骨調(diào)節(jié)蛋白作為潛在的胃癌預(yù)后標(biāo)志物及免疫治療新靶點(diǎn)

潘 鳳， 彭紅云， 聶佳琪， 張旭東， 李曉寧，崔海康， 楊 蘭， 張文杰*

(1)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系及第一附屬醫(yī)院病理科，新疆 石河子 832002；2)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢科，新疆 石河子 832002；3)石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，新疆 石河子 832002)

2019年，全球胃癌新發(fā)病例49 008例，年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率1.6/100 000，比1990年降低了30.9%。2019年，全球胃癌死亡病例27 895例，年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率0.9/100 000，比1990年降低了46.8%[1]。胃癌發(fā)病率和死亡率降低取得這么可觀的成就，無疑與3大因素有關(guān)：(1)健康教育的普及。使全社會對胃癌早診早治的重要性提高了認(rèn)識；(2)胃癌篩查新技術(shù)。胃鏡篩查胃癌的敏感性高達(dá)88.6%[2]，顯著提高了胃癌的早診；(3)胃癌治療手段的提高。近年來，影像學(xué)技術(shù)指導(dǎo)下的外科手術(shù)、規(guī)范化的放化療等都有了長足的進(jìn)步，加上免疫治療，例如免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑、自然殺傷細(xì)胞免疫治療和樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗等[3]。

過去的20年，盡管中國在胃癌的篩查和治療上取得了很大進(jìn)展，但中國胃癌年齡標(biāo)化5年生存率在30%左右，遠(yuǎn)低于韓國和日本的60%左右[4]。5年生存率是指某種腫瘤經(jīng)過各種綜合治療后，生存5年以上的比例。中國胃癌患者5年生存率低有2個主要原因：(1)早期診斷率較低。其原因是胃鏡篩查技術(shù)要求高，價格貴，目前還難以在一級和二級醫(yī)院作為大規(guī)模胃癌普查的手段。(2)胃癌早診率低必然導(dǎo)致晚期癌患者多。而晚期癌患者多有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，手術(shù)治療效果不好，導(dǎo)致術(shù)后生存率低。迄今為止，晚期胃癌患者手術(shù)適應(yīng)癥無明確共識，目前也缺乏相關(guān)的大樣本對照研究。如果將有遠(yuǎn)端癌轉(zhuǎn)移而不適宜手術(shù)的患者進(jìn)行手術(shù)治療，那么，手術(shù)本身帶來的巨大創(chuàng)傷以及可能的并發(fā)癥，不但起不到治療作用，反而可能使得患者因為晚期癌癥以及手術(shù)創(chuàng)傷的“雙重打擊”而加速死亡。

因此，尋找一種能夠在術(shù)前對晚期胃癌患者進(jìn)行“術(shù)后”生存預(yù)后評估的方法和指標(biāo)，從而為臨床醫(yī)生提供一種“手術(shù)適應(yīng)癥”作為參考。本課題組對小樣本胃癌患者進(jìn)行了初步研究，已經(jīng)取得一些經(jīng)驗[5]。本研究借助基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫(GENE EXPRESSION OMNIBUS, GEO)，對胃癌患者進(jìn)行“術(shù)后”生存預(yù)后評估的方法和指標(biāo)進(jìn)行了大樣本擴(kuò)展研究，取得了2項主要成果：(1)首次發(fā)現(xiàn)骨調(diào)節(jié)蛋白(osteomodulin, OMD)在胃癌組織中高表達(dá)，且與胃癌患者術(shù)后不良預(yù)后密切相關(guān)。因為OMD可在術(shù)前進(jìn)行檢測，是術(shù)前評估胃癌患者術(shù)后生存的潛在生物標(biāo)志物；(2)我們還發(fā)現(xiàn)，骨調(diào)節(jié)蛋白mRNA低表達(dá)組中靜息狀態(tài)下的樹突狀細(xì)胞浸潤豐富，高表達(dá)組中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤豐富，且OMD與免疫增強(qiáng)劑ENTPD1及趨化因子CXCL12呈顯著正相關(guān)。骨調(diào)節(jié)蛋白有望成為胃癌免疫治療的一個新靶點(diǎn)。

