袁 河，周 穩(wěn)，包 駿，張 艷，趙志友

（湖南省檳榔加工與食用安全工程技術(shù)研究中心，湖南賓之郎食品科技有限公司檢測中心，湖南 湘潭411100）

檳榔，是一種棕櫚科檳榔屬常綠喬木的果實，又稱賓門、檳楠、大白檳、仁頻、仁榔、洗瘴丹等。檳榔的種子、果皮、花皆可入藥，是傳統(tǒng)的中藥材。檳榔雖然沒有被列入藥食同源名錄，但人類嚼食檳榔的歷史可追溯數(shù)千年。朱利明［1］在《尋味檳榔》一書中介紹道，世界上檳榔的年產(chǎn)量近100萬t，嚼食人數(shù)超過10億人，約占世界人口總數(shù)的15%。世界上檳榔的主要生產(chǎn)國依次為印度、中國、孟加拉國，其他重要生產(chǎn)國還有緬甸、泰國、越南、印度尼西亞和斯里蘭卡。我國95%的檳榔來自海南。2017年海南省新栽種面積28.35 km2，累計栽種面積首次突破1 000 km2，達到1 025.3 km2。據(jù)《海南統(tǒng)計年鑒2018》［2］，2017年海南省共產(chǎn)檳榔255 114 t，其中，瓊海市產(chǎn)42 079 t，萬寧市產(chǎn)41 063 t，瓊中縣產(chǎn)25 785 t，此三地產(chǎn)量排名前三。檳榔雖然可以用作藥品，但大部分原料產(chǎn)品卻不流向藥材市場，而是用于簡單加工制成商品檳榔來銷售。從20世紀90年代至今，湖南檳榔已經(jīng)從原來的作坊式發(fā)展到工業(yè)化、自動化，銷售區(qū)域擴散到全國，年銷售額數(shù)百億，已然是一個不容忽視的食品行業(yè)。

湖南檳榔成品水分含量一般維持在23%～26%，但不屬于高溫殺菌食品，微生物風險較高。近年來隨著行業(yè)逐漸成熟，微生物的控制情況向良好方向發(fā)展。隨著檳榔行業(yè)對微生物控制的要求提高，微生物檢測的準確性和可靠性越來越受到重視。檳榔產(chǎn)品水分較高，制作時不經(jīng)過高溫殺菌，且在檢測取樣制備樣液時檳榔不經(jīng)切割分散，其他食品微生物檢測經(jīng)驗放在檳榔上可能存在較大的誤差。然而，目前尚無檳榔微生物測量不確定度的分析報道。因此，本研究建立檳榔中霉菌和酵母定量檢測測量不確定度評定的方法，以期為檳榔行業(yè)的微生物檢測準確度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 測試樣品

測試樣品均取自生產(chǎn)過程中經(jīng)發(fā)籽工藝處理后的檳榔。

1.1.2 主要設(shè)備和材料

培養(yǎng)箱（28℃±1℃），天津市意博高科技實驗有限公司；拍擊式均質(zhì)器及均質(zhì)袋，青島眾瑞只能儀器有限公司；電子天平（感量0.1 g），奧豪斯（常州）儀器有限公司；恒溫水浴箱（46℃±1℃），天津市泰斯特儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

質(zhì)量分數(shù)為0.85%的生理鹽水；孟加拉紅瓊脂，鄭州益康化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 實驗步驟與計數(shù)方法

按文獻［3］第一法執(zhí)行。霉菌和酵母分開計數(shù)。

2 不確定度的來源分析及評定

2.1 數(shù)學模型的建立

霉菌和酵母的計數(shù)方法參照文獻［3］，其中，若只有一個稀釋梯度的2個平板菌落數(shù)在10～150 CFU／g，則按式（1）計算。

若有2個連續(xù)稀釋梯度的平板上菌落數(shù)在10～150 CFU／g，則按式（2）計算。

式中：N為樣品中菌落數(shù)，其中，用NX表示霉菌計數(shù)，用NY表示酵母計數(shù)；A為平行實驗中平板1的計數(shù)；B為平行實驗中平板2的計數(shù)；∑c為平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2為第二稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

2.2 均勻性引入的不確定度

樣品的不均勻性是帶來不確定度的重要因素。本研究的樣品均按照GB 4789.1—2016的規(guī)定［4］，將樣品充分混合后隨機取樣。因此，可認為樣品是均勻的，在此忽略由取樣的不均勻性帶來的不確定性。

2.3 樣品稱量引入的不確定度

因為單顆檳榔質(zhì)量較大，且為了避免交叉污染而不對其進行切片處理，所以稱質(zhì)量時難以精確到25.0 g。為了方便操作，允許取樣在（25.0±1.0）g，這屬于均勻分布，所以由樣品稱量引入的標準不確定度為

