梁松，楊亞飛，張耀斌

(大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116024)

目前，有關(guān)Feammox的研究主要集中于自然環(huán)境中的物質(zhì)遷移轉(zhuǎn)化和元素循環(huán)[3-6]。但在廢水脫氮方面，由于Feammox發(fā)現(xiàn)較晚，目前的少量報(bào)道主要以人工配制廢水為主[7-8]，且缺乏15N標(biāo)記同位素等手段進(jìn)行證實(shí)。另一方面，F(xiàn)eammox與異化鐵還原密切相關(guān)[9]。據(jù)報(bào)道[10]，腐殖質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有的羥基/醌基可用作電子穿梭體，提高異化鐵還原效率。但腐殖質(zhì)是否可以用于加快Feammox的報(bào)道較少。

筆者將稀釋后的污泥消化液作為處理對象，向厭氧反應(yīng)器內(nèi)投加水鐵礦，嘗試驅(qū)動Feammox過程并探究其對氮去除效果的影響；利用同位素標(biāo)記、微生物群落分析等方法研究脫氮與Feammox的相關(guān)性；投加腐殖質(zhì)探究其對Feammox脫氮的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.2 水鐵礦合成 使用的水鐵礦根據(jù)Cornell等[11]的方法合成，即在磁力攪拌條件下向FeCl3·6H2O溶液中逐滴加入1 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.6，得到褐色懸浮狀水鐵礦后靜置并吸去上清液，用去離子水重復(fù)洗滌離心(8 000 r/min，10 min)3次，去除多余的去離子水后冷凍干燥，獲得實(shí)驗(yàn)所用水鐵礦。

表1 實(shí)驗(yàn)所用污泥消化液的主要初始指標(biāo)

1.1.4 腐殖質(zhì) 實(shí)驗(yàn)所用腐殖質(zhì)為阿拉丁試劑(上海)有限公司所生產(chǎn)的腐植酸，主要成分為黃腐酸，CAS為1415-93-6。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案及測試方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置 實(shí)驗(yàn)開始前，將無菌缺氧的去離子水與經(jīng)過馴化后的引種污泥按照體積比3∶1的比例充分混合，在黑暗中于25 ℃預(yù)培養(yǎng)3 d，以去除背景氮氧化物，去除上清液后的污泥用作實(shí)驗(yàn)接種污泥，主要初始指標(biāo)如表2所示。向100 mL血清瓶中加入7 mL已去除上清液的接種污泥和70 mL稀釋后的污泥消化液。設(shè)置實(shí)驗(yàn)方法(每組9個(gè)血清瓶)：1)未投加水鐵礦的對照組；2)投加水鐵礦的水鐵礦組；3)投加水鐵礦和腐殖質(zhì)的腐殖質(zhì)組。用丁基橡膠隔片密封血清瓶，并用鋁蓋壓蓋后用超高純氬氣沖洗血清瓶以排出空氣，然后將其置于充滿氬氣的厭氧手套箱中，該手套箱放置于恒溫房中。

表2 實(shí)驗(yàn)所用接種污泥的主要初始指標(biāo)

每間隔2 d從血清瓶中進(jìn)行破壞性采樣，每個(gè)血清瓶采樣2次后丟棄。取樣前，劇烈搖晃血清瓶以混勻樣品，取樣在充滿氬氣的厭氧手套箱中操作。

1.2.215N同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 同位素標(biāo)記培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基組分為：MgCl2·6H2O(0.4 g/L)、CaCl2·H2O(0.1 g/L)、15NH4Cl(0.1 g/L)和KH2PO4(0.6 g/L)、1 mL/L維生素溶液、1 mL/L微量元素溶液、30 mmol/L碳酸氫鹽緩沖液和2 mmol/L乙酸鹽[12]。所有實(shí)驗(yàn)的接種污泥處理方法和實(shí)驗(yàn)方法設(shè)置全部一致。同位素標(biāo)記培養(yǎng)基在厭氧手套箱中培養(yǎng)30 d后，使用配有質(zhì)譜分析儀的氣相色譜儀(GC/MS, QP2020)檢測厭氧反應(yīng)器頂空氣體中30N2的生成(色譜柱類型為SH-RXI-5silMS，氣體手動進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度280 ℃，質(zhì)譜掃描范圍12～32 m/z，全掃描)。頂空氣體中的N2體積通過帶有熱導(dǎo)檢測器(TCD)的氣相色譜儀(Tianmei, GC-7900P/TCD, 中國)進(jìn)行測定。

