水產(chǎn)品和水體中燦爛弧菌現(xiàn)場可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快檢方法的建立及應(yīng)用

田 卓， 鄭秋月， 麻麗丹， 鄭文杰， 尚德靜， 曹際娟*

(1)遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)專業(yè), 遼寧， 大連 116033；2)大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧，大連 116600；3)大連海關(guān)技術(shù)中心，遼寧， 大連 116000；4)丹東海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，遼寧， 丹東 118000；5)天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)專業(yè)， 天津 300387)

弧菌是海洋環(huán)境里最常見的一種細(xì)菌類群，廣泛分布在河口、海灣、近岸海域的海水和海洋生物的體表及腸道中[1]。對于魚類、貝類、蝦類和蟹類等水產(chǎn)品而言，弧菌屬細(xì)菌(Vibriospp.)引起的弧菌病已成為全世界范圍內(nèi)的危害最大、流行最廣細(xì)菌性疾病[2-3]。與此同時，弧菌可以感染包括人類在內(nèi)的所有動物[4]。在美國，有95%以上食源性疾病、住院和死亡都是由弧菌屬病原體所致[5]，這不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]，也造成公共衛(wèi)生問題的發(fā)生。燦爛弧菌是弧菌中的一種具有極強(qiáng)致病性的條件致病菌，可引起刺參(Apostichopusjaponicus)的腐皮綜合征、眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)的皮膚潰爛，以及某些牡蠣和貽貝等大規(guī)模的死亡[7-11]。

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中，燦爛弧菌的檢測是一項非常艱巨的任務(wù)。因為弧菌微量，實驗室分離培養(yǎng)生長緩慢，易受其他弧菌抑制生長，生化鑒定技術(shù)復(fù)雜，使其不易在養(yǎng)殖場普及。目前，燦爛弧菌的檢測方法主要有以下幾種：免疫學(xué)檢測方法(玻片直接凝集法，雙抗原夾心ELISA法，Dot-ELISA，間接熒光快速檢測法)和分子生物學(xué)方法(PCR檢測，核酸探針檢測技術(shù))等，免疫學(xué)方法檢測耗時較長，酶標(biāo)抗體成本較高；分子生物學(xué)方法需要專門的PCR儀及凝膠成像儀等設(shè)備，使用成本較高，不能被基層使用者所接受。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是日本生物學(xué)家Notomi等[12]于2000年提出的一種新型的核酸擴(kuò)增方法。該技術(shù)在等溫條件下完成核酸的擴(kuò)增，具有高特異性、高效性和低技術(shù)要求等優(yōu)點，已被應(yīng)用于病原菌檢測、豬塞內(nèi)加谷病毒檢測[13-14]與疾病診斷等領(lǐng)域[15-17]，該方法靈敏度和重復(fù)性良好，結(jié)果判讀簡易。綜上所述，LAMP方法是恒溫反應(yīng)，不需要特殊設(shè)備，操作簡單、反應(yīng)靈敏和快速，適合不具備PCR儀等設(shè)備的基層單位和養(yǎng)殖場開展弧菌檢測。

本研究以燦爛弧菌的toxR基因為靶基因，篩選出1套6條LAMP引物，旨在建立燦爛弧菌的現(xiàn)場可視化LAMP快檢方法，包括簡便的DNA提取、特異性、靈敏度和重復(fù)性試驗，最后對建立的方法應(yīng)用于水產(chǎn)品和環(huán)境水體中進(jìn)行實際樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 所用菌株共9種，包括創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificusATCC 27562)，燦爛弧菌(V.splendidusATCC 33125)，擬態(tài)弧菌(V.mimicusCICC 21613)，麥?zhǔn)匣【?V.metschnikoviiATCC 700040)，費尼斯弧菌(V.furnissiiATCC 35016)，河流弧菌(V.fluvialisCICC 21612)，溶藻弧菌(V.alginolyticusATCC17749)，副溶血弧菌(V.parahaemolyticusATCC 17802)，鰻弧菌(V.anguillarumMCCC 1A07299)。本研究所使用的標(biāo)準(zhǔn)菌種均經(jīng)過生化鑒定試驗并在-80 ℃條件保存。

