不同基因型谷子對干旱脅迫的調(diào)控機(jī)制

于國紅，劉朋程，郝洪波，崔海英，郭安強(qiáng)，李明哲

（河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所/河北省農(nóng)作物抗旱研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北衡水053000）

谷子是我國北方地區(qū)主要糧食作物之一，其脫殼后為小米，小米含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)價值較高，其在膳食多樣性和食品安全中是不可或缺的[1]。谷子的種植區(qū)域主要集中在北方干旱和半干旱地區(qū)，其中，河北省是種植面積較大的地區(qū)，但近年來，河北省地下水位嚴(yán)重下降，谷子生長季自然降水量呈減少趨勢[2-3]。因此，對谷子抗旱性進(jìn)行遺傳改良迫在眉睫，而抗旱種質(zhì)資源的鑒選和利用是抗旱育種的重要前提[4]。不同品種間抗旱性強(qiáng)弱差異較大，在利用抗旱種質(zhì)資源前，應(yīng)當(dāng)對其進(jìn)行抗旱性鑒定和篩選[5]。

干旱脅迫下，谷子植株體內(nèi)生理變化、基因表達(dá)情況可作為評價其抗旱性的依據(jù)。由于谷子抗旱機(jī)制較為復(fù)雜，僅用某一生理指標(biāo)或某一基因評價其抗旱性有失偏頗，因此本研究通過分析多個生理指標(biāo)及多個相關(guān)基因在干旱脅迫下的變化，以期闡明不同基因型谷子抗旱調(diào)控機(jī)制。張海燕等[6]發(fā)現(xiàn)，滲透調(diào)節(jié)能力的大小會影響油菜對干旱的適應(yīng)程度，脯氨酸、丙二醛和可溶性糖的含量可以作為體現(xiàn)作物抗旱能力的指標(biāo)[7-8]。李云等[9]和朱永波等[10]認(rèn)為，植物在受到干旱脅迫時，通過改變細(xì)胞體內(nèi)抗氧化酶來維持活性氧的動態(tài)平衡，因此，可以將抗氧化酶作為鑒定抗旱的指標(biāo)。隨著栽培谷子基因組測序的完成與公布，有關(guān)谷子抗旱基因表達(dá)的研究逐漸增加。竇祎凝等[11]通過在擬南芥中過表達(dá)谷子基因SiNAC18進(jìn)行干旱處理試驗(yàn)，結(jié)果表明SiNAC18可能通過 ABA 信號傳導(dǎo)和氧化脅迫調(diào)控等途徑來提高植物抗旱性。王新博等[12]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫誘導(dǎo)小麥植株中TaEF-1α基因上調(diào)表達(dá)，利用VIGS技術(shù)將TaEF-1α基因沉默后，植株葉片下垂，丙二醛含量顯著升高，抗旱性降低。綜合運(yùn)用不同抗旱相關(guān)指標(biāo)分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析和轉(zhuǎn)錄組測序分析手段解析不同基因型谷子抗旱性調(diào)控機(jī)制。孟林等[13]和張娜等[14]對苜蓿和燕麥進(jìn)行抗旱鑒定研究時發(fā)現(xiàn)，隸屬函數(shù)分析和聚類分析得到的抗旱性結(jié)果較一致，兩者共同分析更能增加置信度。本研究通過對不同基因型谷子進(jìn)行抗旱性對比試驗(yàn)，從多方面綜合評價其抗旱性，旨在為抗旱谷子種質(zhì)篩選和新品種培育提供材料，為谷子抗旱調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

