楊帆，王帥，龍曼，趙凡，郭勁松，方芳

(重慶大學 環(huán)境與生態(tài)學院，重慶 400045)

有關顆粒污泥EPS的研究比較多[8-10]，但多集中在胞外蛋白方面[11-12]。作為EPS中的主要成分之一，胞外多糖對顆粒污泥的影響日益受到重視[13]。Sajjad等[14]認為胞外多糖中帶負電的基團可與二價陽離子形成架橋作用，將微生物結合在一起。Lin等[15]認為好氧顆粒污泥中的凝膠對其結構穩(wěn)定具有重要作用，而多糖則是EPS的主要凝膠成分[16-17]。因此，從胞外多糖的角度深入探討影響Anammox顆粒污泥穩(wěn)定性的原因具有重要意義。

胞外多糖對Anammox顆粒污泥的形成和穩(wěn)定有重要作用[18]。有學者指出，胞外多糖通過形成聚合物來促進微生物間的黏附，從而增強顆粒穩(wěn)定性[13]。此外，多糖交聯(lián)形成水凝膠也是維持顆粒穩(wěn)定的重要因素[16-17]。目前，已在好氧顆粒污泥胞外聚合物中鑒定出alginate多糖和granulan多糖兩種凝膠多糖[15, 19]，它們可以在生物聚集體外形成結構凝膠，有助于聚集體結構的穩(wěn)定。胞外多糖通過氫鍵相連接，促進污泥結構穩(wěn)定[20]。Adav等[21]研究發(fā)現(xiàn)，胞外多糖可以形成網(wǎng)格狀骨干以維持好氧顆粒污泥的穩(wěn)定性。Yuan等[22]認為糖是一種具有長鏈的聚合物，可提供許多結合位點，并通過鏈纏結來保持顆粒穩(wěn)定[23]。遺憾的是，這些研究沒有直接從多糖鏈結構角度對胞外多糖的功能進行更全面的認識。

筆者采用可酶解多糖的兩種淀粉酶來水解Anammox顆粒污泥胞外多糖，研究酶解前后顆粒污泥的穩(wěn)定性，結合顆粒污泥表面性質和XDLVO理論分析微生物的聚集，探討酶解前后污泥EPS的官能團組成和胞外多糖空間分布，以期從胞外多糖的角度理解其對顆粒污泥穩(wěn)定性的影響及機理。

1 材料與方法

1.1 反應器和廢水性質

1.2 實驗方案

多糖是由糖苷鍵結合形成的糖鏈，為研究胞外多糖對顆粒污泥穩(wěn)定性的影響及機理，采用α-淀粉酶和β-淀粉酶分別水解顆粒污泥。α-淀粉酶可隨機水解α-1,4-糖苷鍵，而β-糖苷鍵則從非還原末端逐次水解α-1,4-糖苷鍵，但切斷至分支點的α-1,6-糖苷鍵前則會停止。因此，在α-淀粉酶作用下，多糖糖鏈被剪切成短鏈，而經(jīng)β-淀粉酶水解后僅多糖支鏈末端被水解，其主鏈并未被破壞。

將粒徑均勻的30 g顆粒污泥均分為3組并分裝在50 mL離心管中，設置為對照組、α-淀粉酶處理組和β-淀粉酶處理組，實驗設計如表1所示。添加酶解液后，將3組污泥在恒溫振蕩器中以150 r/min，37 ℃的條件振蕩1 h。用去離子水沖洗酶解后的污泥，洗去殘留的酶解液，以用于后續(xù)分析，對于每個酶處理組和對照組進行3次重復實驗。實驗所用淀粉酶均購于Coolaber公司，并按Adav等[21]的實驗方法配置成相應濃度的溶液。

表1 酶解顆粒污泥的實驗設計

1.3 Anammox顆粒污泥性能測試

顆粒污泥強度可以用來反映顆粒污泥酶解前后的穩(wěn)定性，采用超聲法測定顆粒污泥的強度[25]。將顆粒污泥放入裝有15 mL去離子水的25 mL錐形瓶中，然后將其置于20～25 kHz、65 W的超聲浴中，以2.5(開)～3 s(關)為周期進行超聲處理。收集超聲后的上清液，并用分光光度計在600 nm處測定吸光度，該值可代表上清液的濁度。

