朱星揚(yáng)，朱潔瑩，錢 旭，賈 啟，2，金磊磊，陳集雙，2

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京211800；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 生物資源健康利用研究中心，貴州 遵義563000）

金釵石斛（Dendrobium nobile）是蘭科石斛屬多年生的草本植物，得名于其花的外觀類似于古代婦女頭上的佩飾——金釵［1］。金釵石斛是我國傳統(tǒng)記載中入藥最早的石斛，也是我國中醫(yī)行業(yè)歷代相傳的名貴中草藥，現(xiàn)已被收錄于《中華人民共和國藥典》［1］。根據(jù)《本草綱目》中記載其具有“強(qiáng)陰益精，厚腸胃，壯筋骨，補(bǔ)腎益力輕身延年”的作用，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中也描述金釵石斛具有“益胃生津，滋陰清熱”的功效［1］。金釵石斛的提取物主要具有抗腫瘤和抗誘變，抗白內(nèi)障和抗炎，抗氧化和抗衰老，降血糖和血脂、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用［2－6］。金釵石斛的化學(xué)成分主要有生物堿類、多糖類、酚類和倍半萜類等，其中生物堿類中的石斛堿是其特征成分［7－8］。

而目前被《中國藥典》收錄的共有5種石斛，其中金釵石斛中的生物堿含量最高［9］，石斛堿是從金釵石斛莖中提取分離出的一種吡咯里西啶衍生物類生物堿，在鐵皮石斛、黃草石斛和環(huán)草石斛等石斛中含量很低［10－11］。石斛堿具有止痛解熱，降心率、降血壓及解巴比妥中毒等作用。經(jīng)研究證明，人工石斛堿合成步驟多，回收率低，因此目前主要是從植物中獲取石斛堿［12］。

由于野生金釵石斛的資源匱乏，而有研究結(jié)果表明原球莖與野生植株的總生物堿的含量基本一致［13］，這使得利用植物組織培養(yǎng)物來代替野生石斛資源已成為必然趨勢［14－15］。目前，用于石斛組織培養(yǎng)的外植體主要有種子、莖段、葉片和幼根等［16－17］，而對于金釵石斛組織培養(yǎng)的研究主要集中在種子萌發(fā)，原球莖誘導(dǎo)與培養(yǎng)的條件優(yōu)化［18］，種苗繁育與栽培等方面［19－20］。

誘導(dǎo)子脅迫會(huì)影響植物中組織次生代謝產(chǎn)物的累積。有研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)子可調(diào)控生物的合成途徑，從而起到增加植物次生代謝物產(chǎn)量的作用［21］。目前，提高金釵石斛石斛堿產(chǎn)量的主要方法有：1）通過改變栽培環(huán)境，利用菌根真菌共培養(yǎng)［22－23］，2）調(diào)控不同的光質(zhì)比例［24］，3）施用不同的肥料提高金釵石斛的石斛堿含量［25］。在各種誘導(dǎo)子中，化學(xué)誘導(dǎo)劑（水楊酸、茉莉酸甲酯及金屬離子等）已被用于許多植物［26］，以增加生物活性化合物的積累［27］。研究發(fā)現(xiàn)：適量的水楊酸不僅能夠誘導(dǎo)長春花幼苗中蛇根堿和水甘草堿的積累［28－29］，也能夠促進(jìn)霍山石斛原球莖中生物堿的含量增加［30］。李芳［31］對在生長中的嫩葉用Cu2＋處理后，發(fā)現(xiàn)喜樹堿含量較對照組提高了67.4%。Yruela等［32］發(fā)現(xiàn)銅供應(yīng)不足會(huì)改變植物新陳代謝的基本功能，阻礙光合系統(tǒng)電子傳遞。Assche等［33］發(fā)現(xiàn)過量的金屬離子會(huì)影響酶的催化作用，從而影響植物的生長。

本課題組在建立金釵石斛原球莖液體懸浮培養(yǎng)體系后，通過改變誘導(dǎo)子CuSO4的添加時(shí)間、添加濃度、添加后的培養(yǎng)時(shí)間，比較分析其對金釵石斛原球莖生長以及石斛堿含量的影響，以期為今后利用金釵石斛原球莖為工業(yè)原料規(guī)模化生產(chǎn)石斛堿及發(fā)展石斛藥用資源提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

