李文杰，崔露露，麻蕓嬌，梁海永

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000）

楊柳科Salicaceae柳屬Salix植物種類繁多，有450～520種；分布廣泛，主要分布在北半球[1]，在中國屬于原生樹種；適應(yīng)性強，耐濕，抗旱，耐低溫，抗風性好，又具有很高的觀賞價值。柳藍葉甲Plagiodera versicolora又名柳圓葉甲，屬鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae，是柳樹主要食葉害蟲，易在柳樹較多或集中的地方大量發(fā)生。目前柳藍葉甲仍以化學(xué)防治為主，因此對環(huán)境污染較大[2]。如何安全有效地預(yù)防和控制柳藍葉甲的危害成為亟待解決的問題。植物抗蟲性是植物與昆蟲共同進化過程中形成的遺傳性狀，具有專一性、累積性、持續(xù)性、與環(huán)境的協(xié)調(diào)性、與其他防治措施的兼容性等特點，提高植物抗性是害蟲綜合防治策略中的一項重要措施[3?5]。在促使植物具有抗蟲性的諸多因素中，化學(xué)因素起著重要作用[6]。穆丹等[7]研究證明：植物的氣味能夠有效調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)柳藍葉甲的行為。MATSUDA等[8]研究發(fā)現(xiàn)：綠原酸對某些柳樹甲蟲具有拮抗作用。IKONEN等[9]研究表明：葉甲拒食的柳葉中有高含量的綠原酸和水楊酸。由于技術(shù)的限制，植物次生代謝物基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控機制仍然沒有得到解決。代謝組學(xué)技術(shù)在理解代謝網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄基因功能方面起著關(guān)鍵作用[10?14]。隨著質(zhì)譜、核磁共振等相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，代謝組學(xué)與其他組學(xué)技術(shù)的結(jié)合成為代謝組學(xué)研究的熱點[12?14]。本研究選取旱柳S. matsudana、黃花柳S. caprea、 垂柳S. babylonica以及三蕊柳S. triandra的3個無性系進行抗蟲性測定，根據(jù)結(jié)果將柳樹分成抗蟲組與非抗蟲組，再通過代謝組學(xué)技術(shù)分析抗蟲組與非抗蟲組之間的差異次生代謝物，為選育抗蟲性強的柳樹品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取三蕊柳的3個無性系W10、W4、W21，對照包括旱柳K24，黃花柳HHL，垂柳BD3，共6個材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗蟲性指標測定 在養(yǎng)蟲盒底部放入濕潤的濾紙，在每個供試材料上摘取完整嫩葉，用浸濕的棉球包裹葉柄以防止葉片失水，把嫩葉放于濕潤的濾紙上，接入相同齡期的30只柳藍葉甲幼蟲，每個材料均設(shè)3組重復(fù)，每組5片葉，7 d后觀察幼蟲存活數(shù)量并計算存活率。

1.2.2 代謝組學(xué)分析 植物代謝組學(xué)是一種高通量、無偏倚的綜合分析[15]。將供試樣品根據(jù)抗蟲性指標測定的結(jié)果分為非抗蟲組和抗蟲組，采集新鮮葉片，液氮速凍用箔紙包好，?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩；赨PLC-Q-TOF-MS和GC-MS的代謝組學(xué)分析方法，對不同樣品的代謝譜進行分析[16]。OPLS-DA是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析中常用的分析方法，是PLS-DA的擴展[17]，通過去除與分組無關(guān)的系統(tǒng)自身差異篩選代謝差異物，使分離達到最大化[18]，再通過差異聚類熱圖分析[19]對樣品和指標進行分類。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理；使用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗以及相關(guān)性分析；使用Origin 8.0作圖。用OPLS-DA、單維分析(t檢驗)和差異倍數(shù)篩選組間差異代謝物。篩選獲得的差異代謝物用http://www.hmdb.ca/和https://metlin.scripps.edu/數(shù)據(jù)庫進行定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)幼蟲存活率