1.1.2 試劑與儀器 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(貨號：DP302，天根生化科技北京有限公司)；煮沸法DNA裂解試劑(貨號：No.9182，寶生物工程(大連)有限公司)；DNA恒溫擴(kuò)增試劑盒(貨號：051011 M，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司)；熒光目視檢測試劑(鈣黃綠素，F(xiàn)D，貨號：SLP221，榮研生物科技(中國)有限公司)；3%氯化鈉堿性蛋白胨水(貨號：CM401B，北京陸橋技術(shù)股份有限公司)；LB瓊脂(貨號：CM159，北京陸橋技術(shù)股份有限公司)；超微量分光光度計(Micro Drop，上海寶予德科學(xué)儀器有限公司)；實時熒光PCR儀(7500，美國ABI)；實時熒光PCR儀(CFX96，BIO-DL公司)。

1.2 樣品處理及基因組DNA的提取

環(huán)境水體樣品：在環(huán)境水體(江河水等)上、中、下段各布置不少于1個監(jiān)測點，每個監(jiān)測點采集2份水樣，每份500 mL。取1 mL水樣加入到事先分裝有9 mL的3%氯化鈉堿性蛋白胨水(APB)的15 mL EP管中，置于37 ℃恒溫PCR箱中培養(yǎng)24 h。取1 mL 增菌培養(yǎng)液，12 000 r/min離心 2 min，棄上清，用于提取DNA。

水產(chǎn)品樣品：用流動自來水清洗樣品外部的泥沙后，用75%酒精棉球擦洗消毒。對于貝類產(chǎn)品，用滅菌鉗將貝類開殼，稱取約20 g內(nèi)容物，放入無菌均質(zhì)袋；魚類樣品：分別取肝、脾、腎和潰瘍病變等處的組織，稱取約20 g放入無菌均質(zhì)袋；對于蝦蟹類樣品：用解剖剪分離樣品，然后稱取約20 g內(nèi)容物，放入無菌均質(zhì)袋。向均質(zhì)袋中添加50 mL 0.85%無菌生理鹽水，均質(zhì)3～5 min，使樣品充分分散。吸取1 mL樣品均質(zhì)液，加入到事先分裝有9 mL的3%氯化鈉堿性蛋白胨水(APB)的15 mL EP 管中，置于37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。取1 mL 增菌培養(yǎng)液，12 000 r/min離心 2 min，棄上清，用于提取DNA。

上述樣品在增菌培養(yǎng)后使用一次性無菌接種環(huán)，沾取少量增菌培養(yǎng)液并均勻涂布于TCBS(硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖)瓊脂培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取綠色和黃色的單菌落，在改良纖維二糖多粘菌素B多粘菌素E (modified cellobiose-polymyxin B-colistin, mCPC)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，按照FDA發(fā)布的BAM-2004提供的第一法，即最大可能數(shù)法(most probable number, MPN)用于生化鑒定。

本研究分別采用煮沸DNA裂解法和離心柱提取DNA的方法，對弧菌進(jìn)行基因組DNA的提取，以優(yōu)化出快速、適宜于弧菌的DNA提取方法。煮沸DNA裂解法提取步驟：將1接種環(huán)細(xì)菌培養(yǎng)液加入100 μL的裂解試劑中懸浮菌體，用振蕩器混合，95 ℃煮沸10 min；12 000 r/min離心2 min，取上清，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。離心柱提取DNA法采用商業(yè)化提取試劑盒操作步驟進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.3 引物的設(shè)計與合成

依據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的燦爛弧菌toxR基因(GenBank：AY751344.1)作為靶序列，通過蛋白質(zhì)保守區(qū)域分析和基因同源比對，確定toxR基因的保守序列，利用Primer Explore V4軟件各設(shè)計出了6套LAMP引物。篩選出燦爛弧菌的最佳引物序列。結(jié)果正如Table 1所示，均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

Table 1 Sequence of LAMP primers for the toxR gene of Vibrio splendidus

1.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件

LAMP反應(yīng)體系為2×RM反應(yīng)液12.5 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，SYTO-9熒光染料0.5 μL(或可視化的鈣黃綠素1.0 μL)，每條引物各1.0 μL(內(nèi)引物終濃度0.4 ～1.6 μmol/L；外引物終濃度0.1～0.2 μmol/L；環(huán)引物終濃度0.1～0.8 μmol/L)，DNA模板2 μL，超純水補齊至總體積25 μL。