骨調(diào)節(jié)蛋白是富含亮氨酸的小重復(fù)蛋白質(zhì)，屬于一個由17種分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)聚糖組成的家族[6]。一開始骨調(diào)節(jié)蛋白被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的豐富蛋白質(zhì)，連接組織并分化成骨細(xì)胞[7]。細(xì)胞外基質(zhì)是所有組織和器官的基本和核心組成部分，是多細(xì)胞生物存在的必要條件。從生物體發(fā)育的最初階段直到死亡，它調(diào)節(jié)著身體的每個細(xì)胞的活動過程，例如生存、生長、遷移和分化，對維持正常的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[8]。胃癌多起源于黏膜上皮細(xì)胞，隨著腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，細(xì)胞外基質(zhì)的組織也發(fā)生了重大變化，通常為維持上皮細(xì)胞的完整性提供了微環(huán)境。如果細(xì)胞外微環(huán)境維持正常，許多癌基因就不能引發(fā)腫瘤[9]，這些研究進(jìn)一步證明了細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)在胃癌發(fā)展中的重要性。最近，Papadaki 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，OMD和富含脯氨酸/精氨酸的末端亮氨酸重復(fù)蛋白(recombinant proline arginine rich end leucine rich repeat protein, PRELP)在膀胱傘上皮細(xì)胞中選擇性表達(dá)，并在膀胱癌中被抑制，OMD或PRELP敲除小鼠通過削弱細(xì)胞-細(xì)胞完整性和部分上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的激活，從而導(dǎo)致傘狀細(xì)胞層的破壞，早期膀胱癌樣結(jié)構(gòu)的形成，而OMD或PRELP高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制了癌癥的進(jìn)展，這是由轉(zhuǎn)化因子-β和表皮生長因子的抑制介導(dǎo)的，OMD和PRELP作為腫瘤抑制蛋白質(zhì)通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮作用。然而，骨調(diào)節(jié)蛋白在胃癌中的作用至今仍未被報道。因此，本文通過多中心癌癥公共數(shù)據(jù)庫及在線網(wǎng)站挖掘胃癌中OMD的mRNA表達(dá)水平，及其與胃癌患者臨床特征的相關(guān)性，評估了OMD的mRNA表達(dá)對于胃癌患者的潛在預(yù)后價值，探索OMD影響胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集來源

從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1)必須為胃癌組織樣本且數(shù)據(jù)類型必須為基因表達(dá)譜；(2)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集的組織來源必須為人；(3)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集的樣本數(shù)量必須大于等于50例；(4)臨床資料需有性別、年齡、臨床分期、生存狀況和生存時間等?；谝陨虾Y選條件，最終篩選獲到了3個基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，編號分別為GSE26253、GSE26942和GSE13861，總計納入31例正常樣本和699例胃癌樣本。胃癌樣本中男性患者468(67.0%)例，女性患者231(33.0%)例；年齡23～83歲，平均年齡55.0(46.0, 63.0)歲。癌癥發(fā)生于胃上部81(11.6%)例，胃中部233(33.3%)例，胃下部226(32.3%)例，混合部位159(22.8%)例；Lauren分型中彌漫型胃癌352(50.4%)例，類似腸上皮的腸型胃癌299(42.8%)例，混合型胃癌32(4.6%)例；美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)第六版分期中Ⅰ期131(18.7%)例，Ⅱ期215(30.8%)例，III期218(31.2%)例，IV期134(19.2%)例；死亡285(40.8%)例，生存414(59.2%)例，生存時間最長為167.6個月，平均生存時間為59.5個月。