由圖1可見：喂食黃花柳、旱柳、垂柳的幼蟲平均存活率分別為90%、98%、93%，其中，喂食旱柳的幼蟲存活率最高。喂食三蕊柳3個無性系的幼蟲存活率均為0，在接蟲后的第4天全部死亡。因此，把柳樹分類非抗蟲組(旱柳K24、黃花柳HHL和垂柳BD3)以及抗蟲組(三蕊柳的3個無性系W10、W4和 W21)。

圖1 室內(nèi)幼蟲存活率Figure 1 Survival rate of indoor larvae

2.2 正交偏最小二乘法判別分析

由OPLS-DA得分圖(圖2)顯示：不同抗性組合模型參數(shù)中R2X=0.615，說明該模型對自變量X的解釋程度為61.5%；R2Y=0.997，表示對分類變量Y的解釋程度為99.7%；Q2=0.844，表示該模型對樣本變量的預(yù)測程度為84.4%，說明OPLS-DA模型穩(wěn)定性良好且預(yù)測能力較強。OPLS-DA的得分圖顯示非抗蟲組與抗蟲組的數(shù)據(jù)點在OPLS1上完全區(qū)分，表明兩者存在明顯化學(xué)差異。

圖2 非抗蟲組與抗蟲組OPLS-DA得分圖Figure 2 OPLS-DA score chart of non-insect resistant group and insect resistant group

2.3 差異代謝物火山圖

從圖3可以看出：在指定閾值P＜0.01時，共篩選出23種顯著差異代謝物。結(jié)果顯示：抗蟲組與非抗蟲組比較，其中上調(diào)的差異代謝物數(shù)目為15種，下調(diào)的代謝物數(shù)目為8種。

圖3 差異代謝物火山圖Figure 3 Volcano map of differential metabolites

2.4 差異代謝物篩選

不同柳樹樣本中共檢測到651個物質(zhì)信號，經(jīng)過標準樣品數(shù)據(jù)庫和參考文獻比對，對有生物學(xué)重復(fù)的，采取將差異倍數(shù)，t檢驗的P值和OPLS-DA模型的變量投影重要度(VIP)相結(jié)合的方法來篩選差異代謝物，篩選的標準為差異倍數(shù)FC＞1，t檢驗P＜0.01和VIP＞1。由表1可見：經(jīng)篩選后，非抗蟲組與抗蟲組共篩選出23種主要的差異代謝產(chǎn)物。其中阿魏酰胍丁胺、抗壞血酸、沒食子酸、綠茶兒茶酚、沒食子兒茶素、楊梅苷、葡萄酸銅、D-(?)-阿拉伯糖、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯、N-阿魏酰胍丁胺、葡糖酸、2′, 4′, 5, 7-四羥基異黃酮、N-乙酰-DL-色氨酸、異澤蘭黃素-3-葡萄糖苷、十六聚甲烷基鞘氨醇等15種產(chǎn)物表現(xiàn)為上調(diào)，而槲皮素-3-O-(6″-O-乙?；?-β-D-吡喃半乳糖苷、橙皮甙、蘆丁、聚半乳糖醛酸、2, 5-二羥基苯甲酸、槲皮素O-乙酰己烯苷、3-羥基-5-甲基苯酚-1-氧化基-β-D-葡萄糖、槲皮素等8種產(chǎn)物表現(xiàn)為下調(diào)。并且其中異澤蘭黃素-3-葡萄糖苷在非抗蟲組中并未檢測到，但其在抗蟲組的含量較高。

