鈣信號(hào)抑制劑加劇低鉀脅迫對(duì)煙草幼苗光合特性及鉀吸收的影響

代曉燕，徐高強(qiáng)，石秋環(huán)，王英鋒，陳培鈺，張銅津，劉 燦，張小全*，符云鵬

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；2 河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司，河南洛陽(yáng)471023）

鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，它直接參與植物光合作用、滲透調(diào)節(jié)等重要生理過(guò)程[1-2]，且能改善煙葉顏色、身份、燃燒性和吸濕性，并對(duì)一些芳香類物質(zhì)的合成積累有促進(jìn)作用[3]。但由于我國(guó)北方植煙土壤鉀固定及南方土壤鉀淋失問(wèn)題，導(dǎo)致我國(guó)植煙土壤供鉀能力不足及鉀肥利用率低等現(xiàn)象一直存在，嚴(yán)重影響著我國(guó)煙葉鉀含量[4]，因此，研究低鉀脅迫下調(diào)控?zé)熤赈浳盏年P(guān)鍵因子尤為重要。煙株鉀吸收與外界鈣濃度之間的關(guān)系十分復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)，增加外源鈣濃度可促進(jìn)煙株對(duì)鉀的吸收[5-6]，但濃度過(guò)高則會(huì)抑制鉀吸收[7]。本課題組前期研究結(jié)果表明，外源添加適當(dāng)?shù)腃a2+濃度可促進(jìn)煙株K+吸收，但過(guò)高的Ca2+濃度則會(huì)抑制煙株K+吸收，水培條件下鈣濃度為5 mmol/L時(shí)最利于煙株生長(zhǎng)發(fā)育及鉀吸收[8]。其實(shí)Ca2+作為第二信使是植物響應(yīng)低鉀脅迫最重要的信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)之一[9]。逆境刺激下，Ca2+從細(xì)胞外環(huán)境通過(guò)細(xì)胞膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致胞質(zhì)Ca2+濃度升高并流向細(xì)胞核，細(xì)胞核中的Ca2+可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的磷酸化或去磷酸化，進(jìn)而調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。植物在低鉀環(huán)境下可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，隨后結(jié)合鈣信號(hào)傳感器包括鈣調(diào)蛋白(CaM)、CaM樣蛋白(CML)、鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B 亞基樣蛋白(CBL)、與CBL相互作用的蛋白激酶(CIPK)等，對(duì)逆境因子進(jìn)行感知、解碼，引導(dǎo)植物響應(yīng)低鉀脅迫[11]。徐江等[12]研究表明，在低鉀水平下，擬南芥胞內(nèi)增加的游離Ca2+與鈣傳感器結(jié)合激活CIPK，進(jìn)而通過(guò)磷酸化激活A(yù)KT1，促進(jìn)植物鉀的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，提高植株耐低鉀能力。此外，鈣信號(hào)途徑是植物光合作用中光能吸收和轉(zhuǎn)化的重要傳導(dǎo)通路之一[13]。當(dāng)植物面臨環(huán)境刺激時(shí)，葉綠體中的鈣振蕩觸發(fā)下游事件進(jìn)而調(diào)節(jié)光合途徑[14]。例如，Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以調(diào)節(jié)依賴葉黃素循環(huán)的非光化學(xué)猝滅(NPQ)[15]。王旭等[16]研究表明,鈣離子濃度變化可影響低氧脅迫下黃瓜的葉綠素?zé)晒狻Ｑ芯恐参锛?xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)的常見(jiàn)方法之一，是通過(guò)添加Ca2+抑制劑影響細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度變化進(jìn)而阻礙鈣信號(hào)的產(chǎn)生。異搏定(Vp)是一種Ca2+通道有機(jī)阻斷劑；氯化鑭(LaCl3)是一種Ca2+通道無(wú)機(jī)抑制劑；EGTA是一種Ca2+螯合劑，通過(guò)螯合細(xì)胞外的Ca2+，從而降低細(xì)胞質(zhì)的Ca2+濃度。研究表明，鈣通道抑制劑可直接抑制煙草原生質(zhì)體向外整流的鉀離子傳導(dǎo)[17]。