1.2 與胃癌預(yù)后相關(guān)的基因篩選

首先，將編號分別為GSE26253、GSE26942、GSE13861平臺文件和探針矩陣下載保存，因為平臺文件中含有探針與基因名稱的對應(yīng)關(guān)系，所以根據(jù)平臺文件將探針矩陣轉(zhuǎn)變?yōu)榛蚓仃?。?dāng)1個基因?qū)?yīng)多個探針時，通過取均值進(jìn)行矯正。再依次將3個基因矩陣進(jìn)行合并，形成新基因矩陣(簡稱為Merge)。最后，由于原來3個基因表達(dá)數(shù)據(jù)譜的平臺文件不同，也就是說這3組數(shù)據(jù)譜來源于不同的實(shí)驗室，研究過程中使用的儀器不同，實(shí)驗人員的熟練程度也不同，甚至用到的實(shí)驗試劑也不同，所以當(dāng)本文得到新的基因矩陣后，通過“combat”包進(jìn)行批次矯正來減少不必要的誤差。再把基因矩陣與患者生存狀態(tài)及生存時間等數(shù)據(jù)合并，通過Kaplan-Meier生存分析、Cox比例風(fēng)險回歸模型雙重分析過濾篩選出與胃癌患者預(yù)后相關(guān)的基因。隨后將基因矩陣與患者的臨床信息，例如性別、年齡、Lauren分型、胃癌發(fā)生部位及臨床分期等數(shù)據(jù)合并，利用R語言中的“survival”包過濾篩選出獨(dú)立預(yù)后基因，最后再進(jìn)行臨床特征相關(guān)性過濾篩選。

1.3 qRT-PCR檢測胃癌組織和癌旁組織中目的基因mRNA的表達(dá)量

收集2013年1月到2016年12月在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行胃部腫瘤手術(shù)切除，經(jīng)病理診斷為胃癌及癌旁正常組織(切緣距離癌灶邊緣5 cm以外的正常組織)的石蠟包埋組織36對。每例胃癌和癌旁正常組織均進(jìn)行復(fù)片(第二次診斷)，且每例患者病理切片均經(jīng)過至少2位病理學(xué)專家診斷。收集的所有胃癌石蠟包埋組織的患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療治療，均為首次行胃部腫瘤切除術(shù)，術(shù)后胃癌組織切緣均未見癌細(xì)胞殘留。采用TRIzol法提取總RNA，以GAPDH為參考基因，擴(kuò)增目的基因。實(shí)驗在96孔板中進(jìn)行，每個樣品3個復(fù)孔，并重復(fù)3次。引物序列如下：

OMDforward： 5′-AGGCTGTGTCAGTGAATGCTT-3′

OMDreverse： 5′-TGGGATAGTCTTGAGTTTGCGAT-3′

GAPDHforward： 5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′

GAPDHreverse： 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′

1.4 Western印跡檢測胃癌組織和癌旁組織中目的基因的蛋白質(zhì)表達(dá)量

新鮮的胃癌和癌旁正常組織取自于2021年在石河子大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科明確診斷為胃癌，并接受胃癌根治術(shù)病例的術(shù)后病理標(biāo)本。胃癌組織取材于術(shù)中胃癌癌灶組織，癌旁取材于距癌灶邊緣至少 5 cm 以上的正常胃粘膜組織。將獲得樣本勻漿，使用強(qiáng)效RIPA裂解液(北京索萊寶公司)提取總蛋白質(zhì)，使用美國NanoDrop分光光度計測定蛋白質(zhì)濃度。再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液在室溫下封閉2 h。將內(nèi)參和目的條帶分離后分別置于OMD(Abcam，稀釋度1∶1 000)和β-肌動蛋白(β-actin)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，稀釋度1∶2 000)一抗中4 ℃孵育過夜，吸凈一抗并用TBST清洗，5 min × 6次。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，稀釋度1∶10 000)，室溫孵育2 h，吸凈二抗并用TBST清洗，5 min × 6次。最后用超敏ECL發(fā)光試劑盒(蘇州宇恒公司)和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BioRad)進(jìn)行曝光分析。以上均獲得石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)委員會批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。

1.5 基因集富集分析

進(jìn)行基因集富集分析 (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)以鑒定目的基因潛在的生物學(xué)功能。根據(jù)目的基因在699例胃癌樣本中的表達(dá)中位值將其分為高、低表達(dá)組，在于JAVA 8.0平臺上進(jìn)行GSEA軟件分析(3.0版本，http://www.gsea-msigdb.org/gsea/ downloads. jsp)。從分子特征數(shù)據(jù)庫(MSigDB)獲得的注釋的基因組gseaftp.broadinstitute. org://pub/gsea/gene_sets_final/c5.go.v7.2.symbols.gmt被選擇作為計算富集分?jǐn)?shù)(es)的參考組，該富集分?jǐn)?shù)的估計來自先前定義的基因組的基因，是在每個復(fù)發(fā)相關(guān)基因的高、低表達(dá)組中富集還是隨機(jī)分布。排列數(shù)設(shè)置成1 000，排除小于15或大于500的基因，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化P< 0.05，F(xiàn)DR < 25%，基因組被視為富集組。