通過實時熒光PCR儀或者LAMP實時濁度儀擴(kuò)增來觀察熒光擴(kuò)增曲線(加SYTO-9 熒光染料)，熒光基團(tuán)選擇SYBR，設(shè)置反應(yīng)條件為63 ℃ 15 s；63 ℃ 45 s作為一個循環(huán)，于63 ℃ 45 s處收集熒光信號，45個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光擴(kuò)增曲線結(jié)果。

通過可視化觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變化(加鈣黃綠素)，設(shè)置反應(yīng)條件為恒溫水浴63 ℃保溫30 min，然后95 ℃ 2 min終止反應(yīng)/冰浴終止反應(yīng)，然后在紫外光下(波長240～260 nm，350～370 nm)觀察呈現(xiàn)綠色熒光為陽性結(jié)果，無綠色熒光則為陰性結(jié)果。

1.5 特異性分析

為評價可視化LAMP檢測方法的特異性，根據(jù)上述反應(yīng)體系和條件對創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌、擬態(tài)弧菌、麥?zhǔn)匣【?、費尼斯弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)行雙平行試驗，分別檢驗本研究可視化LAMP檢測方法特異性。

1.6 靈敏度檢測

使用超微量分光光度計測定燦爛弧菌基因組DNA的濃度，按照倍比稀釋方法將燦爛弧菌的DNA濃度分別調(diào)成以下系列濃度：1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、0.1 fg/μL。每個濃度進(jìn)行雙平行試驗，滅菌雙蒸水作為陰性對照，按照LAMP反應(yīng)檢測過程，確定可視化LAMP方法的靈敏度。

1.7 重現(xiàn)性檢測

將燦爛弧菌的基因組DNA濃度均調(diào)至1 ng/μL，以此作為起始濃度，進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取靈敏度檢測結(jié)果中確定的最低檢測濃度作為DNA模板，進(jìn)行LAMP檢測，采用20次平行實驗，以驗證方法的可重復(fù)性。

1.8 人工污染模擬檢測

將燦爛弧菌 ATCC 33125株液體擴(kuò)大培養(yǎng)，利用平板計數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度為 1×107CFU/mL，并進(jìn)行 10 倍梯度稀釋，使菌懸液濃度為 1～1×107CFU/mL，取菌液 1 mL 分別均勻涂布在新鮮蝦樣品表面，室溫放置 4 h ，用 1 mL ddH2O 沖洗回收菌液，用 1.2 的方法提取基因組 DNA，用1.4方法進(jìn)行 LAMP 擴(kuò)增，得出人工污染樣品的檢測限。

1.9 在水產(chǎn)品及養(yǎng)殖水域中的實際檢測應(yīng)用

采集655份水產(chǎn)品樣品，樣品信息如附錄A所示，其中餐飲環(huán)節(jié)中的水產(chǎn)品樣品155份，超市流通環(huán)節(jié)中的水產(chǎn)品樣品189份，農(nóng)貿(mào)市場中的水產(chǎn)品樣品206份，網(wǎng)店中的水產(chǎn)品樣品105份；3-5月水產(chǎn)品樣品174份，6-8月水產(chǎn)品樣品235份，9-11月水產(chǎn)品樣品132份，12-2月水產(chǎn)品樣品114份；淡水蝦18份(包括青蝦、螯蝦、河蝦)，淡水蟹18份(澄陽湖大閘蟹、中華絨螯蟹)，淡水魚105份(草魚、鰱魚、鯽魚、鯉魚、鯰魚、黑魚)，海水蝦26份(基圍蝦、南美白蝦)，海水蟹27份(飛蟹、三疣梭子蟹)，海水魚171份(鱈魚、帶魚、鲅魚、鯧魚、魷魚、鱸魚、鰈魚、章魚)，貝類189份(鮑魚、毛蚶、貽貝、香螺、海灣扇貝、牡蠣、文蛤、雜色蛤)，頭足類101份(烏賊、短蛸、長蛸、魷魚、筆管)。

采集558份水體樣品，包括海水樣品440份，江河水樣品98份，養(yǎng)殖場環(huán)境海水樣品20份。采用本研究建立的可視化LAMP檢測方法，對所采集的樣品進(jìn)行檢測，并對經(jīng)LAMP檢出陽性結(jié)果的樣品進(jìn)行燦爛弧菌的菌落分離培養(yǎng)和生化鑒定。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

根據(jù)實驗結(jié)果，利用方差分析和卡方檢驗分析LAMP方法和常規(guī)培養(yǎng)法、不同樣品中創(chuàng)傷弧菌陽性檢出率的檢測結(jié)果差別的顯著性程度。