金釵石斛植株采自貴州省赤水市，待其開花后選擇優(yōu)良株系進(jìn)行人工授粉，以收獲的種莢為試驗(yàn)材料。

1.1.2 培養(yǎng)基

萌發(fā)培養(yǎng)基：1／2 MS培養(yǎng)基，蔗糖30 g／L，馬鈴薯30 g／L，萘乙酸（NAA）0.2 mg／L，瓊脂5.5 g／L；pH 5.8。

固體增殖培養(yǎng)基：1／2 MS，蔗糖30 g／L，馬鈴薯30 g／L，6-芐基腺嘌呤（6-BA）1.5 mg／L，NAA 0.5 mg／L，瓊脂5.5 g／L；pH 5.8。

液體增殖培養(yǎng)基：1／2 MS，蔗糖30 g／L，馬鈴薯30 g／L，6-BA 1.5 mg／L，NAA 0.5 mg／L；pH 5.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種莢表面的消毒

先用去離子水將優(yōu)良的未開裂的種莢沖刷30 min，然后置于滅菌后的超凈工作臺(tái)上，待表面消毒。將種莢置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中浸泡1 min，滅菌水沖洗3次；體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞浸泡12 min，滅菌水沖洗6次，期間不斷晃動(dòng)；再用無菌的濾紙吸去表面水分，獲得無菌的種莢，待用。

1.2.2 種子的萌發(fā)

在無菌的牛皮紙上，用刀將無菌種莢的一端切開一個(gè)小口，再用鑷子夾著種莢的另一端，將無菌的籽粒勻稱撒落在萌發(fā)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4～6周后，可獲得肉眼可見的淺黃色胚體。

1.2.3 原球莖繼代增殖培養(yǎng)

接種種子萌發(fā)的小球狀胚體到原球莖的增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～7周，可得到石斛原球莖材料，擴(kuò)繁備用。

1.2.4 金釵石斛原球莖的生長示意

金釵石斛原球莖的生長示意見圖1。

圖1 金釵石斛原球莖模式Fig.1 Pattern of the D.nobile protocorm

1.2.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將生長狀態(tài)統(tǒng)一，顏色一致的金釵石斛原球莖按40 g／L接種量接種至50 mL液體培養(yǎng)基上。1）在第20天分別添加5個(gè)不同濃度CuSO4，濃度分別是0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)20 d；2）在不同培養(yǎng)時(shí)間（10、20、30、40、50 d）添加0.25 mmol／L的誘導(dǎo)子CuSO4，繼續(xù)培養(yǎng)20 d；3）在第20天時(shí)添加0.25 mmol／L的誘導(dǎo)子CuSO4后，培養(yǎng)不同時(shí)間（5、10、15、20、25、30 d）。每個(gè)處理組均設(shè)置3次重復(fù)，每次的重復(fù)量均為5瓶，測定原球莖的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及石斛堿的含量。

1.2.6 培養(yǎng)條件

溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12 h／d。

1.3 測量指標(biāo)和方法

1.3.1 原球莖鮮質(zhì)量及干質(zhì)量

培養(yǎng)結(jié)束后，將原球莖從固體瓶中取出，經(jīng)蒸餾水沖洗3次后，用濾紙吸干表面水分，稱鮮物質(zhì)量。然后放入冷凍干燥機(jī)中凍干48 h，稱干物質(zhì)量。

原球莖增殖系數(shù)＝（培養(yǎng)后新鮮原球莖的質(zhì)量－接種時(shí)新鮮原球莖質(zhì)量）／接種時(shí)新鮮原球莖的質(zhì)量。

1.3.2 石斛堿的測定方法

參照2015版《中國藥典》［34］的方法提取與檢測樣品中石斛堿的含量。

1）色譜條件

色譜柱為HP－5毛細(xì)管柱（柱長為30 m，內(nèi)徑為0.25 mm，膜厚度為0.25 μm），程序升溫：初始溫度為80℃，以10℃／min的速率升溫至250℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測器溫度為250℃。

2）萘內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱定萘適量，加甲醇后制成25 μg／mL的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