1.6 免疫微環(huán)境分析

通過CIBERSORT (https://cibersortx.stanford.edu/)計算出699例胃癌樣本中22種免疫細(xì)胞(初始B細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+的初始T細(xì)胞、靜息的CD4+的記憶T細(xì)胞、CD4+的記憶T細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞、γδ+T細(xì)胞、靜息的NK細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0單核細(xì)胞、M1單核細(xì)胞、M2單核細(xì)胞、靜息的樹突狀細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、靜息的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)浸潤情況，重復(fù)計算10 000次，按照P< 0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選出免疫細(xì)胞浸潤結(jié)果準(zhǔn)確性較高的樣本。TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB/index.php)是一個用于腫瘤和免疫系統(tǒng)交互的門戶網(wǎng)站，用Spearman相關(guān)性分析目的基因的mRNA表達(dá)量在胃癌中與免疫調(diào)節(jié)劑及趨化因子的mRNA表達(dá)量之間的相關(guān)性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析采用IBM SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計，目的基因在胃癌組織及癌旁正常組織中mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量的比較采用秩和檢驗。目的基因的mRNA高、低表達(dá)分組采取中位水平裁剪分組(以中位數(shù)為節(jié)點(diǎn)分別向左和向右剔除相同人數(shù)的病例，防止由于檢查誤差導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差)，生存分析研究采用Kaplan-Meier法，P< 0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 查找與胃癌預(yù)后相關(guān)的基因

結(jié)果正如Table 1所示，OMD、AHI1、COMP、ACSM3、HOXB2、MEOX2為本文篩選出來的獨(dú)立預(yù)后基因，而OMD的mRNA表達(dá)水平在不同性別(P= 0.027)、年齡(P= 0.034)、癌癥發(fā)生部位(P< 0.001)、Lauren分型(P< 0.001)和臨床分期(P= 0.001)中具有顯著的差異，符合本文的篩選要求。本文還比較了胃癌組織和正常組織中OMD的mRNA表達(dá)量，胃癌組織中OMD的mRNA表達(dá)量顯著高于正常組織(P= 0.015) (Fig. 1A)。最后，本文以O(shè)MD轉(zhuǎn)錄水平的中位水平裁剪分成高、低表達(dá)組進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，OMD的mRNA高表達(dá)組的預(yù)后明顯差于低表達(dá)組(P< 0.001) (Fig. 1A)，這說明OMD對胃癌的發(fā)生及發(fā)展可能發(fā)揮促進(jìn)作用，且具有成為胃癌預(yù)后標(biāo)志物的潛力。

Table 1 Correlation analysis between prognostic genes and clinical characteristics in gastric cancers

2.2 骨調(diào)節(jié)蛋白的mRNA表達(dá)量、年齡和臨床分期是影響胃癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險因素

單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果見Table 2：OMD的mRNA表達(dá)量 (P< 0.001, hazard ratio[HR]= 7.645(95% CI[3.371-17.340])、年齡(P= 0.010, hazard ratio[HR]= 1.015 (95% CI[1.004-1.027])和臨床分期(P< 0.001, hazard ratio[HR]= 2.043 (95% CI[1.801-2.317])是影響胃癌患者生存和預(yù)后的獨(dú)立危險因素，這再次證明OMD的mRNA表達(dá)量增加與胃癌患者預(yù)后差有關(guān)。

Table 2 OMD, Sex, Age, Location, Lauren and AICC. stage are independent risk factors for survival prognosis in patients with gastric cancer