以P值進(jìn)行衡量兩組差異大小。具體指標(biāo)如下：

當(dāng)P值<0.05時，表示兩組結(jié)果存在顯著差異；

當(dāng)P值<0.01時，表示兩組結(jié)果的差異極其顯著；

當(dāng)P值>0.05時，表示兩組結(jié)果無顯著差異。

卡方檢驗分析時，如果卡方值越大，二者偏差程度越大；反之，二者偏差越??；若兩個值完全相等時，卡方值就為0，表明理論值完全符合。

2 結(jié)果

2.1 煮沸DNA裂解法為最優(yōu)弧菌基因組DNA提取方法

選取創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌、副溶血性弧菌和鰻弧菌的菌株增菌液，采用煮沸DNA裂解法和離心柱DNA純化法分別提取基因組DNA，使用超微量分光光度計測定吸收值及計算濃度，核酸純度及濃度測定結(jié)果正如Table 2所示。兩種DNA提取方法的A260/A280比值、A260/A230比值的核酸純度方差分析結(jié)果見Fig.1和Fig.2。由Fig.1-2可知，無論采取何種提取方法，核酸純度的指標(biāo)值(A260/A280)均能達(dá)到1.5及以上，該兩種方法之間無顯著差異(P>0.05)，基本滿足正常的核酸檢測需求。然而，該兩種方法的指標(biāo)值(A260/A230)之間存在顯著性差異(P<0.05)，通過Table 2的測定值可知，煮沸法中A230的測定值顯著上升，說明殘留較多碳水化合物，后續(xù)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增時需要對模板DNA進(jìn)行稀釋，以降低其他成分的干擾。

Fig.1 The four Vibrio genomic DNA purity index value (A260/A280) Genomic DNA was extracted by the boiling DNA lysis method and spin column DNA purification method, respectively. The A260/A280 ratio of the two methods of DNA extraction was analyzed by anOVA

Fig.2 The four Vibrio genomic DNA purity index value (A260/A230) Genomic DNA was extracted by the boiling DNA lysis method and spin column DNA purification method, and the ratio of A260/A230 was analyzed by variance of nucleic acid purity

Table 2 Absorption value and purity value of four Vibrio genomic DNA

不同DNA提取方法的LAMP擴(kuò)增效果。通過LAMP熒光擴(kuò)增曲線分析反應(yīng)結(jié)果(加SYTO-9 熒光染料)如Fig.3所示，通過紫外光下觀察產(chǎn)物顏色濁度變化結(jié)果(加鈣黃綠素)如Fig.4所示。由Fig.3和Fig.4結(jié)果可見，采用兩種不同方法提取的燦爛弧菌DNA，通過LAMP反應(yīng)均能產(chǎn)生典型的熒光擴(kuò)增曲線(Fig.3，加SYTO-9 熒光染料)，且Ct值基本一致。通過紫外光下觀察產(chǎn)物顏色濁度變化，也均可以產(chǎn)生典型的綠色熒光陽性結(jié)果(Fig.4，加鈣黃綠素)。

不同DNA提取方法的LAMP擴(kuò)增效果。通過LAMP熒光擴(kuò)增曲線分析反應(yīng)結(jié)果(加SYTO-9 熒光染料)正如Fig.3所示。

Fig.3 LAMP results of V.splendidus by different extraction methods LAMP amplification effects of different DNA extraction methods. The reaction results were analyzed by LAMP fluorescence amplification curve

通過紫外光下觀察產(chǎn)物顏色濁度變化結(jié)果(加鈣黃綠素)見Fig.4所示。

Fig.4 Visual detection of different extraction methods of V.splendidus under the UV light LAMP amplification effects of different DNA extraction methods. The color turbidity of the product was observed under ultraviolet light. 1,2：Genomic DNA samples of Vibrio splendidus were extracted by the spin column method；3,4：Genomic DNA of Vibrio splendidus was extracted by the boiling method；5,6：Water control

由Fig.3和Fig.4的結(jié)果表明，采用2種不同方法提取的燦爛弧菌DNA，通過LAMP反應(yīng)均能產(chǎn)生典型的熒光擴(kuò)增曲線(Fig.3，加SYTO-9 熒光染料)，且Ct值基本一致。通過紫外光下觀察產(chǎn)物顏色濁度變化，也均可產(chǎn)生典型的綠色熒光陽性結(jié)果(Fig.4，加鈣黃綠素)。