3）供試品溶液的制備

精密稱定樣品粉末，置于圓底燒瓶中，以1∶25（g／mL）的料液比精密加入體積分?jǐn)?shù)0.05%的甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。取過濾液2 mL和內(nèi)標(biāo)溶液1 mL于容量瓶，并定容至5 mL，搖勻，即得供試品溶液。

4）石斛堿對照品溶液的制備

精密稱定石斛堿對照品適量，加甲醇制成1.6 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。

5）校正因子的測定

精密量取對照品溶液2 mL，再加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL置于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，吸取1 mL，注入氣相色譜儀，計(jì)算校正因子F。

6）樣品中石斛堿含量的計(jì)算

式中：A1為樣品峰面積，A2、C2分別為樣品中內(nèi)標(biāo)物的峰面積和質(zhì)量濃度（μg／mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24軟件進(jìn)行單因素分析，并檢測各均值在0.05水平上是否具有差異顯著性，用Origin 2017進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 金釵石斛原球莖的誘導(dǎo)及其形成過程

通過體視顯微鏡對金釵石斛原球莖萌發(fā)過程進(jìn)行了觀察分析，結(jié)果見圖2。由圖2（a）可知：金釵石斛果莢被消毒剖開后，種子接入培養(yǎng)基時(shí)，種胚并未形成。由圖2（b）可知：培養(yǎng)4 d時(shí)，種皮吸水膨脹，細(xì)長的種胚中少數(shù)細(xì)胞開始啟動(dòng)并持續(xù)分裂而形成分生組織，之后種胚形成，并逐漸膨大。由圖2（c）可知：培養(yǎng)10 d左右，種胚膨大，分生組織細(xì)胞持續(xù)分裂，逐漸突破種皮。由圖2（d）可知：培養(yǎng)16 d時(shí)，完全突破種皮，形成小球狀胚體，形成微小的原球莖。

圖2 金釵石斛原球莖的形成過程Fig.2 The development process of D.nobile protocorm

2.2 LC -MS定性測定金釵石斛中的石斛堿

通過LC -MS測定金釵石斛不同組織中石斛堿的成分，結(jié)果見圖3。由圖3（a）可知：在金釵石斛石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品中測定了石斛堿的成分出峰時(shí)間及相對分子質(zhì)量。由圖3（b）和（c）可知：以石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品作為參照，金釵石斛原球莖和金釵石斛鮮莖段中的石斛堿在相對定性的條件下，可以判斷金釵石斛原球莖中存在石斛堿。

圖3 LCMS測定金釵石斛不同部位中的石斛堿Fig.3 Dendrobine in different parts of D.nobile was determined by LC-MS

2.3 CuSO4于不同添加時(shí)間對金釵石斛原球莖生物量和石斛堿的影響

原球莖未處理組在不同培養(yǎng)時(shí)間生物量的變化見表1。從表1可以看出：未處理組的原球莖隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，生物量也隨之增加，25～30 d原球莖增殖系數(shù)的增殖速率最高，達(dá)到0.40。最適培養(yǎng)周期為40 d，此時(shí)原球莖生物量達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)至50和60 d時(shí)，鮮質(zhì)量趨于穩(wěn)定，部分原球莖顏色變黃，且出現(xiàn)褐化死亡現(xiàn)象，干質(zhì)量也隨之減少。CuSO4于不同添加時(shí)間對原球莖生物量的影響見表2。從表2可以看出：金釵石斛原球莖培養(yǎng)至10～40 d時(shí)，鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均不斷增加。20～30 d時(shí)，鮮質(zhì)量增加最為明顯，增加了0.15 g，其原因可能是原球莖正處于對數(shù)生長期，生長速率高。于原球莖培養(yǎng)20 d時(shí)添加誘導(dǎo)子CuSO4，原球莖正處于對數(shù)生長初期，誘導(dǎo)子CuSO4脅迫原球莖產(chǎn)生了應(yīng)激防御物質(zhì)，致使原球莖產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，干物質(zhì)量增加。在原球莖培養(yǎng)30～40 d時(shí)添加誘導(dǎo)子CuSO4，原球莖處于對數(shù)生長末期，原球莖增殖系數(shù)較20 d增大明顯。說明原球莖對誘導(dǎo)子CuSO4引起的脅迫作用有一定的抵抗能力，誘導(dǎo)子CuSO4脅迫作用不明顯，干質(zhì)量無明顯變化。于不同時(shí)間添加誘導(dǎo)子CuSO4對原球莖生物量的積累有一定的影響。