電子天平引起的不確定度：本實驗所用的電子天平最大量程為1 000 g，允許誤差為±0.1 g。根據(jù)JJF 1059.1—2012的規(guī)定［5］，由數(shù)據(jù)修約、測量儀器最大允許誤差或分辨力、參考數(shù)據(jù)的誤差限、度盤或齒輪的回差、平衡指示器調(diào)零不準、測量儀器的滯后或摩擦效應(yīng)導致的不確定度，通常假設(shè)為均勻分布，因此由電子天平引入的標準不確定度為

由樣品稱量引入的標準不確定度為

因此，相對標準不確定度為

2.4 樣液制備引入的不確定度

樣液制備需使用250 mL量筒量取225 mL無菌生理鹽水加入稱量好的25.0 g樣品中。根據(jù)JJG 196—2006的規(guī)定［6］，20℃時量入式量筒的容量允許差為±2.0 mL，屬于B類評定。根據(jù)《化學分析中不確定度的評估指南》［7］，此項屬于三角分布，樣液制備引入的不確定度為

因此，相對標準不確定度為

2.5 梯度稀釋引入的不確定度

梯度稀釋是指采用1 mL無菌吸頭吸取不同稀釋級溶液1 mL至9 mL無菌生理鹽水的過程。這一過程中用1 mL移液器來移取1 mL不同稀釋級溶液，用5 mL移液器來制備9 mL無菌生理鹽水。根據(jù)JJG 646—2006的規(guī)定［8］，當檢定點為500 μL和1 000 μL時，1 mL移 液 器 的 容 量 允 許 誤 差為±1.0%；當檢定點為2 500 μL和5 000 μL時，5 mL移液器的容量允許誤差分別為±0.5%和±0.6%，在此按±0.6%計。這屬于B類評定。按三角分布取每吸取1 mL稀釋溶液時引入的標準不確定度為

因此其相對標準不確定度為

每吸取9 mL生理鹽水時引入的標準不確定度為

因此其相對標準不確定度為

本研究取第1～3個稀釋度（10－1、10－2、10－3）進行實驗和計數(shù)，稀釋過程共進行了3次，則稀釋過程引入的合成相對標準不確定度為

2.6 接種體積引入的不確定度

本研究選擇3個梯度的混合均勻的樣液，分別吸取1 mL樣品勻液于2個無菌平皿內(nèi)。因此其引入誤差有6個樣品。根據(jù)JJG 646—2006的規(guī)定［8］，1 mL移液器的容量允許誤差為±1%。按三角分布，因此，其引入的標準不確定度為

因此，相對標準不確定度為

2.7 重復性檢測引入的不確定度

重復性檢測過程不可避免地產(chǎn)生大量隨機性誤差，得到的檢測數(shù)據(jù)往往呈近似正態(tài)分布。重復性檢測是引入不確定度最重要的因素之一，在分析檢測方法的不確定度時尤其需要注意。因為微生物的特性，微生物檢測數(shù)據(jù)發(fā)散性大，不適合直接使用數(shù)據(jù)進行不確定度分析，而需要以微生物計數(shù)的對數(shù)值來分析不確定度。表1是重復性檢測引入的不確定度屬于A類評定，可以借助貝塞爾公式來計算檢測結(jié)果對數(shù)值的樣品標準偏差，從而進一步求得重復性檢測引入的不確定度。霉菌和酵母總數(shù)的檢測結(jié)果及殘差平方的計算結(jié)果如表1所示。

2.7.1 重復性檢測引入的霉菌的標準不確定度的計算

根據(jù)表1的檢測及計算結(jié)果，霉菌計數(shù)的對數(shù)單次測量的標準偏差為

霉菌計數(shù)的對數(shù)單次測量的標準不確定度為

霉菌計數(shù)的對數(shù)單次測量的相對標準不確定度為

2.7.2 重復性檢測引入的酵母的標準不確定度的計算

根據(jù)表1的檢測及計算結(jié)果，酵母計數(shù)的對數(shù)單次測量的標準偏差為

酵母計數(shù)的對數(shù)單次測量的標準不確定度為

酵母計數(shù)的對數(shù)單次測量的相對標準不確定度為

2.8 檳榔中霉菌和酵母的不確定度評定

2.8.1 霉菌和酵母的合成標準不確定度

由于不同的標準不確定度分量具有不同的單位，因此需要計算不同標準不確定度分量的的相對標準不確定度來求得合成相對標準不確定度，再根據(jù)平均檢測值即可求得整體的合成標準不確定度。

因此，霉菌的合成相對標準不確定度為

酵母的合成相對標準不確定度為：

則霉菌的合成標準不確定度為

酵母的合成標準不確定度為

2.8.2 霉菌和酵母的擴展不確定度

根據(jù)標準不確定度的原理，標準不確定度給出測量結(jié)果所在的區(qū)間，只是被測量值可能出現(xiàn)的一部分，其可信程度不高（如正態(tài)分布只占68.27%），為了提高對測量結(jié)果所在區(qū)間評定的可信程度，通常提供給客戶的應(yīng)是特定包含概率下的擴展不確定度。據(jù)此告知用戶檢測和校準結(jié)果就在以報告值為中心的包含區(qū)間內(nèi)，擴展不確定度由合成不確定度乘以適當?shù)陌蜃觡得到［9］。