目前，有關(guān)鈣信號(hào)及其傳感器參與調(diào)控植株鉀吸收的研究已有報(bào)道，但低鉀脅迫下鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與響應(yīng)煙草鉀吸收和維持光合作用關(guān)系的機(jī)理尚缺乏深入研究。通過(guò)研究鈣信號(hào)抑制劑對(duì)低鉀脅迫下煙草光合特性和鉀吸收的影響，解析鈣信號(hào)傳導(dǎo)與煙株響應(yīng)低鉀能力和光合功能維持的關(guān)系，以期為提高植物體內(nèi)鉀素含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)

供試材料為煙草品種K326，試驗(yàn)于2020年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家煙草栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。種子消毒催芽后，選大小均勻的煙苗移栽到裝有珍珠巖的小黑盆中，每日補(bǔ)充Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液，然后放置在光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件為：晝溫(28±2)℃，夜溫(18±2)℃，光周期14 h，相對(duì)濕度65%～70%，光照強(qiáng)度4000 lx。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)包括常鉀水平 (K+5 mmol/L)和低鉀水平(K+0.15 mmol/L)；兩個(gè)鉀水平下，均設(shè)添加鈣通道抑制劑異搏定 50 μmol/L (Vp)、氯化鑭 200 μmol/L(LaCl3)、鈣離子螯合劑乙二醇雙2-氨基乙醚四乙酸2.5 mmol/L (EGTA) 3個(gè)處理，均設(shè)置不抑制鈣對(duì)照，常鉀水平的對(duì)照記為CK(+)、低鉀水平的對(duì)照記為CK(-)，共8個(gè)處理。待煙苗長(zhǎng)至3片真葉時(shí)選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的煙苗，于蒸餾水中進(jìn)行鉀饑餓處理24 h，再分別置于不同鉀水平的Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液中處理8 天，營(yíng)養(yǎng)液每4 天更換一次。鉀處理8天后同時(shí)進(jìn)行鈣抑制處理。EGTA使用時(shí)用氫氧化鈉按100 mg/mL比例進(jìn)行溶解，pH調(diào)節(jié)至6.5～7.0。培養(yǎng)期間，使用充氣泵每日通氣8 h。處理4天后，取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，每處理6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 測(cè)試指標(biāo)和方法

1.3.1 根系及地上部鮮重和干重 分別取植株根系及地上部稱鮮重，在105℃烘箱中殺青15 min，并于65℃烘干至恒重，分別測(cè)定地上部及根系干重。

1.3.2 植株生理特征 采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測(cè)定葉片中的可溶性蛋白含量[18]。取鮮樣6份，各0.1 g，放進(jìn)50 mL離心管中，加入10 mL蒸餾水后室溫下浸泡處理12 h，采用電導(dǎo)率儀(DDS-307型)測(cè)定提取液電導(dǎo)率R1，沸水浴加熱30 min后冷卻，搖勻后測(cè)定提取液電導(dǎo)率R2，得到相對(duì)電導(dǎo)率=R1/R2×100%[19]。

1.3.3 活性氧積累量 根據(jù)H2O2與硫酸鈦可生成黃色的過(guò)氧化鈦復(fù)合物，利用其在415 nm有特征吸收的性質(zhì)測(cè)定植株葉片中H2O2含量，根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)按步驟測(cè)定(試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；同理測(cè)定超氧陰離子含量。

1.3.4 葉片抗氧化酶活性 葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性采用核黃素NBT法測(cè)定；過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[19]測(cè)定。

