梁敏

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福州 350001）

0 引言

B族維生素是人體必需的營養(yǎng)元素，自身無法合成，須從外界攝入[1-3]。對(duì)于食物來源相對(duì)單一的嬰幼兒而言，嬰幼兒配方乳粉中維生素含量偏高或偏低均會(huì)對(duì)其生長發(fā)育帶來直接影響。我國對(duì)嬰幼兒配方食品中的維生素添加量均作出了強(qiáng)制性要求[4-5]。因此，對(duì)嬰幼兒配方乳粉中維生素含量進(jìn)行快速準(zhǔn)確的測定，對(duì)嬰幼兒的健康成長具有重要意義。

目前，食品中維生素B1、B2的測定依據(jù)是兩個(gè)獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)[6-7]，前處理均需采用高壓提取后過夜酶解的方式，成本高，且耗時(shí)長，方法重復(fù)性差，不利于高通量樣品的檢測；且市場上獲得的酶，大多本底含有維生素B1，需增加空白試驗(yàn)，前處理及后期計(jì)算均較為繁瑣。故本研究參考標(biāo)準(zhǔn)方法，綜合文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]，對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，通過不斷測試，建立高效液相色譜法同時(shí)測定嬰幼兒配方乳粉中維生素B1、B2，方法快速準(zhǔn)確，重復(fù)性高，實(shí)用性強(qiáng)，適用于奶粉常規(guī)檢測，也可為后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀（配備熒光檢測器），美國Waters公司；Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，月旭科技股份有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；Sartorius BSA 224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；IKA MS 3 basic單發(fā)渦旋振蕩器，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；維生素B1（鹽酸硫胺素，≥99 %），美國Sigma公司；維生素B2（核黃素，≥98%），德國Dr公司；木瓜蛋白酶（酶活≥800 U/g），Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司；高峰淀粉酶（酶活≥3 700 U/g），CNM試劑；正丁醇（分析純）、甲醇（色譜純）、鹽酸（分析純，37%）、無水乙酸鈉（分析純）、鐵氰化鉀（分析純），上海滬試化工有限公司；氫氧化鉀（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；除特殊說明外，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取50 mg維生素B1于50 mL容量瓶中，使用濃度為0.01 mol/L的鹽酸溶液溶解并定容，得質(zhì)量濃度1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于0～4℃冰箱保存；取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度分別為0.02，0.1，0.5，1.0，2.00 μg/mL的維生素B1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取10 mg維生素B2于100 mL棕色容量瓶中，使用濃度0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，沸水浴10 min，取出冷卻至室溫后定容，得0.10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于0～4℃冰箱保存；取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度分別為0.02，0.1，0.5，2.0，2.00 μg/mL的維生素B2系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品處理

稱取5.00 g樣品于100 mL具塞錐形瓶中，使用約60 mL溫水充分溶解樣品，加入1 mL鹽酸溶液（1+1），搖勻，加塞。將錐形瓶置于高壓滅菌鍋內(nèi)，在121℃下保持30 min。水解結(jié)束后待冷卻，加入氫氧化鉀溶液（質(zhì)量濃度150 g/L）約2 mL（調(diào)節(jié)溶液pH值約為5～6），樣品轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容，搖勻，將樣品溶液用濾紙過濾至燒杯，清液備用。

維生素B2測定：取上述清液過0.45 μm濾膜，上機(jī)測試。

維生素B1測定：取上述清液400 μL至2.5 mL離心管，加入200 μL堿性鐵氰化鉀（1.0 g/L），渦旋混勻30 s，準(zhǔn)確加入1.00 mL正丁醇，再次渦旋混勻30 s后，于16 000 r/min下離心1 min，取上層過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測試。另取400 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行同步衍生。

1.2.3 液相色譜條件

流動(dòng)相為濃度0.05 mol/L乙酸鈉：甲醇=65∶35；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為35℃；維生素B1為激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長435 nm；維生素B2為激發(fā)波長462 nm，發(fā)射波長522 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 酶解步驟的去除

國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，食品中維生素B1、B2的測定均需要經(jīng)過高壓水解，而后進(jìn)行酶解（約16 h），耗時(shí)長，且經(jīng)過多次轉(zhuǎn)移，目標(biāo)化合物可能會(huì)出現(xiàn)不必要的損失或降解。乳粉中的維生素基本來自人為添加，部分以游離態(tài)形式存在，只有小部分被糖或蛋白質(zhì)等化合包裹，同時(shí)，由于維生素B2的溶解性較差，因此考慮保留高壓水解過程。經(jīng)過試驗(yàn)表明，高壓水解后樣品中的大分子物質(zhì)即可被破壞，從而釋放出維生素B1和B2。故本研究嘗試省略酶解步驟，并將B1和B2前處理進(jìn)行合并，結(jié)果滿意，極大的降低了耗材成本和時(shí)間成本。