2.3 骨調(diào)節(jié)蛋白的mRNA表達(dá)與胃癌患者臨床性狀的相關(guān)性

結(jié)果正如Fig. 1C所示，OMD的mRNA表達(dá)在不同性別、年齡、Lauren分型、AJCC分期及腫瘤發(fā)生部位中具有顯著差異。其中，女性患者體內(nèi)OMD的mRNA表達(dá)比男性患者多(P= 0.013)；隨著年齡的增加，OMD的mRNA表達(dá)也呈遞減趨勢且每個分組間的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；在Lauren分型中，彌漫型胃癌與腸型胃癌中的OMD的mRNA表達(dá)量具有差異(P< 0.001)；彌漫型胃癌與混合型胃癌中的OMD的mRNA表達(dá)量具有差異(P< 0.001)；而在腸型胃癌與混合型胃癌中,OMD的mRNA表達(dá)量的差異不大(P= 0.580)。在臨床分期中, 隨著癌癥的進(jìn)展，OMD的mRNA表達(dá)量也隨之增加。因此，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者體內(nèi)OMD的mRNA表達(dá)量明顯高于Ⅰ期(P= 0.042、P= 0.001、P= 0.006)；在胃癌發(fā)生部位中，發(fā)現(xiàn)胃上部與胃中部OMD的mRNA表達(dá)量具有差異性(P= 0.002)，胃中部與胃下部及混合部位中OMD的mRNA表達(dá)量具有差異性((P< 0.001,P< 0.001)，胃下部與混合部位中OMD的mRNA表達(dá)量具有差異性(P= 0.018)。

2.4 骨調(diào)節(jié)蛋白的mRNA表達(dá)、預(yù)后及與臨床性狀相關(guān)性的驗證

通過腫瘤基因組圖譜計劃 (the cancer genome atlas program, TCGA) 數(shù)據(jù)庫和基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(genotype-tissue expression project, GTEx)驗證，在正常組織及胃癌腫瘤組織中，OMD的mRNA表達(dá)，結(jié)果正如Fig. 1B所示，在206個正常胃組織中OMD的mRNA表達(dá)水平顯著低于375個胃癌組織(P< 0.001)，在TCGA數(shù)據(jù)庫中再次證明OMD的mRNA高表達(dá)組的預(yù)后明顯差于低表達(dá)組(P< 0.001)。結(jié)果正如Fig. 1D所示，在TCGA數(shù)據(jù)庫中，男性與女性體內(nèi)OMD的mRNA表達(dá)未見差異(P= 0.520)；胃癌發(fā)生部位之間OMD的mRNA表達(dá)也未見差異；而年齡中只有41～60歲之間的患者體內(nèi)OMD的mRNA表達(dá)量與81～100歲之間具有差異(P= 0.036)；Lauren和AJCC分期的結(jié)果與Merge數(shù)據(jù)庫的結(jié)果一致，彌漫型胃癌與腸型胃癌中OMD的mRNA表達(dá)量具有差異(P< 0.001)；Ⅰ期與Ⅱ、III、IV期患者體內(nèi)OMD的mRNA表達(dá)量具有差異 (P< 0.001、P< 0.001、P= 0.001)。本研究還利用收集的36對胃癌及癌旁正常組織進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，結(jié)果正如Fig. 2A顯示胃癌組織中OMD的mRNA顯著高于癌旁正常組織(P< 0.001)，符合生物信息學(xué)分析的結(jié)果。除此之外，本文還通過Western印跡檢測了3組新鮮的胃癌及癌旁正常組織中OMD蛋白表達(dá)量。結(jié)果見Fig. 2B，與生物信息學(xué)分析結(jié)果及qRT-PCR結(jié)果一致，胃癌組織中OMD蛋白表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(P< 0.01)。

Fig.2 The expression of OMD in gastric cancer and normal tissues was verified by qRT-PCR and Western blotting (A) The expression of OMD mRNA in gastric cancer and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR (**** P < 0.001). (B) The expression of OMD in gastric cancer and adjacent normal tissues detected by Western blotting (** P < 0.01)

2.5 骨調(diào)節(jié)潛在生物學(xué)功能分析

OMD潛在生物學(xué)功能分析結(jié)果見Fig. 3所示。在Merge數(shù)據(jù)庫中，本文發(fā)現(xiàn)了OMD的mRNA高表達(dá)樣本富集了細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)控白細(xì)胞分化過程和參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表面受體信號通路等。同樣，在TCGA數(shù)據(jù)庫中，也發(fā)現(xiàn)了OMD的mRNA高表達(dá)樣本富集了細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路、白細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷移和趨化因子信號通路等。因此，說明OMD可能通過上述信號通路影響著胃癌的發(fā)生發(fā)展。