2.2 第1套引物出峰較早且無非特異性擴(kuò)增

通過LAMP熒光擴(kuò)增曲線分析(加SYTO-9 熒光染料)，燦爛弧菌的LAMP引物篩選結(jié)果見Fig.5所示。其中，陽性對照分別為燦爛弧菌，陰性對照為副溶血性弧菌。由Fig.5的結(jié)果顯示，燦爛弧菌toxR基因序列設(shè)計的6套引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)后結(jié)果為：第1、2、3套引物，燦爛弧菌陽性對照的出峰時間約為13、15、27 min，陰性對照均無擴(kuò)增；第4套引物燦爛弧菌陽性對照的出峰時間約為10 min，但陰性對照在50 min出現(xiàn)翹尾情況；第5套引物較晚的時間才出現(xiàn)微弱的擴(kuò)增；第6套引物無擴(kuò)增。綜合以上結(jié)果，選擇出峰較早，且無非特異性擴(kuò)增的燦爛弧菌第1套引物(序列見Table 1)用于后續(xù)試驗。

Fig.5 LAMP assay for the toxR gene of Vibrio brilliant by six sets of primers The results of LAMP primers were analyzed by the LAMP fluorescence amplification curve

2.3 特異性分析結(jié)果良好

采用Table 1中優(yōu)化篩選后的LAMP引物進(jìn)行特異性檢測，分別對創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌、擬態(tài)弧菌、麥?zhǔn)匣【①M尼斯弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌及副溶血弧菌8種弧菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束通過觀察熒光擴(kuò)增曲線(加SYTO-9 熒光染料)和紫外光下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變化(加鈣黃綠素)，分析檢測結(jié)果，驗證本方法的特異性。特異性檢測結(jié)果顯示，經(jīng)LAMP檢測，燦爛弧菌有特異性擴(kuò)增，2次重復(fù)結(jié)果相一致，其他弧菌的擴(kuò)增均為陰性。熒光擴(kuò)增曲線結(jié)果見Fig.6，紫外光下擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色濁度變化結(jié)果見Fig.7。說明本研究設(shè)計的燦爛弧菌LAMP引物均具有良好的特異性。

Fig.6 The specificity of detection of V.splendidus by LAMP fluorescence amplification curve analysis LAMP amplification was performed on eight kinds of vibrio, and the fluorescence amplification curve was observed after the reaction A、B: V.splendidus；C～J: other 7 kinds of Vibrio

Fig.7 The specificity of visual LAMP detection of V.splendidus under UV light Eight Vibrio species were amplified by LAMP. After the reaction, the color changes of amplified products were observed under ultraviolet light

2.4 靈敏度達(dá)到10-9g/L

將燦爛弧菌8個不同濃度的基因組核酸作為擴(kuò)增反應(yīng)模板，LAMP反應(yīng)熒光擴(kuò)增曲線結(jié)果(加SYTO-9 熒光染料)見Fig.8，紫外光下擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色濁度變化結(jié)果(加鈣黃綠素)見Fig.9。由Fig.8的結(jié)果顯示，當(dāng)燦爛弧菌的濃度在10 fg /L(10-9g/L)及以上時，均有熒光擴(kuò)增曲線出現(xiàn)且結(jié)果穩(wěn)定，當(dāng)為1 fg /L的濃度時均只能概率性的檢出且結(jié)果不穩(wěn)定；由Fig.9的結(jié)果顯示，10 fg /L(10-9g/L)及以上濃度的燦爛弧菌，紫外光下均觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色熒光濁度變化，而當(dāng)濃度為1 fg/μL時濁度變化不顯著。因此，綜上結(jié)果，燦爛弧菌的LAMP方法檢測靈敏度為10-9g/L，且熒光擴(kuò)增曲線和紫外光下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變化靈敏度結(jié)果基本一致。

Fig.8 The sensitivity test for detection of V.splendidus by the LAMP fluorescence method Eight different concentrations of genomic nucleic acids of V.splendidus were used as amplification reaction templates for LAMP detection. A:1ng/μL; B: 100pg/μL; C: 10pg/μL; D: 1pg/μL; E: 100 fg/μL; F: 10 fg/μL; G: 1fg/μL; H: 0.1fg/μL; I:blank