2.1.2 蛋白質(zhì)的沉淀

張隆龍[10]等人做了相似研究，乳粉經(jīng)過高壓后直接進(jìn)行維生素B2的檢測及維生素B1的衍生化。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只經(jīng)過高壓水解后的樣品處于乳濁狀態(tài)，無法得到澄清溶液，對(duì)后期樣品的過濾造成困難，且測定結(jié)果重復(fù)性較差。故本研究采用調(diào)節(jié)溶液pH值的方式使蛋白質(zhì)沉淀。奶粉中主要含乳清蛋白和酪蛋白[12]，等電點(diǎn)在4.6～4.8之間，但由于乳粉基質(zhì)各不相同，添加的金屬離子可使等電點(diǎn)出現(xiàn)不同程度的偏移，故堿的添加量也稍有不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)氫氧化鉀溶液（質(zhì)量濃度150 g/L）添加量為2 mL時(shí)，溶液pH值約為5～6，樣品基本能得到較好的沉淀效果。

2.1.3 維生素B1衍生條件的優(yōu)化

在保證取樣具有代表性的情況下，本研究將待衍生試樣體積減少至400 μL，同比降低后期有毒有機(jī)試劑正丁醇的使用量，同時(shí)，由于衍生試樣的減少，可使樣液與衍生試劑在短時(shí)間內(nèi)充分混勻，加快反應(yīng)效率；選擇使用2.0 mL離心管進(jìn)行衍生反應(yīng)，加入正丁醇提取后可直接進(jìn)行高速離心，有效降低了由多次轉(zhuǎn)移帶來的回收率損失。在該條件下對(duì)衍生劑的濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定衍生劑質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)，樣品衍生效果最佳。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性范圍、檢出限及定量限

將維生素B2系列標(biāo)準(zhǔn)工作液、維生素B1標(biāo)準(zhǔn)衍生液注入色譜儀，以對(duì)應(yīng)得到響應(yīng)值來繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別以3倍和10倍信噪比來進(jìn)行計(jì)算檢出限及定量限。結(jié)果見表1，目標(biāo)化合物在對(duì)應(yīng)濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，檢出限及定量限均低于國家標(biāo)準(zhǔn)，滿足檢測要求。圖1為標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，維生素B1和B2分別在6 min和5 min之內(nèi)出峰，單個(gè)樣品檢測時(shí)長控制在11 min，有利于樣品快速分析，同時(shí)可減少由維生素B1衍生物降解帶來的誤差[13]。

圖1 維生素B1和B2標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

表1 維生素B1和B2的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限及定量限

2.2.2 精密度及回收率

隨機(jī)抽取一份乳粉樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，采用本方法對(duì)樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣分析（n=6），連續(xù)測定3 d，得維生素B1、B2日內(nèi)精密度分別為1.98%、1.23%，日間精密度分別為3.12%、2.87%，表明該方法精密度良好。

取6份不同品牌（A，B，C，D，E，F(xiàn)）的嬰幼兒配方乳粉，各添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，得3個(gè)濃度水平加標(biāo)試樣，按照本方法進(jìn)行分析，每個(gè)添加水平平行測定3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，維生素B1回收率在92.4%～100%之間，維生素B2回收率在93.0%～102%之間，符合檢測要求。

表2 6種嬰幼兒配方乳粉中維生素B1和B2加標(biāo)回收率（n=3） mg/100g

2.3 實(shí)際樣品測定

隨機(jī)抽取20批次不同品牌及段位的奶粉，采用本方法及標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定，每個(gè)樣品平行測定3次，取均值進(jìn)行比較，含量統(tǒng)計(jì)見表3。結(jié)果顯示，部分乳粉中維生素B1、B2測定值高于標(biāo)準(zhǔn)方法，其原因可能為標(biāo)準(zhǔn)方法中酶解時(shí)間過長，目標(biāo)化合物發(fā)生降解，同時(shí)表明該方法測定值更接近真實(shí)值；20批次乳粉測定值與標(biāo)準(zhǔn)方法測定值之間的相對(duì)誤差小于5.77%，表明該方法適用于嬰幼兒配方乳粉中維生素B1及B2的檢測。

表3 不同方法測定20批次乳粉中維生素B1和B2測定結(jié)果比較（n=3） mg/100g

(續(xù)表3)

3 結(jié)論

目前，食品中維生素測定相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的建立大多是針對(duì)單一化合物，而嬰幼兒配方乳粉中一般會(huì)同時(shí)添加多種營養(yǎng)元素，采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定，成本高，效率低。為提高檢測效率，多物質(zhì)的聯(lián)測是該行業(yè)發(fā)展的重要方向之一。對(duì)于多維生素聯(lián)測的研究目前多使用液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)[14-20]，儀器昂貴，對(duì)操作人員要求高，不利于作大規(guī)模推廣；且維生素結(jié)構(gòu)多樣，對(duì)前處理的要求不同，復(fù)雜樣品基質(zhì)的多維生素聯(lián)測，很大程度上只是單純縮短了檢測時(shí)間，難以保證樣品中目標(biāo)化合物的提取效率，實(shí)用性不強(qiáng)；而直接采用高效液相色譜進(jìn)行測定的多聯(lián)測研究，樣品也多集中在保健品、功能性飲料、營養(yǎng)強(qiáng)化劑[21-26]等相對(duì)簡單的基質(zhì)。本研究基于目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)以及樣品基質(zhì)特性，建立高效液相色譜聯(lián)合熒光檢測器測定幼兒配方乳粉中維生素B1、B2的方法。通過大量數(shù)據(jù)表明，該方法快速，準(zhǔn)確，可應(yīng)用于嬰幼兒配方乳粉中維生素B1、B2的常規(guī)檢測，具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義和推廣價(jià)值。