在本研究的重復檢測中共檢測了10個樣品，根據(jù)GB 4789.15—2016的規(guī)定［3］，每份檢測3個梯度，每個梯度平行2份，表1中的檢測值是已經(jīng)過計算后的值。因此，取自由度v＝9，檢測值近似正態(tài)分布，取置信水平95%。根據(jù)JJF 1059.1—2012的規(guī)定［5］，當估計值NY的數(shù)值和它的合成不確定度uc（NY）所表征的概率分布近似為正態(tài)分布時，且uc（NY）的有效自由度較大情況下，若k＝2，則u＝2uc所確定的區(qū)間的包含概率約為95%。在通常測量中，一般取k＝2。因此，在此取k＝2。

檳榔中霉菌檢測的擴展不確定度為

檳榔中酵母檢測的擴展不確定度為

2.9 結(jié)果報告

根據(jù)上述計算得到的擴展不確定度，可以計算在置信水平為95%的條件下，霉菌計數(shù)值的對數(shù)平均值的取值范圍為（1.655 6－0.342 4）≤（1.655 6＋0.342 4），即1.313 2≤≤1.998。取反對數(shù)，可得到檢測結(jié)果NX的分布區(qū)間為20.568 4≤NX≤99.540 5。即該檢測樣品的霉菌估計值為20≤NX≤100 CFU／g。

3 討論

分析數(shù)據(jù)可知，不同不確定度對檢測結(jié)果影響大小可排列為urel（lgNX）＞urel（lgNY）＞urel（樣品）＞urel（接種）＞urel（稀釋）＞urel（樣液）?？梢?，樣品的重復檢測給檢測結(jié)果的不確定度帶來了最大的貢獻。微生物檢測結(jié)果發(fā)散性大是學界的普遍認知。一方面，微生物在樣品中分布不均勻是造成檢測結(jié)果有差異的重要原因［10］。另一方面，平板的菌落計數(shù)是引起檢測結(jié)果有差異的另一重要原因［11］。郭麗艷［12］認為，霉菌在培養(yǎng)的過程當中，因反復觀察而上下翻轉(zhuǎn)平板會導致霉菌孢子擴散，形成次生小菌落，進而影響計數(shù)結(jié)果。此外，均質(zhì)方式也會影響檢測結(jié)果的測量不確定度。如使用旋轉(zhuǎn)式刀片均質(zhì)器，則可能會因為切斷菌絲體而導致檢測結(jié)果偏高［13］。因此，這種易引起誤差的因素給檢測值位于限量標準附近的產(chǎn)品是否合格帶來了很大的隨機性。為此，根據(jù)文獻［14］要求，當測量不確定度影響與規(guī)范限的符合性時，檢測報告需帶有與被測量相同單位的測量不確定度或被測量相對形式的測量不確定度（百分比）。測量不確定度的引入給位于限量標準附近的產(chǎn)品帶來了兼具科學性和安全性的判定依據(jù)。

此外，當前在一些研究霉菌和酵母的不確定度的報道中將霉菌和酵母統(tǒng)一計數(shù)，并不分開進行，這與GB 4789.15—2016中的規(guī)定［3］是相悖的。本研究也發(fā)現(xiàn)，霉菌和酵母在重復性檢測中存在不同的測量不確定度分量，霉菌重復性檢測的不確定度分量顯然更高。霉菌的蔓延性以及孢子的易擴散性可能是使霉菌重復性檢測的不確定度提高的重要原因。這說明，在霉菌與酵母的檢測和測量不確定度評定中，均應(yīng)該將霉菌與酵母分開計數(shù)。

4 結(jié)論

本研究評定了食用檳榔中霉菌和酵母總數(shù)的測量不確定度。結(jié)果表明，在置信水平為95%的條件下，該檢測樣品的霉菌估計值為20≤NX≤100 CFU／g；該檢測樣品的酵母估計值為85≤NY≤317 CFU／g。結(jié)果還表明，霉菌和酵母在重復性檢測中的測量不確定度存在明顯差異。這說明一些企業(yè)將霉菌和酵母統(tǒng)一計數(shù)的方式不可取，而應(yīng)該對霉菌和酵母總數(shù)分別計數(shù)，并分別計算測量不確定度。本研究結(jié)果可為檳榔企業(yè)在內(nèi)部質(zhì)量控制中起到參考作用，既可以避免過分要求少菌無菌帶來的高昂成本和技術(shù)困難，又可以切實降低微生物超標的風險。因此，在食品行業(yè)的微生物檢測報告中引入不確定度可以使該報告兼具科學性和安全性的判定依據(jù)。