采用分步提取法對反應(yīng)器內(nèi)不同鐵氧化物進(jìn)行提取并對其各自所占比例進(jìn)行計(jì)算[14-16]。

第48天的對照組和水鐵礦組反應(yīng)器內(nèi)的污泥樣品委托上海美吉生物公司通過高通量16S rDNA測序進(jìn)行微生物群落分析：根據(jù) E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進(jìn)行微生物群落總DNA抽提，使用338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增之后的產(chǎn)物經(jīng)過回收純化和檢測定量后利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進(jìn)行測序。

同時(shí)委托上海美吉生物公司進(jìn)行基于RNA的實(shí)時(shí)定量PCR分析(qPCR)，用于進(jìn)一步確定某些功能性基因的絕對數(shù)量和活性[17]。使用引物組1055f/1392r對16S rRNA基因進(jìn)行總細(xì)菌定量表示。使用引物組Amx368f/Amx820r鑒定量化Anammox功能菌，F(xiàn)eammox功能微生物Geobacteraceae和AcidimicrobiaceaeA6細(xì)菌分別使用引物組Geo494F/Geo825R和acm342f/439r進(jìn)行鑒定量化[18-19]。具體的引物信息如表3所示。

表3 用于擴(kuò)增的實(shí)時(shí)定量 PCR 引物

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 投加水鐵礦對氨氮去除的影響

圖1 實(shí)驗(yàn)過程中氨氮及硝態(tài)氮的濃度變化

為了進(jìn)一步研究投加水鐵礦對氮去除的影響，對實(shí)驗(yàn)前后的總氮進(jìn)行測定(圖1(d))。結(jié)果表明，水鐵礦組的總氮去除率為57.5%，而對照組僅為2.5%，表明向厭氧反應(yīng)器中投加水鐵礦可以顯著提高氮的去除率。

2.2 Fe(Ⅱ)濃度變化

圖2 實(shí)驗(yàn)過程中Fe(Ⅱ)濃度變化

圖3 實(shí)驗(yàn)后水鐵礦組中污泥的 XRD 圖譜

2.3 同位素標(biāo)記結(jié)果分析

表4 厭氧條件下產(chǎn)生30N2和29N2的可能的途徑[24]

圖4 同位素標(biāo)記培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中30N2和29N2產(chǎn)量

2.4 微生物群落分析

到目前為止，F(xiàn)eammox的功能性微生物尚未被完全闡明，大多數(shù)研究認(rèn)為鐵還原菌是Feammox的功能微生物[12, 25]。在本研究中，水鐵礦組中的鐵還原菌被富集。對比對照組和水鐵礦組，在屬水平，Geobacter在水鐵礦組中的相對豐度為0.54%，而在對照組中僅為0.003 6%，相差約150倍。

表5 對照組與水鐵礦組內(nèi)部分鐵還原菌的相對豐度

此外，Huang等[19]在河岸濕地中發(fā)現(xiàn)了另一種在Feammox中起重要作用的微生物(AcidimicrobiaceaeA6菌)，其被確認(rèn)為是Feammox的功能微生物。在本研究中，盡管在16S rDNA高通量測序中未檢測到AcidimicrobiaceaeA6細(xì)菌，但基于RNA的實(shí)時(shí)定量PCR分析(qPCR)結(jié)果顯示，在水鐵礦組和對照組中AcidimicrobiaceaeA6細(xì)菌的拷貝數(shù)分別為4.15×107和4.90×106，這一差距表明，作為Feammox功能微生物的AcidimicrobiaceaeA6細(xì)菌在投加Fe(Ⅲ)的厭氧反應(yīng)器中表達(dá)得更為活躍。

