劉奇林， 薛 毅， 賴曉輝， 杜大勇， 柳 楊， 張 濤， 李運(yùn)田,*

(1)南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 廣州 510000；2)中國人民解放軍第三O五醫(yī)院心臟中心， 北京 100010)

在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)進(jìn)展過程中，例如斑塊發(fā)生破裂，出現(xiàn)其內(nèi)容物的釋放、血栓的形成將導(dǎo)致血管急性堵塞，引起心肌梗死等嚴(yán)重后果。在臨床上，穩(wěn)定斑塊、延緩斑塊進(jìn)展也是預(yù)防心血管事件發(fā)生的基礎(chǔ)治療，在臨床治療上具有重要地位[1]。斑塊穩(wěn)定性目前認(rèn)為主要與以下因素相關(guān)：較大的脂質(zhì)核心、較薄的纖維帽、斑塊微鈣化、斑塊內(nèi)新生血管及出血、斑塊內(nèi)炎癥因子的表達(dá)、斑塊表面血栓形成等[2,3]，涉及多種細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞的相互影響[4]。巨噬細(xì)胞可在炎癥、氧化應(yīng)激等多個(gè)方面參與AS進(jìn)程并促進(jìn)斑塊進(jìn)展[5,6]，在斑塊穩(wěn)定性方面，其也具有重要調(diào)控作用?；罨木奘杉?xì)胞能夠通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)降解斑塊纖維帽主要成分——膠原蛋白，使得纖維帽變薄，較薄的纖維帽則更容易在剪切力的作用下發(fā)生破裂[7]，導(dǎo)致心血管不良事件的發(fā)生。MMPs與其上游調(diào)控因子金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, CD147)，也被認(rèn)為是能夠有效的調(diào)控膠原蛋白的合成及降解的重要通路[8]。

如今越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群在心血管疾病中扮演重要角色[9]，氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide, TMAO)作為腸道菌群代謝產(chǎn)物，可通過多種途徑促進(jìn)AS的進(jìn)展[10-12]。近來在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者血漿TMAO濃度顯著高于正常人[13]；通過光學(xué)相干斷層掃描觀察斑塊也發(fā)現(xiàn)，高血漿TMAO患者較正常水平患者更容易發(fā)生斑塊破裂[14]。以上研究均提示，TMAO與斑塊不穩(wěn)定可能存在密切聯(lián)系。

而參閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，針對(duì)TMAO對(duì)斑塊穩(wěn)定性的研究目前主要集中在臨床研究，對(duì)其分子機(jī)制卻探討較少。本文通過建立小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞模型，研究TMAO對(duì)巨噬細(xì)胞分泌斑塊穩(wěn)定性相關(guān)因子CD147、MMP2、MMP9的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠白血病巨噬細(xì)胞RAW264.7，引自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco公司，β-肌動(dòng)蛋白抗體購自中杉金橋，CD147抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶2抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶9抗體購自Abcam公司，Lipofectamine RNAiMAX siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒、CD147 siRNA(含陰性對(duì)照siRNA)購自Thermo公司，TMAO購自Merck公司，RT-qPCR試劑盒、RNAiso PLUS購自TaKaRa公司。其他生化試劑均為中科邁晨公司提供或國產(chǎn)分析純。

1.2 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞在含10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)的DMEM中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞密度，鏡下觀察RAW264.7細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞換液傳代。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入含血清的細(xì)胞懸液100 μL，細(xì)胞數(shù)量約2×104細(xì)胞/孔，空白對(duì)照孔用無血清培養(yǎng)基填充。將TMAO按預(yù)設(shè)濃度劑量加入各孔，使得實(shí)驗(yàn)孔的終濃度分別為150 μmol/L、300 μmol/L，并設(shè)置零孔，設(shè)3復(fù)孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h。隨后，往各孔中加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液。后往，各孔內(nèi)加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩30 s，使結(jié)晶溶解充分。最后，在酶標(biāo)儀中測(cè)試各孔在560 nm處吸光值。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染

將RAW264.7細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，待細(xì)胞鋪滿孔內(nèi)約70%時(shí)，根據(jù)Thermo公司Lipofectamine RNAiMAX試劑盒說明書方法，將CD147 siRNA(siCD147)與轉(zhuǎn)染試劑混勻后加入6孔板內(nèi)，孵育5 min。繼續(xù)于孵箱中培養(yǎng)24 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。同時(shí)設(shè)立陰性轉(zhuǎn)染組和細(xì)胞對(duì)照組。