1.3.5 光合作用 每個(gè)處理選取6株長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的煙苗，選擇第3片真葉用光合儀CIRAS-3 (PP-systems，英國(guó))測(cè)定凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、水汽壓飽和虧、水分利用率等光合參數(shù)，測(cè)定環(huán)境條件嚴(yán)格控制，其中光強(qiáng)(PAR)設(shè)定為 1000 μmol/(m2?s)，CO2摩爾分?jǐn)?shù)為390 μmol/mol，溫度為25℃，測(cè)定時(shí)間為上午9:00—11:00。

1.3.6 葉綠素含量的測(cè)定 取鮮樣0.3 g，共3份，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3 mL 96%乙醇研成勻漿，再加乙醇10 mL，繼續(xù)研磨至組織變白，靜置3～5 min后用乙醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻，利用酶標(biāo)儀測(cè)定葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量[18]。

1.3.7 植株各部位鉀含量測(cè)定 將樣品烘干研磨粉碎并過(guò)0.2 mm篩后，精確稱量0.1000 g，采用1 mmol/L鹽酸提取法[20]，使用FP6400火焰光度計(jì)測(cè)定植株地上部及根系鉀含量。

1.3.8 鉀吸收及鈣通道相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量 鉀處理8天后同時(shí)添加不同鈣信號(hào)抑制劑，處理4天后取根部于液氮中。鉀吸收及鈣通道相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定：使用GeneMark公司試劑盒提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，根據(jù)ABM公司試劑盒將待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在IQ5光循環(huán)儀系統(tǒng)(Bio-Rad)中使用SYBR Green PCR Master Mix (中國(guó)天根生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行RT-qPCR分析。PCR程序：95℃ 3 min，95℃ 5 s，58℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。內(nèi)參基因?yàn)闊煵軳tActin基因，引物序列見(jiàn)表1，最后采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)量。

表1 煙草鉀離子吸收相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes related to potassium absorption in tobacco

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用DPS (v 7.05)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，利用GraphPad Prism (v 8.0.2)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣抑制劑處理對(duì)不同鉀水平下煙株生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.1.1 植株地上部及根系的鮮重和干重 如表2所示，低鉀水平下CK(-)植株地上部及根系的鮮重和干重顯著低于常鉀水平CK(+)，其中低鉀水平下地上部和根系鮮重、干重分別比常鉀水平下降低了51.58%、59.29%和48.19%、39.82%。在低鉀水平下，3個(gè)鈣抑制劑處理的植物地上部及根系的鮮重和干重較CK(-)顯著增加，Vp、LaCl3、EGTA處理地上部鮮重和干重與CK(-)相比分別增加了39.06%、67.81%、57.19%和58.54%、90.24%、68.29%，根鮮重和干重較CK(-)分別顯著增加了55.00%、59.00%、45.00%和30.94%、25.18%、29.98%。常鉀水平下3個(gè)鈣抑制劑處理植株地上部和根系干鮮重與CK(+)相比差異均不顯著。

表2 不同鉀水平下不同鈣抑制劑處理煙株地上部及根系鮮重和干重(g/plant)Table 2 Fresh and dry weight of shoots and roots of tobacco plants under different Ca inhibition treatments at normal and low K supply levels

2.1.2 植株葉片可溶性蛋白含量及相對(duì)電導(dǎo)率 無(wú)鈣抑制處理，低鉀水平下的葉片可溶性蛋白含量和相對(duì)電導(dǎo)率與常鉀水平相比，分別顯著增加了39.37%和44.31%。鈣抑制劑處理增加了常鉀水平下葉片可溶性蛋白含量。在低鉀水平下，Vp處理的葉片可溶性蛋白含量與CK(-)相比無(wú)顯著變化，LaCl3和EGTA處理顯著高于CK(-) (圖1)。兩種鉀水平下，鈣抑制劑處理的植株相對(duì)電導(dǎo)率均比CK(+)或CK(-)顯著增加(圖1)。

圖1 不同鉀水平下鈣抑制劑處理對(duì)植株葉片可溶性蛋白含量及相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig. 1 Effects of Ca inhibition treatments on soluble protein content and relative electrical conductivity of plants leaves under normal and low potassium levels