表1 培養(yǎng)時(shí)間對未處理組原球莖生物量的影響Table 1 Effect of culture time on biomass of protocorm culture in untreated group

表2 CuSO4于不同添加時(shí)間對原球莖生物量的影響Table 2 Effect of different addition time of CuSO4 on protocorm biomass

圖4 為CuSO4于不同添加時(shí)間對原球莖石斛堿含量的影響。由圖4可知：在培養(yǎng)時(shí)間為10～20 d時(shí)，添加誘導(dǎo)子CuSO4，石斛堿的產(chǎn)量迅速增加，最高可達(dá)29.65 μg／g。可能是由于原球莖在培養(yǎng)初期，誘導(dǎo)子CuSO4抑制了原球莖的快速生長，使部分原球莖出現(xiàn)褐化死亡，迫使原球莖產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物石斛堿。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為20～40 d時(shí)，原球莖快速增殖生長，石斛堿的產(chǎn)量呈下降趨勢。其原因可能是在該期間內(nèi)，原球莖增殖系數(shù)增長較快，表明其新陳代謝活力較為旺盛，對誘導(dǎo)子CuSO4具有一定的抵制作用，降低了誘導(dǎo)子CuSO4對原球莖產(chǎn)石斛堿的刺激作用。

圖4 CuSO4于不同添加時(shí)間對原球莖石斛堿含量的影響Fig.4 Effect of different addition time of CuSO4 on the dendrobine content in protocorm

2.4 不同CuSO4添加濃度對金釵石斛原球莖生物量和石斛堿的影響

不同CuSO4添加濃度對原球莖生物量的影響見表3。由表3可知：在金釵石斛原球莖培養(yǎng)過程中，添加不同濃度的誘導(dǎo)子CuSO4會(huì)對金釵石斛原球莖有一定的影響。當(dāng)濃度為0.25 mmol／L時(shí)，原球莖鮮質(zhì)量最高為（2.72±0.09）g，增殖系數(shù)達(dá)到0.36，表明適宜濃度的Cu2＋有利于原球莖的生長與增殖，原球莖通過復(fù)雜的機(jī)制調(diào)控Cu2＋的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，形成動(dòng)態(tài)平衡，從而提高原球莖的代謝水平。同時(shí)，干質(zhì)量也達(dá)到最大量為（2.72±0.02）g，表明適宜濃度的Cu2＋參與原球莖的代謝調(diào)控有助于代謝產(chǎn)物的積累。當(dāng)CuSO4濃度繼續(xù)增加時(shí)，鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均呈下降趨勢，其原因可能是誘導(dǎo)子濃度過高，導(dǎo)致原球莖的死亡，存活的原球莖繁殖率也較低，不利于次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。綜上所述，CuSO4濃度為0.25～0.50 mmol／L時(shí)，干質(zhì)量在誤差范圍內(nèi)趨于穩(wěn)定，石斛堿含量變化明顯。表明誘導(dǎo)子CuSO4對原球莖脅迫產(chǎn)生代謝產(chǎn)物作用不明顯，影響著石斛堿的合成代謝。濃度繼續(xù)增加時(shí)，干質(zhì)量呈降低趨勢，表明誘導(dǎo)子CuSO4適宜濃度約為0.25～0.50 mmol／L。且Cu2＋濃度過低，會(huì)導(dǎo)致原球莖顏色變黃，生長狀態(tài)不佳。通過對石斛堿的產(chǎn)量比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加CuSO4濃度為0.25 mmol／L時(shí)，較適合金釵石斛原球莖生物量的累積。

表3 不同CuSO4添加濃度對原球莖生物量的影響Table 3 Effect of different concentrations of CuSO4 on protocorm biomass

不同CuSO4添加濃度對原球莖石斛堿含量的影響見圖5。由圖5可知：隨著誘導(dǎo)子CuSO4濃度的增加，石斛堿含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。當(dāng)CuSO4濃度為0.25 mmol／L時(shí)，石斛堿含量最多，達(dá)到35.10 μg／g。當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，原球莖大部分呈現(xiàn)褐化死亡狀態(tài)，導(dǎo)致石斛堿產(chǎn)量呈下降趨勢。且濃度過高時(shí)，原球莖一方面減少了對Cu2＋的吸收，同時(shí)Cu2＋向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)［35］。