特別地，16S rDNA高通量測序結(jié)果和qPCR中都未檢測到Anammox菌或Anammox基因，進(jìn)一步證明了氨氮的去除并非由Anammox導(dǎo)致。

2.5 投加腐殖質(zhì)對脫氮效果的影響

異化鐵還原過程中，微生物將電子傳遞至胞外不溶性鐵氧化物，是其呼吸代謝的制約性步驟。同時(shí)，反應(yīng)過程中生成的Fe(Ⅱ)不斷沉積在鐵氧化物表面并與其進(jìn)行電子交換，導(dǎo)致次生礦物生成，鐵氧化物晶型不斷向更穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)化，使微生物難以利用。上述原因?qū)е铝水惢F還原的速率逐步降低。一般說來，小分子有機(jī)物可作為有機(jī)碳源被微生物吸收用于生長，而腐殖質(zhì)為大分子有機(jī)物，難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部為微生物提供生長所需碳源。據(jù)報(bào)道[10]，腐殖質(zhì)以電子穿梭體的作用存在于異化鐵還原過程中。為探究腐殖質(zhì)在Feammox過程中的作用，在投加水鐵礦的同時(shí)向反應(yīng)器內(nèi)投加腐殖質(zhì)。

在厭氧培養(yǎng)48 d后，水鐵礦組和腐殖質(zhì)組反應(yīng)器內(nèi)Fe(Ⅱ)濃度最終分別為1 138.33、1 839.18 mg/L，相應(yīng)的Fe(Ⅱ)生成率分別為23.72、38.32 mg/(L·d)，反應(yīng)器內(nèi)Fe(Ⅱ)的生成速率提高了近一倍。根據(jù)第48天兩組反應(yīng)器內(nèi)二價(jià)鐵濃度對鐵還原率進(jìn)行核算，結(jié)果如圖5所示，水鐵礦組和腐殖質(zhì)組反應(yīng)器內(nèi)的鐵還原率分別為46.18%和89.36%，鐵還原率提高了40%以上。結(jié)果表明，投加腐殖質(zhì)后，通過促進(jìn)異化鐵還原過程提高了Feammox的反應(yīng)速率。

圖5 反應(yīng)器內(nèi)最終Fe(Ⅱ)濃度及鐵還原率

圖6為單獨(dú)投加水鐵礦和同時(shí)投加水鐵礦和腐殖質(zhì)組內(nèi)樣品的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，可以看到，未投加腐殖質(zhì)的反應(yīng)器內(nèi)塊狀磁鐵礦顆粒更清晰，體積更大，數(shù)量較多，分布更密集；而投加了腐殖質(zhì)的反應(yīng)器內(nèi)混合物的形態(tài)更為蓬松，顆粒狀晶型不明顯，數(shù)量少，分布散，體積也更小。結(jié)果表明，向反應(yīng)器內(nèi)投加腐殖質(zhì)可以減緩反應(yīng)器內(nèi)結(jié)構(gòu)松散的鐵氧化物向結(jié)構(gòu)密實(shí)的高結(jié)晶態(tài)鐵氧化物的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

圖6 第48天反應(yīng)器內(nèi)鐵氧化物形態(tài)

X射線光電子能譜(XPS)分峰擬合結(jié)果如圖7所示，水鐵礦組樣品的Fe 2p圖譜在723.1、710.61 eV處出現(xiàn)兩個(gè)峰，分別對應(yīng)了Fe3O4的Fe 2p1/2和Fe 2p3/2自旋軌道躍遷[26]，說明反應(yīng)器內(nèi)生成了高結(jié)晶態(tài)的磁鐵礦，而腐殖質(zhì)組樣品的Fe 2p圖譜在724.6、710.8 eV處出現(xiàn)兩個(gè)峰，對應(yīng)了Fe2O3的存在，該結(jié)果與SEM結(jié)果吻合，表明投加腐殖質(zhì)可減慢水鐵礦的晶型轉(zhuǎn)變速度。