表1 差異代謝物篩選Table 1 Differential metabolite screening

2.5 差異聚類熱圖

篩選具有顯著差異(P＜0.05)的代謝物進行聚類熱圖分析，進一步挖掘特征，并對篩選后的差異代謝物歸一化處理。由圖4顯示：抗蟲組樣本豐度明顯區(qū)別于非抗蟲組樣本，抗蟲組樣本組內(nèi)也有差異但不明顯，非抗蟲組中黃花柳的樣本成分分布豐度與垂柳和旱柳存在差異?？梢钥闯觯耗苊黠@劃分成4個區(qū)域冷暖色差分異，在非抗蟲組豐度高而在抗蟲組中豐度低的代謝物，為8種下調(diào)代謝產(chǎn)物；在抗蟲組中豐度高而在非抗蟲組中豐度低的代謝物為15種上調(diào)代謝物。

圖4 差異代謝聚類熱圖Figure 4 Differential metabolism clustering heat map

3 討論與結(jié)論

本研究對4種不同柳樹無性系進行了室內(nèi)飼蟲，結(jié)果顯示三蕊柳對柳藍葉甲表現(xiàn)出了高抗性；通過應(yīng)用代謝組學(xué)方法對非抗蟲組與抗蟲組的次生代謝產(chǎn)物進行測定，篩選并最終鑒定出23種主要的差異代謝產(chǎn)物。上調(diào)次生代謝物包括阿魏酰胍丁胺、抗壞血酸、沒食子酸、綠茶兒茶酚、沒食子兒茶素、楊梅苷、葡萄酸銅、D-(?)-阿拉伯糖、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯、N-阿魏酰胍丁胺、葡糖酸、2′, 4′, 5, 7-四羥基異黃酮、N-乙酰-DL-色氨酸、異澤蘭黃素-3-葡萄糖苷、十六聚甲烷基鞘氨醇等15種。下調(diào)次生代謝物包括槲皮素-3-O-(6″-O-乙?；?-β-D-吡喃半乳糖苷、橙皮甙、蘆丁、聚半乳糖醛酸、2, 5-二羥基苯甲酸、槲皮素O-乙酰己烯苷、3-羥基-5-甲基苯酚-1-氧化基-β-D-葡萄糖、槲皮素等8種。這些差異特定代謝物影響的機制尚待進一步研究。

凌嘉昊[20]通過調(diào)查野外蟲害等級和室內(nèi)取食率來對比簸箕柳S. suchowensis和三蕊柳的抗蟲性，發(fā)現(xiàn)三蕊柳表現(xiàn)出了高抗性，與本研究結(jié)果一致；該研究還發(fā)現(xiàn)三蕊柳的揮發(fā)物會使柳藍葉甲產(chǎn)生趨避反應(yīng)，并且鑒定分析顯示22種揮發(fā)物組分在釋放量方面有顯著差異。而本研究發(fā)現(xiàn)：柳藍葉甲的幼蟲對三蕊柳存在取食行為，在接蟲后的第4天全部死亡，表明三蕊柳除揮發(fā)物會對柳藍葉甲產(chǎn)生趨避反應(yīng)外，其次生代謝產(chǎn)物可能會對柳藍葉甲幼蟲產(chǎn)生毒害作用，或缺乏幼蟲生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致其死亡。黃酮類物質(zhì)是植物中一類重要的次生代謝物質(zhì)，可以影響昆蟲的行為和代謝，使之產(chǎn)生忌避、拒食等行為，破壞昆蟲的正常代謝，嚴重時導(dǎo)致昆蟲中毒甚至死亡，是對昆蟲有毒的一類次生代謝產(chǎn)物[21]。生物堿是一大類含氮的堿性物質(zhì)，對昆蟲的防御作用主要表現(xiàn)在阻礙昆蟲的取食以及引起昆蟲中毒2個方面[22]。有研究表明：樹木中的酚酸類物質(zhì)含量越高，對天牛Cerambycidae的抗性就越強，但不同酚酸在不同無性系間的變化規(guī)律隨其種類的不同而不同[23]。本研究可為培育抗蟲性強、性狀優(yōu)良的柳樹品種提供理論基礎(chǔ)，三蕊柳的具體抗蟲機制還有待進一步研究。