2.1.3 活性氧積累量 如圖2所示，無(wú)鈣抑制處理時(shí)，低鉀水平下葉片過(guò)氧化氫和超氧陰離子含量均高于常鉀水平，其中低鉀水平下CK(-)與常鉀水平CK(+)相比過(guò)氧化氫含量顯著提高了69.86%。兩種鉀水平下，3個(gè)鈣抑制劑處理煙草葉片過(guò)氧化氫和超氧陰離子含量與CK(+)或CK(-)相比均顯著增加，其中低鉀水平下Vp、LaCl3、EGTA 3個(gè)鈣抑制劑處理與CK(-)相比分別增加59.96%、64.23%、151.40%(圖2)，超氧陰離子含量分別顯著增加了23.54%、23.54%、15.17% (圖2)。

圖2 不同鉀水平下鈣抑制劑處理對(duì)植株葉片活性氧積累量的影響Fig. 2 Effects of Ca inhibition treatments on accumulation of active oxygen of plants leaves under normal and low potassium levels

2.1.4 葉片抗氧化酶活性 如圖3所示，不進(jìn)行鈣抑制處理，常鉀水平植株葉片抗氧化酶過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著高于低鉀處理。進(jìn)行鈣抑制劑處理后，常鉀水平葉片Vp、LaCl3和EGTA處理的POD活性與CK(+)相比分別顯著降低了51.00%、52.49%、60.60% (圖3)，低鉀水平葉片Vp、LaCl3和EGTA處理的SOD活性與CK(-)相比分別降低了37.42%、33.81%和10.07% (圖3)。

圖3 不同鉀水平下鈣抑制劑處理對(duì)植株葉片抗氧化酶活性的影響Fig. 3 Effects of Ca inhibition treatments on antioxidant enzyme activities of plant leaves under normal and low potassium levels

2.2 不同鉀水平下鈣抑制劑處理對(duì)煙株葉片光合特性的影響

2.2.1 葉綠素含量 如表3所示，無(wú)鈣抑制處理時(shí)，常鉀水平下CK(+)葉片葉綠素a含量顯著高于低鉀水平CK(-)，葉綠素b含量無(wú)差異。但從整體上看，兩種鉀水平下，3個(gè)鈣抑制劑處理的葉綠素含量與CK(+)或CK(-)相比明顯降低(葉綠素a含量低鉀LaCl3處理除外)，其中常鉀水平下，3個(gè)鈣抑制處理與CK(+)相比顯著降低。低鉀水平下，除施加Vp外，其余處理的葉綠素b含量與CK(-)相比顯著降低，且Vp、LaCl3和EGTA葉綠素總含量與CK(-)相比分別降低了16.94%、12.42%和42.42%。

表3 不同鉀水平下鈣抑制劑處理植株葉片葉綠素含量(mg/g)Table 3 Chlorophyll content of plant leaves under different Ca inhibition treatments at normal and low K supply levels

2.2.2 葉片光合特性 如圖4所示，除水汽壓飽和虧外，無(wú)鈣抑制處理時(shí)，低鉀水平CK(-)與正常鉀水平CK(+)相比，光合特性指標(biāo)凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、水分利用率分別顯著降低了15.79%、20.24%、12.44%、23.08%、39.52%，無(wú)論常鉀水平還是低鉀水平下，3個(gè)鈣抑制劑處理與CK(+)或CK(-)相比，葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率和水分利用率均明顯降低，其中凈光合速率、胞間CO2濃度、水分利用率顯著降低。常鉀水平下，Vp、LaCl3、EGTA鈣抑制劑處理的凈光合速率與CK(+)相比分別顯著降低了73.68%、46.05%、48.68%，低鉀水平下分別顯著降低了32.81%、21.88%、73.44%。常鉀水平下，Vp、LaCl3、EGTA鈣抑制劑處理的氣孔導(dǎo)度與CK(+)相比分別顯著降低了53.57%、32.14%、63.10%；胞間CO2濃度分別顯著降低31.10%、15.78%、30.08%。低鉀水平下，施加LaCl3、EGTA處理的蒸騰速率與CK(-)相比分別顯著降低了35.00%、60.00%。無(wú)鈣抑制處理時(shí)，低鉀植株葉片的水汽壓飽和虧顯著高于常鉀處理。2種鉀水平下，3個(gè)鈣抑制劑處理的水汽壓飽和虧與CK(+)或CK(-)相比顯著升高。低鉀水平下，Vp、LaCl3、EGTA鈣抑制劑處理的水分利用率與CK(-)相比分別顯著降低了26.67%、32.00%、45.33%。