圖5 不同CuSO4添加濃度對原球莖石斛堿含量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of CuSO4 on the dendrobine content

2.5 添加CuSO4后的不同培養(yǎng)時(shí)間對金釵石斛原球莖生物量和石斛堿的影響

CuSO4添加后不同培養(yǎng)時(shí)間對原球莖生物量的影響見表4。由表4可知：當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為5～15 d時(shí)，鮮質(zhì)量先減少后增加，其原因可能是適宜濃度的CuSO4刺激了原球莖的快速生長；當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，原球莖產(chǎn)生防御機(jī)制，向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)Cu2＋，Cu2＋濃度過低會(huì)影響植物生長［35］。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為15～30 d時(shí)，鮮質(zhì)量呈下降趨勢。其原因可能是誘導(dǎo)子CuSO4產(chǎn)生了抑制作用，刺激了金釵石斛原球莖的生長。隨著時(shí)間的延長，抑制作用更加明顯，甚至?xí)斐稍蚯o的死亡。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí)，干質(zhì)量最大為（0.28±0.01）g，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間至25 d時(shí)，干質(zhì)量減少明顯，為（0.22±0.01）g。添加誘導(dǎo)子CuSO4后，不同的培養(yǎng)時(shí)間，對金釵石斛原球莖生物量的累積均有一定影響，這與胡蕾等［36］的研究結(jié)果一致。

表4 添加CuSO4后不同培養(yǎng)時(shí)間對原球莖生物量的影響Table 4 Effect of different culture time on protocorm biomass after CuSO4 addition

添加CuSO4后不同培養(yǎng)時(shí)間對原球莖石斛堿含量的影響見圖6。由圖6可知：加入誘導(dǎo)子CuSO4后，培養(yǎng)5～15 d時(shí)，石斛堿含量在減少，可能是由于誘導(dǎo)子CuSO4的刺激作用在逐漸減弱，原球莖處于適應(yīng)期，面臨誘導(dǎo)子CuSO4的抑制作用產(chǎn)生了次生代謝產(chǎn)物。當(dāng)培養(yǎng)至20 d時(shí)，石斛堿含量最大，達(dá)29.37 μg／g，繼續(xù)培養(yǎng)，石斛堿含量呈下降趨勢?？赡苁且?yàn)樵蚯o經(jīng)過了適應(yīng)期，處于對數(shù)生長期，生物量得到了一定的累積，在誘導(dǎo)子CuSO4的刺激下，激活了更多的防御機(jī)制［37］，能夠在維持自身生長的同時(shí)產(chǎn)生最大產(chǎn)量的次生代謝產(chǎn)物。培養(yǎng)至20～30 d，生物量有所下降，石斛堿含量也呈現(xiàn)下降趨勢，可能是誘導(dǎo)子CuSO4抑制作用使部分原球莖產(chǎn)生了褐化死亡導(dǎo)致的。

圖6 添加CuSO4后不同培養(yǎng)時(shí)間對原球莖石斛堿含量的影響Fig.6 Effect of different culture time on the dendrobine content in the protocorm after CuSO4 addition

3 結(jié)論

本研究表明誘導(dǎo)子CuSO4對原球莖的生長有一定的抑制作用，但可以通過提高原球莖中石斛堿的產(chǎn)量，即添加誘導(dǎo)子CuSO4后，金釵石斛原球莖的生物量、石斛堿產(chǎn)量及生理狀態(tài)都會(huì)產(chǎn)生影響。當(dāng)誘導(dǎo)子CuSO4濃度為0.25 mmol／L時(shí)，原球莖的生物量達(dá)到最高，可為石斛堿的生產(chǎn)提供組培材料。在液體懸浮培養(yǎng)下，金釵石斛原球莖加入誘導(dǎo)子CuSO4的最適條件：原球莖培養(yǎng)20 d加入0.25 mmol／L CuSO4，繼續(xù)培養(yǎng)20 d。本研究所得結(jié)果為多因素脅迫原球莖提供了一定的數(shù)據(jù)及理論基礎(chǔ)。