìn)胸腺細(xì)胞生長的因子，由于其獨(dú)特功能，后命名為IL-2。經(jīng)過多年相關(guān)科研人員的研究證明IL-2不僅僅對T細(xì)胞的增殖和分化起作用，還具有多方面的生物活性[4]。少劑量注射IL-2可促進(jìn)CD4+T的產(chǎn)生，因此與疫苗合用時(shí)可增強(qiáng)疫苗的免疫效果。為取得較好的免疫效果，可通過將IL-2與目的基因構(gòu)建融合質(zhì)粒后注射或單獨(dú)注射IL-2真核表達(dá)質(zhì)粒[5]。本試驗(yàn)以山羊IL-2為研究對象運(yùn)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-IL-2，作為核酸疫苗的細(xì)胞因子佐劑的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。