圖4 不同鉀水平下鈣抑制劑處理對(duì)植株葉片光合特性的影響Fig. 4 Effects of Ca inhibition treatments on photosynthetic characteristics of plants leaves under normal and low potassium levels

2.3 不同鉀水平下鈣抑制劑處理對(duì)煙株體內(nèi)鉀素含量的影響

2.3.1 植株各部位鉀含量 由表4可知，鉀水平和鈣抑制劑以及兩者互作對(duì)植株地上部和根系鉀含量的影響不同，鉀水平對(duì)地上部和根系鉀含量的貢獻(xiàn)率均最高，分別為60.38%和79.77%；其次是鈣通道抑制劑和螯合劑，貢獻(xiàn)率分別達(dá)到32.09%和13.73%；兩者互作對(duì)于鉀含量的貢獻(xiàn)率最低。

表4 不同的鉀水平和鈣通道抑制劑或螯合劑處理對(duì)植株鉀含量影響的方差分析Table 4 Variance analysis of effects of different potassium levels and calcium channel inhibitor or chelating agents on potassium concentration in plant

如圖5所示，無(wú)論是根系還是地上部，無(wú)鈣抑制處理時(shí)，常鉀水平下其鉀素含量顯著高于低鉀水平，CK(-)比CK(+)地上部鉀含量顯著降低了39.31%，根系鉀含量顯著降低了77.05%。低鉀水平下，Vp、LaCl3、EGTA鈣抑制劑處理的地上部鉀含量與CK(-)相比分別降低了22.95%、32.94%、20.73%，平均降低25.54%；根系鉀含量分別顯著降低了55.24%、62.34%、42.49%，平均降低53.36%。常鉀水平下，添加鈣通道抑制劑和螯合劑后煙株地上部和地下部鉀含量也顯著降低。

圖5 不同鉀水平下鈣抑制劑處理對(duì)植株地上部及根系鉀素含量的影響Fig. 5 K content in plant shoots and roots as affected by Ca inhibition under normal and low K supply levels

2.3.2 植株根系鉀吸收及鈣通道相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量 如圖6可知，低鉀水平下植株根系中NKT2、NtKC1、NtHAK1、NtHAK5、NtCNGC1、NtCNGC11基因的相對(duì)表達(dá)量整體上高于常鉀處理，其中，低鉀水平CK(-)的NKT2、NtKC1、NtHAK1、NtHAK5基因的相對(duì)表達(dá)量與常鉀水平CK(+)相比分別顯著提高了2.09、3.32、3.23、12.34倍。低鉀脅迫下，Vp、LaCl3、EGTA鈣抑制劑處理的根系NKT2、NtKC1、NtHAK1、NtHAK5、NtCNGC1、NtCNGC11基因的相對(duì)表達(dá)量與CK(-)相比顯著降低，其中NKT2基因的相對(duì)表達(dá)量分別降低了61.61%、55.48%、64.72%，平均降低了60.60%；NtKC1分別降低了34.95%、43.37%、73.53%，平均降低了50.62%；NtHAK1分別降低了34.09%、39.32%、42.43%，平均降低了38.61%；NtHAK5分別降低了80.28%、68.95%、60.14%，平均降低了69.79%；NtCNGC1分別降低了96.83%、98.59%、90.64%，平均降低了95.36%；NtCNGC11分別降低了81.65%、87.99%、91.47%，平均降低了87.05%。常鉀水平下，當(dāng)施加3個(gè)鈣抑制處理時(shí)，根系中NtHAK1、NtHAK5基因表達(dá)量與未添加鈣抑制劑時(shí)相比有明顯增加，但NtCNGC1和NtCNGC11基因的相對(duì)表達(dá)量與CK(+)相比則顯著降低。