Fig.9 LAMP visual detection of V.splendidus sensitivity under the UV light Eight different concentrations of genomic nucleic acids of V.splendidus were used as amplification reactions by LAMP to observe the changes of color turbidity of amplified products under ultraviolet light

2.5 檢測重復(fù)性良好

重復(fù)試驗的熒光擴(kuò)增曲線結(jié)果見Fig.10。結(jié)果顯示，2種弧菌的20次重復(fù)檢測結(jié)果一致且均為陽性，而且出峰時間短、擴(kuò)增曲線完整，說明采用LAMP方法檢測燦爛弧菌具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

Fig.10 Repeatability test results for 10 fg/μL DNA of V.splendidus The LAMP reaction was performed using genomic DNA with the lowest detection concentration of 10 fg/μL as the template and 20 replicates were performed

2.6 人工污染樣品的檢出限為10 CFU/mL

燦爛弧菌 ATCC 33125株的菌液梯度稀釋后，涂于新鮮蝦體表進(jìn)行污染模擬。結(jié)果正如Fig.11所示, 污染菌液濃度為10～1×107CFU/mL的樣品檢測結(jié)果均為陽性，濃度為1 CFU/mL的樣品結(jié)果為陰性。結(jié)果表明，人工污染模擬實驗得到最低檢測限為10 CFU/mL。

Fig.11 Limits of detection of artificially contaminated samples The gradient dilution of V.splendidus ATCC 33125 strain was applied to the surface of fresh shrimps to simulate the contamination

2.7 實際樣品中的檢測結(jié)果良好

采用本方法對采集的水產(chǎn)品樣品和水體樣品進(jìn)行實際檢測應(yīng)用。經(jīng)LAMP檢測，在655份水產(chǎn)品樣品中，有3份樣品檢出燦爛弧菌，陽性檢出率為0.46%(3/655)。在558份水體樣品中，有3份樣品檢出燦爛弧菌，陽性檢出率為0.54%(3/558)。并且通過比較基于熒光擴(kuò)增曲線(加SYTO-9 熒光染料)，以及基于可視化觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變化(加鈣黃綠素)，所建立的LAMP方法檢測水產(chǎn)品樣品和水體樣品的結(jié)果完全一致。

對于所采集的水產(chǎn)品樣品和水體樣品，同時采用實時熒光PCR方法[4]進(jìn)行驗證，結(jié)果符合率為100%。同時，進(jìn)行燦爛弧菌的菌落分離培養(yǎng)和生化鑒定，經(jīng)鑒定，燦爛弧菌陽性菌株檢出率為66.67%(P= 2.5*10-10)。

2.7.1 不同種類樣品中貝類中檢出燦爛弧菌 655份水產(chǎn)品樣品中，淡水蝦蟹36份、淡水魚105份、海水蝦蟹53份、海水魚171份、貝類189份、頭足類101份，LAMP檢測結(jié)果見Table 3所示。燦爛弧菌陽性樣品種類是貝類，陽性樣品數(shù)為3份，檢出率為1.59%(3/189)。推測貝類更易富集弧菌。

558份水體樣品中，海水樣品440份，江河水98份，養(yǎng)殖場水20份，LAMP檢測結(jié)果見Table 4所示。海水、江河水、養(yǎng)殖場水中燦爛弧菌陽性樣品數(shù)分別為3份、0份和0份，陽性檢出率分別為0.68%(3/440)、0%(0/98)、0%(0/20)。經(jīng)卡方檢驗分析，海水樣品與江河水樣品陽性檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2 =0.672，P> 0.05)，海水樣品與養(yǎng)殖場水樣品陽性檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2 =0.137，P> 0.05)。

Table 3 LAMP detection of V.splendidus in different aquatic products

Table 4 LAMP detection results of V.splendidus in water samples

2.7.2 6～8月樣品中檢出燦爛弧菌 弧菌是喜溫性細(xì)菌。有研究表明，隨著水溫的上升，弧菌的檢出率呈現(xiàn)上升趨勢。因此，夏季弧菌的檢出率最高。本研究的檢測結(jié)果也證實了這種情況，結(jié)果見Table 5所示，燦爛弧菌陽性檢出率最高的是6～8月，檢出率為1.28%(3/235)。