Fig.3 The potential biological function of OMD (A) GSEA results for OMD in the Merge. (B) GSEA results for OMD in the TCGA

2.6 免疫微環(huán)境分析

209例符合篩選條件的胃癌樣本中OMD的mRNA高表達(dá)組共127例，低表達(dá)組共82例。結(jié)果正如Fig. 4A中的柱狀圖所示，橫坐標(biāo)為胃癌樣本名稱，前82個為OMD的mRNA低表達(dá)組，后127個為OMD的mRNA高表達(dá)組?？v坐標(biāo)為免疫細(xì)胞在每個胃癌樣本中的百分率，所有免疫細(xì)胞的百分率之和為100%。不同顏色分別代表了22種不同的免疫細(xì)胞，不同顏色柱的長度代表了不同的免疫細(xì)胞在胃癌樣本中的含量，某顏色的柱越長代表某免疫細(xì)胞在該胃癌樣本中的含量越高。其中可以發(fā)現(xiàn)，OMD的mRNA高表達(dá)組中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的含量高于OMD的mRNA低表達(dá)組，而記憶B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞的含量低于OMD的mRNA低表達(dá)組。在Fig. 4B，橫坐標(biāo)中玫紅色為OMD的mRNA高表達(dá)組，天藍(lán)色為OMD的mRNA低表達(dá)組，縱坐標(biāo)為22種不同免疫細(xì)胞。熱圖中，每個格子代表免疫細(xì)胞在每個胃癌樣本中的含量，顏色越紅代表免疫細(xì)胞在胃癌樣本中的含量越高，顏色越綠代表免疫細(xì)胞在胃癌樣本中的含量越低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞的含量在OMD的mRNA高、低表達(dá)組中存在差異。209例胃癌樣本中，22種免疫細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性如Fig. 4C所示，活化的CD4+ T細(xì)胞與調(diào)節(jié)T細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.720)，活化的樹突狀細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.700)。Fig. 4F的小提琴圖更直觀的顯示OMD的mRNA低表達(dá)組中記憶B細(xì)胞、靜息狀態(tài)下的樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞的含量高于OMD的mRNA高表達(dá)組(P= 0.040、P= 0.047、P= 0.026)，而OMD的mRNA高表達(dá)患者中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的含量則高于OMD的mRNA低表達(dá)患者(P= 0.013、P= 0.045)。為了打破單個數(shù)據(jù)庫的局限性，進(jìn)一步提高免疫細(xì)胞浸潤的比例分析的可信度，本文采用TCGA數(shù)據(jù)再次進(jìn)行獨(dú)立分析，結(jié)果正如Fig. 4 G所示，OMD的mRNA低表達(dá)組中單核細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、靜息狀態(tài)下的樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞的含量高于OMD的mRNA高表達(dá)組(P= 0.003、P< 0.001、P= 0.002、P< 0.001)，而OMD的mRNA高表達(dá)患者中漿細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、NK細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、活化狀態(tài)下的樹突狀細(xì)胞、活化狀態(tài)下的肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞含量則高于OMD的mRNA低表達(dá)患者(P= 0.003、P= 0.004、P= 0.026、P= 0.002、P= 0.002、P= 0.002、P= 0.024)。綜上所述，OMD的mRNA高表達(dá)組中，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤豐富，而低表達(dá)組中靜息狀態(tài)下的樹突狀細(xì)胞浸潤豐富。TISIDB網(wǎng)站分析的結(jié)果正如Fig. 4D-E所示，OMD的mRNA表達(dá)量與免疫增強(qiáng)劑ENTPD1的mRNA表達(dá)量(rho=0.634，P< 0.001)具有正相關(guān)性，與趨化因子CXCL12的mRNA表達(dá)量(rho=0.625，P< 0.001)呈正相關(guān)。

Fig.4 The results of immune cell infiltration analysis were plotted using R language packages "Pheatmap", "Corrplot" and "Vioplot" and spearman correlations between the expression of OMD and immunoinhibitors and chemokine in gastric cancer (A) Histogram of immune cell infiltration in 209 gastric cancer samples. (B) Heat map of immune cell infiltration in 209 gastric cancer samples. (C) Correlation heat maps of the degree of infiltration of 22 types of immune cells in 209 gastric cancer samples. (D) Correlation dot plot between OMD mRNA expression and ENTPD1 mRNA expression. (E) Correlation dot plot between OMD mRNA expression and CXCL12 mRNA expression. (F) Violin view of immune cell infiltration in 209 gastric cancer samples. (G) Violin view of immune cell infiltration in TCGA