圖7 第48天反應(yīng)器內(nèi)樣品Fe 2p掃描XPS圖譜

此外，對比兩組樣品的Fe 2p掃描圖譜可以發(fā)現(xiàn)，水鐵礦組樣品的圖譜更為平滑，而腐殖質(zhì)組樣品的圖譜上有許多噪音信號，說明該樣品表面的含鐵量較少，而腐殖質(zhì)的投加并不會改變樣品表面的含鐵量，原因可能是腐殖質(zhì)覆蓋在鐵氧化物的表面并與其結(jié)合，這種作用會加速電子傳遞，進(jìn)而提高反應(yīng)速率。

對反應(yīng)結(jié)束后的水鐵礦組和腐殖質(zhì)組內(nèi)不同鐵氧化物進(jìn)行提取，確定其各自占總量的比例，結(jié)果如圖8所示。兩組樣品中主要以易還原的羥基氧化鐵(水鐵礦和纖鐵礦)和結(jié)晶態(tài)的鐵氧化物形式存在，水鐵礦組和腐殖質(zhì)組內(nèi)易被還原態(tài)的鐵氧化物占比分別為41.92%和52.44%，結(jié)晶態(tài)的鐵氧化物占比分別為55.21%和41.63%?？梢钥吹?，在投加了腐殖質(zhì)的反應(yīng)器內(nèi)易被還原形態(tài)的鐵氧化物所占比例最高，而未投加腐殖質(zhì)的反應(yīng)器內(nèi)高結(jié)晶態(tài)鐵氧化物含量最高，表明腐殖質(zhì)在一定程度上可以阻止部分鐵氧化物向晶型更為穩(wěn)定的鐵礦物轉(zhuǎn)化。

圖8 反應(yīng)器內(nèi)鐵氧化物的形態(tài)分布

3 結(jié)論

向污泥消化液中投加水鐵礦驅(qū)動厭氧反應(yīng)器中Feammox過程發(fā)生，研究投加Fe(Ⅲ)對氮去除效果的影響，得到以下主要結(jié)論：

3)微生物群落分析結(jié)果表明，投加水鐵礦后在反應(yīng)器內(nèi)富集了Geobacter等多種鐵還原菌；qPCR結(jié)果表明，投加水鐵礦的反應(yīng)器內(nèi)Feammox功能微生物AcidimicrobiaceaeA6菌表達(dá)活躍，說明反應(yīng)器內(nèi)的氮去除與Feammox有關(guān)。

4)反應(yīng)器內(nèi)的鐵氧化物組成及形態(tài)分析表明，腐殖質(zhì)除了以電子穿梭體進(jìn)行作用外，還可通過減緩鐵氧化物鈍化，增強(qiáng)異化鐵還原而提高Feammox效率。

利用水鐵礦驅(qū)動了Feammox脫氮，而腐殖質(zhì)進(jìn)一步促進(jìn)了該過程，氮去除率進(jìn)一步提高。需要指出的是，F(xiàn)eammox過程中氨氮去除需要較長反應(yīng)時(shí)間，這可能與Feammox的自養(yǎng)方式有關(guān)，也與異化鐵還原的胞外電子傳遞相關(guān)?？梢栽谖⑸锔患?、強(qiáng)化，以及提高胞外電子傳遞等方面進(jìn)一步開展研究。

區(qū)別于傳統(tǒng)生物脫氮方式，該方法可在厭氧消化器內(nèi)實(shí)現(xiàn)脫氨氮，前提是需要Fe(Ⅲ)的持續(xù)投加。連續(xù)投加Fe(Ⅲ)看似不易，但對于富含F(xiàn)e(Ⅲ)的芬頓污泥，可將其用作三價(jià)鐵源。尤其對具備較長處理時(shí)間條件的垃圾填埋場，F(xiàn)eammox可以作為一種有較好應(yīng)用前景的生物脫氮技術(shù)。