盆栽試驗(yàn)于 2020 年 6 月在河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所移動防雨棚內(nèi)進(jìn)行，以豫谷18為對照，以衡谷13和農(nóng)家品系239、280、290、428和718為供試材料。其中，衡谷13由河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所培育，239、280、290、428和718由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所刁現(xiàn)民研究員課題組提供。營養(yǎng)土與蛭石按2∶1的比例混合作為培養(yǎng)基質(zhì)，將每個品種(系)12粒種子點(diǎn)播于白色塑料盆(長80 cm、寬50 cm、高40 cm)中，每盆7個品種(系)，一個品種(系)一行。每個品種(系)3個處理：1)全生長期正常供水；2)谷子8葉期起用12% PEG-6000進(jìn)行干旱脅迫處理，直到取樣； 3)干旱脅迫處理1周后，恢復(fù)正常供水。每個處理6個重復(fù)。干旱脅迫處理前和出現(xiàn)表型后分別取樣，樣品于液氮中速凍，后儲存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)生理指標(biāo)測定和轉(zhuǎn)錄組測序試驗(yàn)。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 生理指標(biāo) 丙二醛 (malondialdehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[15]；脯氨酸(proline,Pro)含量采用酸性茚三酮法測定[16]；可溶性糖(soluble sugar,SS)采用蒽酮比色法測定[17]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定[18]；過氧化物酶(peroxidase,POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[19]；過氧化氫酶(catalase,CAT)活性采用紫外吸收法測定[20]。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序 采用Trizol法提取樣品RNA，用Nanodrop 2000測 OD260、OD280值。為保證測序所用到的RNA 的質(zhì)量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 降解和污染情況。測序利用HiSeqTM2500來完成，測序?qū)嶒?yàn)和數(shù)據(jù)初步分析由華大基因科技股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和作圖分析利用 Microsoft Excel 2013、SPSS 24.0 、Adobe Photoshop CS5 和 Adobe Illustrator CS5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供水條件下不同基因型谷子的農(nóng)藝性狀

谷子農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果(表1)顯示，谷子株高因基因型不同呈現(xiàn)不同程度的差異；同時，生物量也呈現(xiàn)不同程度的差異。與正常供水條件處理相比，干旱處理條件下豫谷18和239的生物量分別減少0.75和0.85 g，而衡谷13、280和290的生物量降低了0.60～0.80 g，而428和718的生物量分別降低1.02和0.77 g；與干旱條件下相比，復(fù)水條件下豫谷18、衡谷13、239、280和290的生物量分別升高了0.09、0.16、0.32、0.15和0.13 g，而428和718由于抗旱性弱，復(fù)水后未出現(xiàn)明顯復(fù)活狀態(tài)。不同基因型谷子抗旱性表現(xiàn)不同。

表1 不同供水條件下不同基因型谷子的農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic traits of different foxtail millet genotypes under different water conditions

2.2 不同供水條件下不同基因型谷子莖部胞容物含量分析

正常供水條件下，7個谷子品種(系)莖部脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量無顯著差異。干旱脅迫條件下，與品種豫谷18相比，品種衡谷13和品系239、280及290脯氨酸含量顯著升高了10.37～51.75 μg/g；而品系428和718分別比豫谷18低6.87和16.45 μg/g。復(fù)水后，與干旱處理相比，每個品種(系)中的脯氨酸含量都有所降低，品種豫谷18、衡谷13和品系239、280、290、428及718莖部脯氨酸含量均降低，降低幅度為14.47～49.18 μg/g(圖1A)。

圖1 不同水分條件下不同基因型谷子莖部部分胞容物含量Fig. 1 Some cellular content in the stem of different genotypes of foxtail millet under different water conditions

干旱脅迫條件下，與品種豫谷18相比，品種衡谷13和品系280、290及239丙二醛含量降低11.84%～40.46%；品系428和718較豫谷18丙二醛含量均顯著升高。與干旱處理相比，復(fù)水處理后，豫谷18、衡谷13和品系239、280、290、428及7 1 8莖部丙二醛含量均降低，降低幅度為10.34%～28.66% (圖1B)。

干旱脅迫條件下，與品種豫谷18相比，品種衡谷13和品系239、280及290可溶性糖含量分別顯著升高40.99%、16.04%、33.28%和19.12%；品系428和718較豫谷18分別顯著降低14.04%和24.64%。復(fù)水后，與干旱處理相比，豫谷18、衡谷13和品系239、280、290、428及718莖部可溶性糖含量均降低，降低幅度分別為36.82%、31.51%、39.53%、23.32%、35.26%、49.94%和53.28% (圖1C)。

2.3 不同供水條件下不同基因型谷子莖部抗氧化酶活性變化

正常供水條件下，在7個品種(系)中3種抗氧化酶活性無顯著性差異。干旱條件下，與豫谷18相比，衡谷13和品系239、280及290的SOD活性升高6.99%～57.52%，而品系428和718與豫谷18沒有顯著差異。復(fù)水后，豫谷18、衡谷13和品系239、280、290、428及718莖部SOD活性均比干旱條件下同一品種有所降低，降低幅度為6.93%～33.02% (圖2A)。