顆粒污泥表面疏水性采用基于正十二烷-水系統(tǒng)的微生物黏附烷烴試驗測定[26]。將待測污泥研磨制成細胞懸浮液，用去離子水將細胞懸浮液的OD546，0調整到約0.3，取4 mL懸浮液用漩渦振蕩器充分混合2 min，隨后靜置沉降15 min，測定OD546.1。另取4 mL懸浮液與1 mL正十二烷充分混合，使用漩渦振蕩器充分混合2 min，隨后靜置15 min以保證分離，此時部分細胞懸浮液被吸附到烷烴相，而取水相測定OD546,2。測試重復3次，采用式(1)計算相對疏水度。

(1)

Zeta電位可反映污泥表面帶電荷情況，將污泥充分碾磨制成懸浮液，并用0.1 mol/L的NaCl溶液調整懸浮液的OD546約為0.1，采用納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90,英國)測試，每個樣品測試3次，取平均值。

污泥與水、甲酰胺和1-溴萘的接觸角被用于分析污泥的表面熱力學特性。接觸角的測定參照Liu等[27]的方法。用研缽研磨污泥制備污泥懸浮液，以0.45 μm的醋酸纖維素膜過濾。切下一片膜，用接觸角測量儀(SDC-100, Shengding, 中國)分別測定膜上污泥與水、甲酰胺和1-溴萘的接觸角。每個樣品測定10次，取平均值。

1.4 表面熱力學和XDLVO理論

根據(jù)熱力學參數(shù)和ζ電位，可以獲得以距離為變量的微生物間的相互作用總能量WT、壓縮雙電層能量WR、范德華能量WA和酸堿相互作用能量WAB[28]，進而可以從能量的角度解釋微生物聚集的機理。WT是WR、WA和WAB的總和，具體計算過程和參數(shù)取值在文獻[29]中有詳細的描述。

1.5 EPS含量及紅外光譜分析

采用堿提法提取顆粒污泥EPS[30]。EPS中的胞外蛋白使用BCA蛋白試劑盒(Solarbio，日本)進行測定[31]，以牛血清蛋白為參考標準。胞外多糖使用蒽酮-硫酸法測定，并以葡萄糖作為參考標準[32]。

傅里葉紅外光譜(FTIR)可以有效檢測EPS中的官能團[33]。將冷凍干燥的10 mg EPS樣品與KBr混合制成壓片，采用紅外光譜儀(Nicolet iS50, Thermo Fisher Scientific.,美國)在4 000～400 cm-1范圍內對EPS樣品進行紅外光譜掃描。所有FTIR光譜均進行歸一化至最大發(fā)射1.0后進行數(shù)據(jù)分析。

1.6 共聚焦激光掃描顯微鏡

共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)可以直接觀察多糖的空間分布。參考Adav等[21]和Ni等[18]的方法，分別用20 μL Con A(0.25 g/L)、20 μL CW(0.3 g/L)染色胞外α-D-吡喃葡萄糖多糖和β-D-吡喃葡萄糖多糖。染色后將樣品置于共聚焦激光掃描顯微鏡(TCS SP8 CSU，Leica，德國)下觀察，采用LAS X共聚焦軟件進行數(shù)據(jù)分析，并歸一化至最大發(fā)射1.0后進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 顆粒污泥穩(wěn)定性

圖1為酶解后Anammox顆粒污泥聚集體外觀形態(tài)和局部顯微鏡圖像。對照組的污泥形狀規(guī)則，呈橢球狀，邊緣清晰，無碎片。α-淀粉酶處理組的顆粒污泥外緣發(fā)生輕微溶脹，出現(xiàn)明顯透光現(xiàn)象，但無明顯破損。β-淀粉酶處理的顆粒污泥中出現(xiàn)了部分小碎片，但并未發(fā)生溶脹，且在顯微鏡下污泥結構密實，邊界清晰可見。

圖1 Anammox顆粒污泥照片

顆粒污泥結構致密，具有一定的強度。采用超聲法研究多糖對污泥結構穩(wěn)定性的影響，A600吸光度的大小可代表污泥經(jīng)超聲處理后上清液的濁度，用于表示污泥解體程度，即間接表明顆粒污泥強度[25]，結果如圖2所示。β-淀粉酶處理組的顆粒污泥經(jīng)超聲處理后上清液在A600的吸光度迅速上升，表明顆粒發(fā)生了明顯的解體，顆粒污泥強度明顯降低。對照組和α-淀粉酶處理組的顆粒污泥在超聲處理下A600吸光度的變化較小。與對照組相比，α-淀粉酶水解后顆粒污泥強度基本不變，但經(jīng)超聲處理20 min后強度略有所下降。