1.5 RT-qPCR

應(yīng)用RNAiso PLUS分離試劑總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)260 nm～280 nm處A值，確定提取RNA純度及濃度。所提取的RNA按日本TaKaRa公司生產(chǎn)的RT-qPCR試劑盒說明書操作進(jìn)行擴(kuò)增，并以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法計(jì)算結(jié)果，引物序列見Table 1。CD147、MMP2、MMP9、β-肌動(dòng)蛋白參考有關(guān)文獻(xiàn)，由上海生工公司合成(Table 1)。

1.6 Western印跡

使用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)。加5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，與CD147、MMP2、MMP9、β-肌動(dòng)蛋白等一抗置4 ℃冰箱過夜，抗體滴度參考說明書。經(jīng)TBST漂洗后加入辣根過氧化物標(biāo)記二抗(山羊抗小鼠IgG)并于室溫下孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，在凝膠發(fā)光儀中拍照并測(cè)目的蛋白質(zhì)和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白灰度值，以目的蛋白質(zhì)與β肌動(dòng)蛋白灰度值的比值為目的蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 氧化三甲胺(TMAO)對(duì)巨噬細(xì)胞存活率的影響

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，高濃度TMAO可能對(duì)巨噬細(xì)胞有毒性作用。因此，首先證實(shí)研究設(shè)置濃度的TMAO是否對(duì)于細(xì)胞活性有影響。實(shí)驗(yàn)用0 μmol/L、150 μmol/L、300 μmol/L的TMAO處理RAW264.7細(xì)胞24 h，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，與0 μmol/L相比較，經(jīng)150 μmol/L、300 μmol/L的TMAO刺激后，細(xì)胞存活率無顯著差異。因此，TMAO濃度在300 μmol/L以下時(shí)，對(duì)細(xì)胞的活性未見明顯的影響(Fig.1)。

Fig.1 TMAO concentration below 500 μmol/L did not affect cell activity The activity of RAW264.7 cells treated with different TMAO (0 μmol/L, 150 μmol/L, 300 μmol/L) was detected by the MMT experiment. Data are expressed as mean ± SD (n=3). *P<0.05 vs TMAO-free group

2.2 經(jīng)氧化三甲胺誘導(dǎo)后CD147、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)增強(qiáng)

觀察通過TMAO刺激后，RAW264.7細(xì)胞表達(dá)斑塊穩(wěn)定性相關(guān)因子的表達(dá)情況。通過參閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，將TMAO濃度梯度定為0、150、300 μmol/L，運(yùn)用RT-qPCR及Western印跡技術(shù)，檢測(cè)CD147、MMP2、MMP9的表達(dá)。結(jié)果顯示，通過與TMAO共培育24 h，MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)呈顯著增加，并呈現(xiàn)一定劑量依賴關(guān)系，而CD147在mRNA水平上并未出現(xiàn)明顯變化(Fig.2)。在蛋白質(zhì)水平上，CD147、MMP2、MMP9表達(dá)則均顯著增強(qiáng)(Fig.3)。該結(jié)果提示，TMAO能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)MMP2和MMP9，并可能在轉(zhuǎn)錄后水平增加CD147的表達(dá)。

Fig.2 TMAO upregulates the expression of MMP2 and MMP9 mRNA in RAW264.7 cells (A, B, C) RT-qPCR was used to detect the mRNA expressions of CD147, MMP2, and MMP9 in RAW264.7 cells stimulated by different concentrations of TMAO (0 μmol/L, 150 μmol/L, 300 μmol/L). Data are expressed as mean ± SD (n=3). *P<0.05 vs TMAO-free group

Fig.3 The protein expression level of CD147, MMP2, and MMP9 has increased in TMAO-induced RAW264.7 cells (A, B) RAW264.7 cells were stimulated with TMAO (0 μmol/L, 150 μmol/L, 300 μmol/L) for 24 hours and Western blotting was used to detect the expression. Data are expressed as mean ± SD (n=3). *P<0.05 vs TMAO-free group

2.3 氧化三甲胺通過CD147參與了基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9的調(diào)控