圖2 不同條件下不同基因型谷子莖部部分抗氧化酶活性Fig. 2 Some antioxidant enzyme activities in the stem of different genotypes of foxtail millet under different conditions

干旱脅迫下，衡谷13和品系239、280及290的POD活性分別比豫谷18顯著提高了86.25%、13.54%、87.08%和61.70%，而品系428和718較豫谷18分別顯著降低12.85%和15.95%。復(fù)水后，與干旱脅迫條件下對應(yīng)品種(系)相比，豫谷18、衡谷13和品系239、280、290、428及718莖部POD活性分別降低9.26%、29.66%、9.13%、25.82%、31.85%、3.90% 和 10.90% (圖2B)。

干旱脅迫下，各品種莖部的CAT活性比正常供水均顯著增加。與豫谷18相比，衡谷13和品系239、280及290的CAT活性均升高，升高幅度為11.34%～52.54%；品系428和718較豫谷18分別降低32.79%和38.45%。復(fù)水后，與干旱脅迫條件下對應(yīng)品種(系)相比，豫谷18、衡谷13和品系239、280、290、428及718莖部CAT活性均降低，降低幅度為19.43%～41.82% (圖2C)。

2.4 隸屬函數(shù)分析及聚類分析

根據(jù)莖部生理指標(biāo)計算的隸屬函數(shù)結(jié)果(表2)可知，干旱脅迫和復(fù)水后，隸屬度較大的為衡谷13和品系280，隸屬度最小的為品系718。根據(jù)綜合隸屬度最終得出各品種(系)抗旱性由強(qiáng)到弱依次為280、衡谷13、290、239、豫谷18、428和718。各品種(系)在干旱脅迫下生理指標(biāo)的聚類分析結(jié)果(圖3)顯示，當(dāng)卡方距離為11時，7個品種(系)聚為3類，第一類為抗旱性強(qiáng)的品系280、衡谷13和品系290；第二類為抗旱性中等品系239和豫谷18，第三類為抗旱性弱的品系428和718。

表2 莖部生理指標(biāo)隸屬函數(shù)值及品種(系)抗旱性分析Table 2 Subjection function values of stem physiological indexes and drought resistance analysis of cultivars

圖3 干旱脅迫下不同基因型谷子抗旱性聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of drought resistance of different genotypes of foxtail millet under drought stress condition

2.5 不同供水條件下不同基因型谷子轉(zhuǎn)錄組測序分析

現(xiàn)從不同類型抗旱水平品種(系)中選出豫谷18、衡谷13和428這3個具有代表性的品種(系)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，用以輔助解析不同基因型谷子品種(系)抗旱分子機(jī)理。如圖4A所示，4個組合中的差異表達(dá)基因(DEGs)數(shù)目表現(xiàn)出明顯差異性，PEG0_13 VS PEG0_18對比組中有11773個DEGs；PEG0_428 VS PEG0_18 對比組中有17817個DEGs；PEG12_13 VS PEG12_18 對比組中有 14434 個DEGs；PEG12_428 VS PEG12_18 對比組中有17215個DEGs。PEG0_13 VS PEG0_18對比組與PEG12_13 VS PEG12_18 對比組之間有 8357 個共同的DEGs；PEG0_428 VS PEG0_18對比組與PEG12_428 VS PEG12_18 對比組之間有 13112 個共同的DEGs。

圖4 水分正常和脅迫條件下不同基因型谷子中部分差異表達(dá)基因的特征Fig. 4 Characteristics of partial differential expression genes (DEGs) in different genotypes of foxtail millet under normal and water stress conditions

如圖4B所示，正常供水情況下，品種衡谷13與品種豫谷18相比，前兩者中的抗逆相關(guān)基因整體相對表達(dá)量不高，但是，它們在衡谷13中的相對表達(dá)量略高于在品系428中的相對表達(dá)量。干旱脅迫條件下，干旱脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、氧化酶類基因在衡谷13中的相對表達(dá)量顯著高于在428品系中的相對表達(dá)量。