3 討論

生存預(yù)后及生活質(zhì)量是衡量胃癌患者診斷及治療的金標(biāo)準(zhǔn)。與胃癌患者生存預(yù)后相關(guān)的因素有許多，目前公認(rèn)的是臨床分期。但臨床分期只有在胃癌手術(shù)切除后才能準(zhǔn)確獲取，因此臨床分期對胃癌患者進(jìn)行手術(shù)之前的預(yù)后評估具有一定的局限性。然而，手術(shù)之前胃癌患者的生存預(yù)后評估具有重要的臨床意義：(1)術(shù)前評估作為預(yù)警信號，可以輔助制定手術(shù)計劃，從而提高手術(shù)質(zhì)量；(2)術(shù)前評估預(yù)后可以幫助制定術(shù)后個性化放化療方案和適宜的隨訪間隔。因此，本研究一開始使用了GSE26253、GSE26942和GSE13861等3個數(shù)據(jù)庫，共31例正常樣本及699例胃癌樣本，證明了胃癌組織中OMD的表達(dá)量高于正常組織，并且OMD的表達(dá)量與胃癌患者預(yù)后、年齡、Lauren分型、臨床分期等臨床性狀密切相關(guān)，所以骨調(diào)節(jié)蛋白可能成為1個術(shù)前可獲得的胃癌預(yù)后標(biāo)志物。

隨后，為了探究OMD是如何影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，本文通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)，骨調(diào)節(jié)蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)、白細(xì)胞的活動過程及細(xì)胞外信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著作用。首先，胃癌癌變中不可或缺的一個過程為細(xì)胞外基質(zhì)的重塑及基底膜屏障的破壞，這種重塑主要由細(xì)胞外基質(zhì)沉積、纖維排列和交聯(lián)導(dǎo)致的，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[11]。目前，大多數(shù)研究認(rèn)為，這種重塑是由于金屬蛋白酶及其組織抑制因子表達(dá)之間的失衡所致[12]。骨調(diào)節(jié)蛋白一開始被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)。本文發(fā)現(xiàn)，它在胃癌組織中也豐富表達(dá)，并且高表達(dá)的患者預(yù)后不佳。由此可知，骨調(diào)節(jié)蛋白不僅可以連接組織和分化成骨細(xì)胞，還可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，及加快基底膜屏障的破壞，從而導(dǎo)致胃癌癌變。

其次，骨調(diào)節(jié)蛋白具有調(diào)控白細(xì)胞活動過程的功能。因此，本文研究OMD的mRNA高、低表達(dá)組中的免疫細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OMD的mRNA低表達(dá)組中，靜息狀態(tài)下的樹突狀細(xì)胞浸潤豐富，高表達(dá)組中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤豐富。樹突狀細(xì)胞是專職抗原呈遞細(xì)胞之一，能夠?qū)D8+和CD4+T細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體I類和II類進(jìn)行抗原呈遞[13]。除此之外，樹突狀細(xì)胞可以在淋巴組織和非淋巴組織之間遷移，調(diào)控細(xì)胞因子和趨化因子的活動，從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[14]。因此，樹突狀細(xì)胞可以作為腫瘤疫苗進(jìn)行癌癥治療。而且，目前已有數(shù)百項試驗正在測試和評估樹突狀細(xì)胞疫苗的療效。Mao 等[15]使用納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)來負(fù)載氯化素e6(Ce6)，作為一種潛在的載體。利用Ce6在激光照射下產(chǎn)生活性氧的光動力效應(yīng)，NLC/Ce6能夠觸發(fā)細(xì)胞死亡，暴露腫瘤相關(guān)抗原。此外，模擬自然炎癥反應(yīng)，活性氧還可以招募樹突狀細(xì)胞，以便有效地處理/呈現(xiàn)原地暴露的腫瘤相關(guān)抗原。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方式具有很強(qiáng)的樹突狀細(xì)胞免疫效果，能有效地抑制胃原發(fā)和遠(yuǎn)端腫瘤的生長。一項研究表明，樹突狀細(xì)胞的數(shù)量與胃癌患者的臨床特征及預(yù)后具有顯著的相關(guān)性。樹突狀細(xì)胞的數(shù)目越高，胃癌患者的淋巴結(jié)受累越少，生存率也越高[16]。本研究也有這樣的發(fā)現(xiàn)，OMD的mRNA低表達(dá)組中，樹突狀細(xì)胞浸潤豐富且預(yù)后佳。嗜酸性粒細(xì)胞是白細(xì)胞的組成部分，被激活后能合成并釋放大量的活性介質(zhì)，這些介質(zhì)單獨(dú)對不同的靶細(xì)胞具有積極或消極影響[17]。例如嗜酸性粒細(xì)胞可以通過金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，有利于癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。在本文的研究中也發(fā)現(xiàn)，OMD參與了細(xì)胞外基質(zhì)的改變過程，不但OMD的mRNA高表達(dá)組中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤豐富，而且OMD的mRNA高表達(dá)組的胃癌患者預(yù)后不良。這再次表明，OMD可能通過嗜酸性粒細(xì)胞使細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生了降解，正常的細(xì)胞外穩(wěn)態(tài)被破壞，從而導(dǎo)致胃癌患者的不良預(yù)后。綜上所述，骨調(diào)節(jié)蛋白可能通過免疫微環(huán)境影響胃癌的發(fā)展。