3 討論

本研究結(jié)果表明，與常鉀水平相比低鉀脅迫顯著降低植株地上部及根系的干物質(zhì)積累，這與實(shí)驗(yàn)室前期的研究[8，21]結(jié)果一致。前人研究表明，在低鉀脅迫下過(guò)量的活性氧(ROS)會(huì)嚴(yán)重抑制植株的生長(zhǎng)發(fā)育[22]，而鈣信號(hào)的有效傳導(dǎo)可提高抗氧化酶活性，減輕活性氧積累并維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，低鉀脅迫下施加鈣信號(hào)抑制劑處理的植株抗氧化酶活性明顯降低，ROS含量卻顯著升高，其原因可能是鈣信號(hào)被抑制后植株無(wú)法通過(guò)提高自身抗氧化酶活性來(lái)降低活性氧引起的損傷。這說(shuō)明鈣信號(hào)傳導(dǎo)在提高植株抗逆性中起重要作用。

煙草是一種喜光作物，光合作用是決定其產(chǎn)量品質(zhì)的重要因素之一[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，未施加鈣信號(hào)抑制劑時(shí)，常鉀水平下的光合特性(除水汽壓飽和虧外)顯著高于低鉀處理，這與徐新翔等[25]研究結(jié)果一致，說(shuō)明外界鉀素水平可影響作物的光合作用。研究表明，逆境脅迫對(duì)葉綠素及光合機(jī)構(gòu)的影響與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)，活性氧可抑制光和系統(tǒng)PSⅡ損傷修復(fù)功能，但鈣信號(hào)傳導(dǎo)可直接激活一些抗氧化酶，并在逆境脅迫下維持光合系統(tǒng)的穩(wěn)定性[26]。本研究表明，低鉀脅迫下，施加鈣抑制劑處理后，植株光合特性(除水汽壓飽和虧外)及葉綠素總含量明顯降低，這說(shuō)明低鉀脅迫下鈣信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制后，煙草葉片葉綠素難以合成，進(jìn)而影響植株的光合作用。結(jié)合活性氧的結(jié)果，本研究推測(cè)低鉀脅迫下抑制鈣信號(hào)傳導(dǎo)后光合作用降低的可能原因是超量的ROS破壞了光合器官器質(zhì)性[27]，抑制了煙株葉綠素的合成及光合作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，外施鈣抑制劑處理可以顯著影響低鉀脅迫下煙草根系和地上部鉀含量。未施加鈣信號(hào)抑制劑時(shí)，低鉀脅迫下，植株地上部及根系鉀含量顯著降低，這與王英鋒等[8]研究結(jié)果一致，但在施加鈣信號(hào)抑制劑后，兩種鉀水平處理下，植株地上部及根系鉀含量顯著降低，說(shuō)明抑制鈣信號(hào)傳導(dǎo)后不利于煙株對(duì)鉀的吸收。雙因素方差分析結(jié)果表明，外界鉀水平對(duì)煙株鉀吸收的貢獻(xiàn)率最高，地上部及根系分別為60.38%和79.77%，但施用鈣抑制抑制劑抑制鈣信號(hào)傳導(dǎo)后，鈣抑制劑與鉀水平二者互作的貢獻(xiàn)率急劇下降。由于在煙草鉀吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中K+通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因鑒定研究較少，因此本研究結(jié)合其他作物如擬南芥、水稻等并根據(jù)在煙草中鑒定出的基因，重點(diǎn)分析目前普遍公認(rèn)的在低鉀水平下參與調(diào)控植物鉀吸收的幾個(gè)重要的基因表達(dá)量。