用GO富集分析圖來表述每一個 GO (基因本體化，gene ontology) term 中 DEGs (差異表達(dá)基因)的最終分配情況(圖5A)。基因SiWRKY12、SiPRX1和SiPRX4通過調(diào)控過氧化物酶活性參與氧化脅迫反應(yīng)；基因SiSCPL50和SiCRSP通過調(diào)控氧化還原酶活性參與絲氨酸類肽酶水解反應(yīng)；基因SiWAT1和SiPRX4通過細(xì)胞膜組分參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；基因SiGLN5主要參與谷氨酰胺合成酶生物合成過程。通過KEGG(京都基因和基因組百科全書,kyoto encyclopedia of genes and genomes,http://www.kegg.jp)富集分析來研究DEGs在各種代謝途徑中的富集情況(圖5B)?；蛟赟iPRX1和SiPRX4在次生代謝物的水平上參與類苯基丙烷生物合成的次生代謝途徑；基因SiGLN5和SiGeG3從能量代謝水平上分別參與氨基酸生物合成和和碳水化合物的代謝途徑；基因SiWRKY12在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平上通過參與MAPK信號途徑來調(diào)控干旱脅迫應(yīng)答及植物-病原互作的防御反應(yīng)。

圖5 不同供水條件下不同基因型谷子中部分DEGs的GO和KEGG特征Fig. 5 GO and KEGG characteristics of DEGs in different genotypes of foxtail millet under different water conditions

3 討論

3.1 不同基因型谷子的抗旱生理水平

干旱脅迫條件下，植物受體內(nèi)脯氨酸含量會明顯增加，從而通過降低植株內(nèi)滲透勢，促進(jìn)抗旱能力提高[21]。干旱脅迫下，植物膜脂過氧化作用會產(chǎn)生丙二醛，其含量的增加明顯破壞植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而降低植物的抗旱性[22]。植物體內(nèi)可溶性糖是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，及細(xì)胞內(nèi)重要有機(jī)溶質(zhì)，可調(diào)節(jié)谷子對不利環(huán)境(如干旱脅迫)的適應(yīng)能力[23]。干旱脅迫下，植物體內(nèi)可溶性糖含量明顯高于正常供水處理，谷子品種抗旱性越強(qiáng)，可溶性糖含量越高[24]。

本研究結(jié)果表明，正常供水條件下，谷子各品種(系)莖部脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量均無顯著性差異。干旱脅迫下，各品種(系)莖部脯氨酸和可溶性糖含量都明顯增加，但是增加幅度有差異，增加幅度由大到小的品種(系)依次為衡谷13、280、290、豫谷18、428和718。MDA是植物受逆境脅迫時膜脂過氧化的最終產(chǎn)物之一，對細(xì)胞有嚴(yán)重的毒害作用，會嚴(yán)重?fù)p傷生物膜，所以丙二醛含量是用來判斷植物體內(nèi)細(xì)胞遭受干旱脅迫程度大小的常用指標(biāo)。在干旱脅迫下，植物體內(nèi)MDA含量越低，細(xì)胞膜受損程度越低，抗旱性越強(qiáng)；反之，MDA含量越高，細(xì)胞膜受損程度越高，抗旱性越弱[21]。干旱條件下，品種(系)衡谷13、280和290中丙二醛含量低于品種豫谷18中的含量，而428和718品系中丙二醛含量顯著高于豫谷18中的含量。綜合分析上述結(jié)果初步得出結(jié)論，干旱脅迫下，與豫谷18相比，品種(系)衡谷13、280和290細(xì)胞的毒害和損傷程度較低，抗旱能力較強(qiáng)；428和718則相反。

干旱條件下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生超氧自由基、過氧化氫等活性氧，活性氧的積累會導(dǎo)致脂類、核酸以及糖類物質(zhì)的損傷。植物需動員整個防御系統(tǒng)如SOD、POD和CAT來抵抗過氧化帶來的傷害，而防御系統(tǒng)中抗氧化酶活性的高低決定了植物受傷害的程度，從而反映植物對逆境的耐受能力[25]。本研究結(jié)果表明，與正常供水相比，干旱條件下各品種(系)SOD、POD、CAT活性都明顯增加。與豫谷18相比，干旱脅迫下衡谷13、239、280和290的SOD、POD、CAT活性均增加，而品系428和718中的POD、CAT活性均降低。說明干旱脅迫下，品種(系)衡谷13、280和290能夠迅速清除干旱脅迫產(chǎn)生的自由基，可以更好地抵抗干旱脅迫，而品系428和718清除自由基速度相對緩慢，更容易受到過氧化傷害。