最后，鑒于骨調(diào)節(jié)蛋白參與細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，尤其在趨化因子信號通路上發(fā)揮作用。所以，本文研究OMD的mRNA表達(dá)與免疫調(diào)節(jié)點(diǎn)和趨化因子之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn), OMD的mRNA與免疫增強(qiáng)劑ENTPD1的mRNA表達(dá)量具有顯著的正相關(guān)性。ENTPD1又稱CD39，是Treg細(xì)胞的功能性表面標(biāo)記[19]，被認(rèn)為是一種新的免疫調(diào)節(jié)分子[20]，其在水解細(xì)胞外ATP中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，受損細(xì)胞釋放ATP并表現(xiàn)出多種促炎作用[21]。有報道稱，CD39高表達(dá)與胃癌患者根治術(shù)后不良預(yù)后相關(guān)[22]。同樣，我們發(fā)現(xiàn)，OMD的mRNA表達(dá)量與CD39的mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，而且OMD的mRNA高表達(dá)患者預(yù)后不佳。趨化因子是一個小的細(xì)胞因子樣蛋白質(zhì)的超家族，對淋巴細(xì)胞運(yùn)輸?shù)竭m當(dāng)?shù)钠鞴俸途S持正常的免疫系統(tǒng)是必不可少的[23]。趨化因子CXCL12也被稱為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1，是一種調(diào)節(jié)白細(xì)胞運(yùn)輸?shù)男〉鞍踪|(zhì)，通過刺激CXCR4受體參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[24]。在胃腺癌中，CXCL12與CXCR4的結(jié)合，上調(diào)了PI3K/mTOR和c-MET通路。通過整合素β1聚集、肌動蛋白重組和RhoA激活，導(dǎo)致侵襲性增加[25,26]。此外，PI3K/mTOR通路上調(diào)可防止腫瘤細(xì)胞自噬[27]。Ishigami等[28]發(fā)現(xiàn)，CXCL12陽性的胃癌表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲行為。在本文的研究發(fā)現(xiàn)中，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期胃癌患者體內(nèi)OMD的mRNA表達(dá)量顯著多于Ⅰ期患者。而OMD的mRNA表達(dá)量與CXCL12的mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)。因而可以說明，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期胃癌患者體內(nèi)OMD的mRNA高表達(dá)可能與趨化因子CXCL14的作用有關(guān)。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)了骨調(diào)節(jié)蛋白是一個潛在的胃癌免疫治療的新靶點(diǎn)。除此之外，骨調(diào)節(jié)蛋白也是一個理想的預(yù)后標(biāo)志物?？梢酝ㄟ^術(shù)前檢測其表達(dá)量來預(yù)測胃癌患者的預(yù)后，為臨床醫(yī)生提供合適的個體化治療方案。