圖2 Anammox顆粒污泥A600吸光度變化

2.2 顆粒污泥表面性質

如表2所示，酶解前后污泥表面Zeta電位相差不大，多糖水解并未改變污泥表面的電負性。與對照組相比，經(jīng)α-淀粉酶和β-淀粉酶水解后，顆粒污泥的疏水度明顯降低。接觸角測定結果顯示，酶處理組與純水的接觸角明顯低于對照組，同樣表明酶解降低了Anammox顆粒污泥的表面疏水性。同時，1-溴代萘是一種非極性物質，污泥與其接觸角越大則表明污泥親水性越強，即疏水性減弱。

表2 Anammox顆粒污泥表面性質

2.3 XDLVO理論分析

以接觸角和Zeta電位值計算酶解前后Anammox顆粒污泥表面熱力學參數(shù)，結果如表3所示。

表3 Anammox顆粒污泥表面熱力學參數(shù)

進一步應用XDLVO理論分析微生物相互作用能與其間距的關系，結果如圖3所示。淀粉酶處理的顆粒污泥的相互作用總能量(WT)曲線存在能量勢壘，不利于微生物之間的相互吸引和聚集，而對照組則沒有明顯的勢壘。此外，相對于壓縮雙電層能量(WR)和范德華能量(WA)，酸堿相互作用能量(WAB)具有很高的值，因而直接影響了WT，并在聚集體的聚集中起關鍵作用。在3組不同樣品中，對照組顆粒污泥WAB為負，表明微生物相互吸引，經(jīng)酶解處理的樣品WAB為正，表明微生物之間相互排斥。

圖3 Anammox污泥熱力學曲線

2.4 EPS含量及官能團組成

圖4為EPS的紅外光譜圖。3 287 cm-1處的振動代表O—H的伸縮運動[35]，酶解后EPS中此峰值有所降低。胞外多糖中與O—H有關的帶負電羥基和羧基可被Ca2+、Mg2+等二價陽離子橋接，將細胞結合在一起，促進微生物聚集。2 883 cm-1附近的吸收峰代表烷烴有機物和多糖分子中的C—H振動[36]，C—H是EPS中最豐富的疏水官能團，顆粒污泥被水解后EPS此峰值同樣下降。1 636 cm-1處表示酰胺I區(qū)域的存在[37]，1 562 cm-1處代表了酰胺Ⅱ區(qū)域的C—N和C—H振動[37]，代表了疏水性官能團[38]，酶解組EPS這些峰值都有所降低。1 050 cm-1的吸收峰歸因于胞外多糖中C—O—C拉伸和C—H的平面內彎曲[39]，該峰值只在β-淀粉酶水解后的EPS中發(fā)生變化，表明β-淀粉酶處理并未降低多糖之間的纏結，這也是顆粒污泥能維持顆粒狀的原因。

圖4 Anammox顆粒污泥EPS的FTIR光譜

2.5 胞外多糖空間分布

原位熒光染色和共聚焦激光掃描顯微鏡可用來觀察微生物聚集體胞外多聚物的分布情況(圖5)，其中，圖5(c)、(f)、(i)熒光強度曲線圖為沿著顆粒污泥某一直線方向上的熒光強度。對照組顆粒污泥α-D-吡喃葡萄糖多糖外側含量低于內部，而β-D-吡喃葡萄糖多糖則均勻分布在顆粒污泥中。經(jīng)α-淀粉酶水解后，顆粒污泥邊緣處α-D-吡喃葡萄糖多糖含量明顯降低，這與顆粒污泥外緣在顯微鏡下出現(xiàn)透光現(xiàn)象且發(fā)生明顯溶脹現(xiàn)象一致。經(jīng)過β-淀粉酶水解后，顆粒污泥中的β-D-吡喃葡萄糖多糖含量明顯降低，且被水解成碎片狀，這可能是顆粒污泥出現(xiàn)了一些細小的碎片，同時顆粒穩(wěn)定性發(fā)生明顯下降的原因。

圖5 酶解前后的CLSM圖

3 討論

顆粒污泥被認為具有水凝膠的性質[17]，水凝膠可通過氫鍵、疏水性作用和鏈纏結等保持顆粒污泥的穩(wěn)定[23]。多糖是EPS的主要凝膠成分[15]，可以通過氫鍵與Ca2+形成穩(wěn)定的鏈間交聯(lián)和橋接，形成將細胞結合在一起的“蛋盒模型”[16]。此外，多糖是一種兩親性聚合物，可以將疏水性基團插入親水性基團中，并通過這種有序的結構提高顆粒的穩(wěn)定性。因此，采用對Anammox顆粒污泥進行酶解以破壞多糖的結構來探究多糖對Anammox顆粒污泥穩(wěn)定性的影響。