3.2 不同基因型谷子的抗旱分子水平

干旱脅迫下，植物中與抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如AP2、ZF和WRKY等表達(dá)量明顯上調(diào)。前人研究表明，玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmWRKY106提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱和抗熱性[26]。轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY12促使大豆的耐旱耐鹽性提高[27]。杜梨轉(zhuǎn)錄因子PbrWRKY53通過調(diào)控基因PbrNCED1的表達(dá)來參與維生素C的生成，從而對提高植物的抗旱性起到積極作用[28]。轉(zhuǎn)錄因子基因SiWRKY12(登錄號：M_004956363.2)在PEG12_13 VS PEG12_18對比組和PEG12_428 VS PEG12_18對比組中的相對表達(dá)量分別為3.16和2.37，而在PEG0_13 VS PEG0_18 對比組和PEG0_428 VS PEG0_18對比組中的相對表達(dá)量在0.45左右，此結(jié)果表明，基因SiWRKY12在干旱脅迫下表達(dá)量明顯上調(diào)，可能通過參與MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝途徑來提高作物的抗旱性。前人研究表明，過表達(dá)基因AgAPX1擬南芥通過增加抗壞血酸含量來提高轉(zhuǎn)基因株系的抗旱性[29]。過氧化物酶基因SiPRX1(登錄號：XM_004987211.4)在 PEG12_13 VS PEG12_18 對比組和PEG12_428 VS PEG12_18對比組中的相對表達(dá)量分別為4.04和2.25，而在PEG0_13 VS PEG0_18對比組和PEG0_428 VS PEG0_18對比組中的相對表達(dá)量在?3.45左右，此結(jié)果表明，基因SiPRX1在干旱脅迫下表達(dá)量明顯上調(diào)，其可能通過參與抗氧化反應(yīng)途徑來提高作物的抗旱性。研究表明，干旱條件下谷氨酰胺合成酶突變體GS2中脯氨酸含量明顯低于野生型，表明GS2參與脯氨酸響應(yīng)干旱脅迫的代謝途徑[30]。過表達(dá)谷氨酰胺合成酶基因TaGSs煙草的抗旱性明顯高于受體[31]。過表達(dá)松樹谷氨酰胺合成酶基因GS1a引起轉(zhuǎn)基因白楊的抗旱性增強(qiáng)[32]。谷氨酰胺合成酶同工酶基因SiGLN5(登錄號：XM_004985100.4)在 PEG12_13 VS PEG12_18 對比組和PEG12_428 VS PEG12_18對比組中的相對表達(dá)量分別為3.3和1.39，而PEG0_13 VS PEG0_18 對比組和PEG0_428 VS PEG0_18對比組中的相對表達(dá)量為?0.3和?2.28，結(jié)果表明，基因SiGLN5在干旱脅迫下表達(dá)量明顯上調(diào)，并且在衡谷13中表達(dá)量明顯高于品系428。研究發(fā)現(xiàn)，抗旱小麥與干旱敏感小麥的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，前者中的葡聚糖內(nèi)-1,3-β-葡糖苷酶蛋白豐度明顯高于后者中該蛋白的豐度[33]。葡聚糖糖苷酶基因SiGeG3(登錄號：XM_004968936.2)在 PEG12_13 VS PEG12_18 對比組和PEG12_428 VS PEG12_18對比組中的相對表達(dá)量分別為5.38和1.66，而在PEG0_13 VS PEG0_18 對比組和PEG0_428 VS PEG0_18對比組中的相對表達(dá)量為0.72和?1.03，此結(jié)果表明，基因SiGeG3在干旱脅迫下表達(dá)量明顯上調(diào)，并且在衡谷13中表達(dá)量顯著高于品系428。在干旱條件下，428、豫谷18和衡谷13品種(系)中的抗旱基因上調(diào)表達(dá)程度依次提高，這表明3個品種(系)的抗旱性依次增強(qiáng)，此結(jié)果與生理指標(biāo)測定結(jié)果相符，進(jìn)一步為不同基因型谷子抗旱性鑒定提供了分子理論依據(jù)。

4 結(jié)論

供試7個谷子品種(系)中，抗旱性較強(qiáng)的品種(系)為280、衡谷13和290，抗旱性中等的品種(系)為豫谷18和239，抗旱性較差的為品系428和718。不同品種(系)通過啟動體內(nèi)WRKY等轉(zhuǎn)錄因子和谷氨酰胺合成酶等生物功能基因，使其不同程度地表達(dá)而改變部分胞容物含量和抗氧化酶活性，最終實(shí)現(xiàn)自身不同的抗旱性。