Table 5 LAMP detection of V.splendidus in different months

2.7.3 農(nóng)貿(mào)市場中樣品檢出燦爛弧菌 在中國，多數(shù)農(nóng)貿(mào)市場為開放式的管理方式，不同種類的商品之間存在交叉污染的情況。與農(nóng)貿(mào)市場相比，超市管理會相對規(guī)范，減少了商品間污染的機(jī)會。因此，農(nóng)貿(mào)市場中燦爛弧菌的污染情況會高于超市。本文的檢測結(jié)果也證實了這種情況，結(jié)果見Table 6所示，農(nóng)貿(mào)市場中燦爛弧菌的檢出率為1.46%(3/206)。

Table 6 LAMP detection of V.splendidus in different sampling links

3 討論

我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有著悠久歷史，近年來也逐漸向養(yǎng)殖種類多樣化、養(yǎng)殖模式多元化發(fā)展。然而，集約化生產(chǎn)容易導(dǎo)致生物病害的發(fā)生，管理滯后導(dǎo)致病害問題日益明顯[18-19]，尤其是弧菌屬細(xì)菌(Vibriospp.)等致病菌引起的細(xì)菌性病害?；【鷮偌?xì)菌能引發(fā)魚、海參、蝦、蟹等患弧菌病(Vibriosis)，其中燦爛弧菌被認(rèn)為是魚類重要致病菌之一，嚴(yán)重影響了海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

目前，對燦爛弧菌檢測方法已有相應(yīng)的研究，例如免疫學(xué)檢測技術(shù)，PCR檢測技術(shù)，核酸探針檢測技術(shù)等，但是這些技術(shù)普遍存在操作繁瑣、設(shè)備昂貴、靈敏度和特異性不理想、耗時長等不足，限制了其在基層的應(yīng)用推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、設(shè)備和操作人員要求低等優(yōu)點。針對海水養(yǎng)殖弧菌性病原菌的LAMP檢測技術(shù)已有相關(guān)研究，包括對溶藻弧菌[20-22]、副溶血性弧菌[23-25]、創(chuàng)傷弧菌[26-30]、鯊魚弧菌[31]和哈維氏弧菌[32]等，但對于燦爛弧菌的LAMP檢測方法[3]和實時熒光PCR檢測方法[11]的研究較少。

本研究選擇toxR作為靶基因設(shè)計引物。這是因為雖然在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中，多使用16 s rRNA、gyrB、toxR作為靶基因，但是弧菌屬(Vibrio)的其他物種，也多使用16 s rRNA與gyrB作為靶標(biāo)序列，而toxR與16 s rRNA、gyrB相比較，其特異性相對較好，有更多的堿基差異，方便引物的設(shè)計。

DNA提取方法結(jié)果表明，煮沸DNA裂解法中殘留碳水化合物并不能影響LAMP反應(yīng)，同時具備提取時間短、成本低、方便操作等優(yōu)勢。因此，選取煮沸DNA裂解法進(jìn)行弧菌基因組DNA的提取。

本研究建立了基于觀察擴(kuò)增產(chǎn)物顏色變化(加鈣黃綠素)的可視化LAMP檢測方法用于燦爛弧菌檢測，對655份水產(chǎn)品樣品和558份水體樣品進(jìn)行檢測，燦爛弧菌檢出率為0.46%和0.54%，并且在不同季節(jié)、農(nóng)貿(mào)市場的水產(chǎn)品中有檢出燦爛弧菌。結(jié)果表明，該方法與實時熒光PCR方法的檢測結(jié)果符合率為100%，與經(jīng)典的分離培養(yǎng)鑒定燦爛弧菌符合率為66.67%(p= 2.5×10-10)?？梢暬疞AMP檢測方法的陽性檢出率顯著高于經(jīng)典的分離培養(yǎng)鑒定方法，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

由此可見，預(yù)防水產(chǎn)品和水體環(huán)境中燦爛弧菌的污染依然非常重要，建立一種靈敏度高、操作簡單、快速高效的燦爛弧菌快速檢測方法是十分必要的[33]。根據(jù)本研究的實際應(yīng)用結(jié)果，所建立的水產(chǎn)品及水體中燦爛弧菌現(xiàn)場可視化LAMP檢測方法，可以快速檢測燦爛弧菌，特別是可視化檢測僅需要恒溫器即可完成，是簡單且經(jīng)濟(jì)的，對水產(chǎn)養(yǎng)殖中燦爛弧菌的及時控制及預(yù)防具有重要意義。