為了進(jìn)一步研究CD147是否作為上游調(diào)控分子參與了TMAO誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)調(diào)控斑塊穩(wěn)定性相關(guān)因子MMP2與MMP9，本研究使用siCD147轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，探討CD147/MMPs在細(xì)胞表達(dá)中的機(jī)制。研究使用siCD147轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，設(shè)置陰性對(duì)照組，運(yùn)用RT-qPCR驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率(Table 2)。隨后，將轉(zhuǎn)染模型分別與TMAO(濃度為0、150、300 μmol/L)共培育24 h，并設(shè)置對(duì)照組(經(jīng)TMAO濃度為300 μmol/L刺激的RAW264.7細(xì)胞)，分析其表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)siCD147轉(zhuǎn)染處理后，無論從mRNA還是從蛋白質(zhì)水平，CD147、MMP2、MMP9表達(dá)均被顯著抑制(Fig.4)。結(jié)果提示，TMAO在巨噬細(xì)胞中，上調(diào)MMP2、MMP9的作用可能部分是通過CD147/MMPs通路實(shí)現(xiàn)的。

Table 2 RAW264.7 cells were effectively transfected by siCD147

Fig.4 The silencing of CD147 inhibited the expression of MMP2 and MMP9 in RAW264.7 cells (A-C) After RAW264.7 cells were treated with different concentrations of TMAO (0 μmol/L, 150 μmol/L, 300 μmol/L) for 24 hours, the mRNA expressions of CD147, MMP2 and MMP9 were detected by RT-qPCR. (D, E) Western blotting assays were used to detect the protein levels of CD147, MMP2, and MMP9 after treatment with different concentrations of TMAO (0 μmol/L, 150 μmol/L, 300 μmol/L) in RAW264.7 cells. Data are expressed as mean ± SD (n=3). *P<0.05, compared with the group of TMAO 300 μmol/L without siCD147 treatment

3 討論

易損斑塊的形成是多種細(xì)胞相互作用的結(jié)果，而巨噬細(xì)胞在斑塊穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，其可通過分泌炎癥因子、細(xì)胞黏附因子等維持炎癥微環(huán)境以及MMPs等促進(jìn)易損斑塊的形成[15,16]，最終導(dǎo)致心源性猝死等心血管不良事件的發(fā)生。因此，各種因素導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的活化是促進(jìn)斑塊進(jìn)展的關(guān)鍵所在，研究其作用機(jī)制對(duì)于AS的防治具有重要價(jià)值。

腸道菌群現(xiàn)被認(rèn)為積極參與了心血管疾病，其代謝產(chǎn)物TMAO能夠積極促進(jìn)AS疾病的進(jìn)展[17]。近期研究發(fā)現(xiàn)，TMAO能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起包括白介素1-β、腫瘤壞死因子-α等促炎因子表達(dá)[18]，進(jìn)而促進(jìn)單核細(xì)胞遷移轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞；此外，TMAO還能通過上調(diào)巨噬細(xì)胞清道夫受體(CD36、SR-A1)加速其向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化的進(jìn)程[19]，這提示TMAO可作為影響物質(zhì)直接參與了動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。同時(shí)，在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，TMAO與斑塊穩(wěn)定性存在密切聯(lián)系[20,21]，但對(duì)其分子機(jī)制卻探討較少。本文首先通過使用TMAO與小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TMAO刺激后，RAW264.7細(xì)胞在基因與蛋白質(zhì)水平上增加了MMP2、MMP9的表達(dá)，而對(duì)于CD147，TMAO僅在蛋白質(zhì)水平上調(diào)，但在基因水平上未見明顯影響。這表明，TMAO可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP2、MMP9，但可能在轉(zhuǎn)錄后水平增加了CD147的表達(dá)。以上結(jié)果提示，經(jīng)TMAO刺激后，巨噬細(xì)胞表達(dá)MMPs增加，進(jìn)而可能導(dǎo)致了斑塊纖維帽變薄促進(jìn)斑塊朝不穩(wěn)定方向發(fā)展。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將RAW264.7細(xì)胞經(jīng)CD147 siRNA轉(zhuǎn)染處理，再與TMAO共培育24 h，小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)CD147、MMP2、MMP9均受到抑制。表明TMAO上調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP2、MMP9可能部分通過誘導(dǎo)CD147的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。這也提示，TMAO可以通過調(diào)節(jié)CD147/MMPs的表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的降解。

綜上結(jié)果可推測(cè)，TMAO能夠在基因及蛋白質(zhì)水平上促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌MMP2、MMP9，進(jìn)而促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定化，并且該作用可能部分是通過CD147/MMPs這一通路實(shí)現(xiàn)的，但其是否通過其它信號(hào)通路途徑對(duì)斑塊穩(wěn)定性有影響仍有待進(jìn)一步研究。鑒于TMAO在AS的重要作用，抑制其生成可能在AS及相關(guān)疾病中發(fā)揮預(yù)防和治療的作用，具有潛在的臨床應(yīng)用前景，這也要求我們有必要對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。