顆粒污泥表面特性及熱力學分析表明，胞外多糖的酶解阻礙了顆粒污泥微生物的聚集，從而影響了顆粒污泥的穩(wěn)定性。疏水性作用對微生物的聚集非常重要[34]，且疏水性越強顆粒污泥越穩(wěn)定[40]。研究中，酶解導致顆粒污泥疏水度和穩(wěn)定性明顯下降，基于XDLVO理論分析進一步表明，酶解提高了污泥聚集的能量勢壘，阻礙了微生物之間的聚集[41]，從而影響了顆粒污泥內部的穩(wěn)定性。因此，多糖可以在疏水性作用下降低微生物聚集的排斥力，促進微生物之間的聚集，從而影響顆粒穩(wěn)定性。

α-淀粉酶處理組顆粒污泥被酶解部分發(fā)生明顯溶脹，β-淀粉酶處理組則出現(xiàn)顆粒污泥破碎且顆粒強度下降的現(xiàn)象，這表明多糖之間的交聯(lián)結合以及鏈結構對維持顆粒穩(wěn)定性也有著重要作用。Caudan等[20]對顆粒污泥進行染色以及淀粉酶水解的研究發(fā)現(xiàn)，多糖會在細菌群落之間交聯(lián)形成水凝膠的屏障，為聚集體提供凝聚力。此外，多糖鏈上豐富的官能團可以提供足夠的結合位點[42]，而其較長的碳主鏈也可以確保細胞間相互作用[22]。α-淀粉酶處理組顆粒污泥外緣被酶解，由于對多糖主鏈以及支鏈的同時破壞，EPS疏水性官能團和羥基含量明顯降低，影響了多糖之間的交聯(lián)結合，從而導致α-淀粉酶水解后污泥外緣發(fā)生明顯溶脹。而β-淀粉酶僅破壞多糖支鏈末端，因此，β-淀粉酶處理組顆粒污泥外觀并無明顯變化，這表明多糖主鏈之間的纏結可以維持顆粒的形態(tài)穩(wěn)定，但顆粒穩(wěn)定性明顯下降，說明多糖支鏈末端的結合位點之間的交聯(lián)也有助于維持顆粒污泥穩(wěn)定。因此，多糖豐富的官能團以及長主鏈可通過交聯(lián)結合以及鏈纏結等作用促進顆粒污泥的穩(wěn)定性。

通過對顆粒污泥胞外多糖的酶解可以了解到多糖性質如何影響聚集體。胞外多糖的疏水性，骨架作用以及形成水凝膠等都會影響微生物的聚集過程，進而影響聚集體的形態(tài)。不同的反應器運行工況往往會影響胞外多糖的性質。Yin等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在氮不足的情況下，AGS的顆粒結構不規(guī)則且疏松，而且胞外多糖的顯著增加被認為是影響顆粒穩(wěn)定性的原因。Liu等[44]研究發(fā)現(xiàn)，更大的剪切力會刺激胞外多糖的產(chǎn)生，并促進造粒。因而可以通過調節(jié)反應器工況以影響胞外多糖的性質，從而影響聚集體形成、形態(tài)以及保持聚集體的穩(wěn)定。

4 結論

對Anammox顆粒污泥進行酶解的結果表明，多糖對顆粒污泥的穩(wěn)定性有著重要作用。經(jīng)α-淀粉酶處理后，顆粒污泥外邊緣出現(xiàn)溶脹，但污泥穩(wěn)定性并無明顯變化，而經(jīng)β-淀粉酶處理后，顆粒污泥表面并無變化，但污泥出現(xiàn)破碎且穩(wěn)定性明顯下降。

對酶解前后污泥表面性質的表征發(fā)現(xiàn)，酶解降低了污泥疏水性，但未改變污泥表面電負性。XDLVO理論的分析表明，Anammox顆粒污泥經(jīng)淀粉酶處理后，污泥微生物聚集的能量勢壘被提高，即多糖可以促進微生物間的聚集從而促進顆粒污泥穩(wěn)定性。FTIR結果表明，經(jīng)淀粉酶水解后，污泥EPS中疏水性官能團和羥基含量明顯降低。共聚焦掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶處理組顆粒污泥外緣α-D-吡喃葡萄糖多糖含量明顯下降，而β-淀粉酶處理組β-D-吡喃葡萄糖多糖則呈碎片狀分布。

α-淀粉酶處理組表明胞外多糖的疏水性作用、通過O—H官能團與陽離子橋接或相互結合作用可以促進微生物之間的聚集。β-淀粉酶處理組表明胞外多糖長主鏈之間的纏結以及支鏈末端豐富的結合位點橋接形成骨架增強了微生物之間的黏附，有利于顆粒污泥的穩(wěn)定。