其中NKT2可調(diào)控細(xì)胞膜電壓并負(fù)責(zé)參與K+轉(zhuǎn)運(yùn)，擬南芥中的AtKC1是根毛鉀離子吸收通道的重要組成單位，HAK是鉀離子高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能介導(dǎo)植物根系對(duì)鉀離子的吸收，并響應(yīng)低鉀脅迫[28-29]，CNCG家族成員參與鈉離子、鉀離子及鈣離子等陽(yáng)離子的吸收，并調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育，其中NtCNGC1、NtCNGC11在根中具有較高的表達(dá)量[30]。本試驗(yàn)中，未施加鈣信號(hào)抑制劑時(shí)，低鉀植株的鉀吸收相關(guān)基因表達(dá)量顯著高于常鉀水平，說(shuō)明低鉀脅迫可增加鉀吸收相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，提高植株響應(yīng)低鉀的能力，但低鉀水平屬于一種逆境脅迫，低鉀下植株鉀素含量顯著低于常鉀植株。低鉀脅迫下施加鈣信號(hào)抑制劑后，植株根系中NKT2、NtKC1、NtHAK1、NtHAK5、NtCNGC1、NtCNGC11基因的相對(duì)表達(dá)量顯著減少，研究認(rèn)為鈣信號(hào)通過(guò)調(diào)控根系中鉀通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平參與煙草鉀素的吸收。近幾年大量研究發(fā)現(xiàn)，鈣信號(hào)傳導(dǎo)參與調(diào)控植株體內(nèi)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鉀離子通道對(duì)K+的吸收，如低鉀脅迫下，超量ROS誘導(dǎo)鈣信號(hào)產(chǎn)生并激活CBLCIPK通路調(diào)控AtHAK5轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[31]；AtCBL1-AtCIPK23復(fù)合物可磷酸化AtHAK5，增加AtHAK5對(duì)擬南芥根系吸鉀的影響[32]。也有研究表明，低鉀水平下編碼AKT1通道陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子CIPK23基因的相對(duì)表達(dá)量增加，而編碼AKT1通道的負(fù)調(diào)節(jié)因子CBL10基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)[33]；OsAKT1介導(dǎo)的水稻根系鉀離子吸收受OsCBL1-OsCIPK23復(fù)合物的調(diào)節(jié)等[34]。植物鉀吸收是多種復(fù)雜代謝機(jī)制的綜合體現(xiàn)[35]。例如，超量表達(dá)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因雖能促進(jìn)植株的生長(zhǎng)，但并不能增加鉀的吸收和積累[36]，本研究發(fā)現(xiàn)低鉀脅迫下，施加鈣通道抑制劑或螯合劑會(huì)顯著增加植株地上部及根系生物量，但鉀吸收相關(guān)基因表達(dá)量及鉀含量卻顯著降低。本研究認(rèn)為低鉀脅迫下，鈣信號(hào)與ROS之間存在某種關(guān)聯(lián)，并通過(guò)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)抗氧化酶活性和鉀吸收相關(guān)基因的表達(dá)介導(dǎo)植物吸鉀，其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低鉀脅迫可明顯抑制煙草葉片光合作用及鉀吸收。低鉀脅迫下，通過(guò)添加鈣通道抑制劑或螯合劑抑制鈣信號(hào)傳導(dǎo)后可導(dǎo)致煙株葉片抗氧化酶活性和光合作用降低，活性氧積累，各部位鉀含量和根系中NKT2、NtKC1、NtHAK1、NtHAK5、NtCNGC1、NtCNGC11的相對(duì)表達(dá)量減少，造成植株K+吸收量減弱。